Züchtung eines Mukoviszidose-relevanten polymikrobiellen Biofilms zur Untersuchung von Phänotypen in der Gemeinschaft

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein lungenrelevantes Polymikrobien-Biofilmmodell für Mukoviszidose (CF) mit vier Spezies, mit dem die Auswirkungen bakterieller Wechselwirkungen zwischen den Spezies untersucht werden können.

Zusammenfassung

Den meisten In-vitro-Modellen fehlt die Fähigkeit, bakterielle Phänotypen, die sich aus den komplexen Wechselwirkungen ergeben, die in realen Umgebungen beobachtet werden, vollständig zu untersuchen. Dies gilt insbesondere im Zusammenhang mit schwer zu behandelnden, chronischen und polymikrobiellen Biofilm-basierten Infektionen, die in den Atemwegen von Personen mit Mukoviszidose (CF), einer genetischen Multiorganerkrankung, nachgewiesen werden. Während mehrere Mikrobiomstudien die mikrobiellen Zusammensetzungen definiert haben, die in den Atemwegen von Menschen mit CF (pwCF) nachgewiesen wurden, haben bisher keine In-vitro-Modelle kritische CF-relevante Lungenmerkmale vollständig integriert. Daher besteht eine erhebliche Wissenslücke bei der Untersuchung der Mechanismen, die die Pathogenese von gemischten CF-Lungeninfektionen antreiben. Hier beschreiben wir ein kürzlich entwickeltes mikrobielles Gemeinschaftsmodell mit vier Spezies, darunter Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis und Prevotella melaninogenica , die unter CF-ähnlichen Bedingungen gezüchtet wurden. Durch die Nutzung dieses Systems wurden klinisch relevante Phänotypen wie die antimikrobielle Widerspenstigkeit verschiedener Krankheitserreger beobachtet und auf molekularer Ebene untersucht. Der Nutzen dieses In-vitro-Modells liegt in seinem standardisierten Arbeitsablauf, der die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen den Spezies im Zusammenhang mit chronischen CF-Lungeninfektionen erleichtern kann.

Einleitung

Strategien, die darauf abzielen, krankheitserregende Mikroben auszurotten, wie sie in den Atemwegen der Mukoviszidose (CF), einer genetischen Multiorganerkrankung, nachgewiesen wurden, scheitern oft¹. Das heißt, das Vorhandensein von widerstandsfähigen biofilmartigen mikrobiellen Gemeinschaften, die in der schleimreichen CF-Lungenumgebung wachsen, kann chronische Infektionen verursachen, die sich über mehrere Jahrzehnte erstrecken². Obwohl der Einsatz von antimikrobiellen Mitteln (Abx) und Modulatoren zu verbesserten Ergebnissen bei Patienten mit Mukoviszidose (pwCF) geführt hat, war der klinische Ansatz "ein Bug, eine Infektion", der typischerweise gegen kanonische CF-Erreger wie Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus eingesetzt wird, unwirksam bei der Lösung schwer zu behandelnder Infektionen, die in der Lunge dieser Personen festgestellt wurden ^{3,4. 5,6,7}.

In den letzten zwei Jahrzehnten haben mehrere Studien unser Verständnis der chronischen CF-Lungenerkrankung verändert⁸. Das heißt, Berichte deuten darauf hin, dass Infektionen, die in den Atemwegen von pwCF nachgewiesen werden, nicht nur durch einen einzigen Erreger verursacht werden, sondern von Natur aus polymikrobiell sind⁸. Obwohl die Pathogenese von CF-Lungeninfektionen gemischter Spezies noch wenig verstanden ist, zeigen klinische Beweise, dass pwCF, die sowohl mit S. aureus als auch mit P. aeruginosa in ihren Atemwegen koinfiziert sind, die Lungenfunktion verschlechtert haben als Personen, die von einem dieser beiden Krankheitserreger besiedelt sind⁹.

Es wird angenommen, dass Wechselwirkungen zwischen CF-Erregern ein Grund dafür sind, dass polymikrobielle Biofilm-basierte Infektionen durch den Einsatz von CF-Therapeutika nicht ohne weiteres ausgerottet werden, was sich letztendlich auf die Patientenergebnisse auswirkt³. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass Wechselwirkungen zwischen Mikroben wie P. aeruginosa, S. aureus und anderen klinisch relevante Phänotypen wie die Abx-Reaktionsfähigkeit auf CF-Medikamente der Erstlinien, einschließlich Vancomycin und Tobramycin, beeinflussen können ^6,10,11. Daher steht es noch aus, die derzeitigen Behandlungsstrategien zur Ausrottung von CF-Erregern im Zusammenhang mit Mischinfektionen zu überdenken.

Der Goldstandard bei der Behandlung von mikrobiellen CF-Lungeninfektionen beruht stark auf dem Einsatz von antimikrobiellen Empfindlichkeitstests (AST) als Leitfaden für klinische Interventionen¹². Die AST wird jedoch in der Regel unter Verwendung von bakteriellen Monokulturen durchgeführt, die in reichhaltigen und gut gemischten Kulturen gezüchtet werden, was nicht die mikrobiellen Wachstumsbedingungen widerspiegelt, die in den CF-Atemwegen nachgewiesen wurden ^3,13. Angesichts der signifikanten Diskrepanz zwischen Patientenergebnissen und Behandlungserfolg befürworten klinische Berichte nun die Entwicklung neuartiger Ansätze, die kritische Merkmale der CF-Lunge integrieren^12,14.

Nur wenige Studien haben CF-relevante bakterielle Multispezies-In-vitro-Systeme entwickelt, die mehr als zwei Erreger enthalten ^15,16. Diese Modelle (1) spiegeln jedoch nicht vollständig die polymikrobielle und biofilmartige Natur der CF-Lunge wider und (2) verwenden keine Ernährungs- und Umweltbedingungen, die denen in den CF-Atemwegen entsprechen^15,16. Durch die Auswertung großer von CF-Lungen abgeleiteter 16S rRNA-Gendatensätze und -berechnungen haben Jean-Pierre und Kollegen kürzlich ein In-vitro-Co-Kulturmodell entwickelt, das die oben genannten Merkmale^{integriert 10}. Dieses System umfasst P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. und Prevotella spp., die unter CF-Atemwegs-ähnlichen Bedingungen gezüchtet und bis zu 14 Tage lang stabil sind. Die Autoren berichteten auch über ein gemeinschaftsspezifisches Wachstum von Prevotella spp. und mehrere Veränderungen in der Abx-Reaktionsfähigkeit dieser CF-Erreger durch Mechanismen, die noch identifiziert werden müssen¹⁰. Dieses handhabbare in vitro System bot auch die Möglichkeit, sich mit mechanistisch fokussierten Fragen im Zusammenhang mit der Abx-Widerspenstigkeit einer häufigen Variante von P. aeruginosa zu befassen, die häufig in den Atemwegen von pwCF^{nachgewiesen wurde 10}. Daher ist es das Ziel dieses Protokolls, der CF-Forschungsgemeinschaft einen standardisierten experimentellen Arbeitsablauf zur Verfügung zu stellen, um einen In-vitro-Biofilm zu züchten, der das Potenzial hat, weiter ausgebaut zu werden, um eine Reihe von CF-relevanten Fragen zu beantworten.

Protokoll

Die Details zu allen Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von künstlichem Sputummedium

HINWEIS: In diesem Protokoll wird künstliches Sputummedium (ASM) definiert als das CF-relevante Medium, das von SCFM2 modifiziert wurde und zuvor von Turner und Kollegen^{veröffentlicht wurde 17}. Im Folgenden finden Sie eine Beschreibung der Schritte zur Vorbereitung dieses Mediums. Siehe Materialtabelle zur Herstellung von Stammlösungen und Lagerbedingungen. Diese Version von ASM unterscheidet sich von Turner et al.^,17 dadurch, dass die Pufferkapazität in der Originalversion keinen stabilen pH-Wert über die Zeit zulässt. Das heißt, die Fermentationsaktivität von Streptococcus spp. und Anaerobiern wie Prevotella spp. führt zu einer Versauerung des Wachstumsmediums (unveröffentlichte Beobachtungen). Daher wurde die Konzentration von 3-Morpholinopropan-1-sulfonsäure (MOPS) von 10 mM auf 100 mM angepasst.

HINWEIS: Die Herstellung einer 2x ASM Base (ASMb) Stammlösung erleichtert die Zugabe von Komponenten wie Mucin, Agar, Wasser usw., ohne die Endkonzentration der in ASM^10,18 enthaltenen Moleküle zu beeinflussen. Der 2x ASMb kann vorab zubereitet und bei 4 °C bis zu zwei Wochen dunkel gelagert werden. Wenn das Medium gelb wird, verwerfen.

1. Zur Zubereitung von 2x ASM-Grundstoff in einem sauberen Becherglas mit 400 mL diH₂O unter Rühren folgendes zugeben:
   1. 6,50 mL von 0,2 M NaH₂PO₄ zugeben. H₂O Schaft; 6,25 mL eines 0,2 M Na₂HPO₄ Stammes; 348 μl eines 1 M KNO_3-Stoffes ; 1,084 mL eines 0,25 M K₂SO₄ Stammes.
   2. Fügen Sie 4,0 g synthetisches Hefe-Dropout ohne Tryptophan hinzu; 3,032 g NaCl; 20,92 g MOPS; 1,116 g KCl und 0,124 g NH₄Cl.
   3. Fügen Sie 9,30 mL eines 1 M L-Milchsäurestocks hinzu; 2,70 mL eines 1,1 M Glukosestocks; 1,75 mL eines 1 M CaCl 2,2H ₂O Vorrats; 1,20 mL eines 0,25 MN-Acetylglucosamin-Bestands und 1,00 mL eines 3,6 mM FeSO_4,7H 2 O Stammes.
   4. 660 μl eines 0,1 M Tryptophan-Stammes zugeben; 606 μl eines 1 M MgCl_{2,6H 2}O Stammes; 0,60 g Desoxyribonukleinsäure aus Heringsspermien; 400 μl eines 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)-Stammes von 250 mg/ml.
   5. Sobald alle Komponenten hinzugefügt wurden, stellen Sie den pH-Wert mit einem 5 M NaOH-Stamm auf 6,80 ein. Mit diH₂O auf 500 mL auffüllen. Mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern.
2. Zur Herstellung einer 10 mg/ml (2x) Muzinbrühe verwenden Sie eine saubere Glasflasche mit 250 ml diH₂O und rühren Sie um:
   1. Fügen Sie 5,0 g Muzin aus dem Schweinemagen - Typ II hinzu. Die Suspension 10 min lang mischen. Vollständig auf 500 mL mit diH₂O.
   2. Durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 min sterilisieren. Bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahren.
3. Rekonstituieren Sie die ASM.
   HINWEIS: Dieser Schritt muss am Tag des Experiments durchgeführt werden.
   1. Mischen Sie ein Volumenverhältnis von 1:1 aus dem 2x ASMb-Stamm und dem 10 mg/mL Mucin-Stamm.
   2. Vor Gebrauch gründlich vortexen.

2. Vorbereitung von selektiven Medien für die polymikrobielle Gemeinschaft

HINWEIS: Nachfolgend sind die Mengen aufgeführt, die zur Vorbereitung eines Volumens von 1 l Medium erforderlich sind.

1. Befolgen Sie zur Zubereitung von Mannitol-Salz-Agar (MSA) und Pseudomonas-Isolations-Agar (PIA) die Anweisungen des Herstellers.
2. Um Prevotella Selective Agar (PSA) in einer sauberen Glasflasche zuzubereiten, fügen Sie Folgendes hinzu:
   1. 30,0 g tryptische Sojabrühe (TSB). 15,0 g Agar. 5,00 g Hefeextrakt. 0,50 g L-Cysteinhydrochlorid.
   2. 10,0 mL einer 0,5 mg/ml-Hämin-Brühe. 100 μl eines Menadion-Stammes von 10 mg/ml.
   3. 940 mL diH₂O zugeben und umrühren. Durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 min sterilisieren.
   4. Nach dem Abkühlen (d. h. die Flasche kann mit bloßen Händen gehalten werden) unter Rühren 50,0 ml defribriertes Schafsblut hinzufügen. 2,00 ml einer Kanamycin-Brühe von 50 mg/ml. 150 μl einer 50 mg/ml-Vancomycin-Brühe. 500 μl einer 10 mg/ml-Polymixin-B-Brühe.
3. Zur Zubereitung von Streptococcus Selective Agar (SSA) in einer sauberen Glasflasche fügen Sie Folgendes hinzu:
   1. 30,0 g TSB. 15,0 g Agar.
   2. 950 mL diH₂O zugeben und umrühren. Durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 min sterilisieren.
   3. Nach dem Abkühlen (d. h. die Flasche kann mit bloßen Händen gehalten werden) unter Rühren 50,0 ml defribriertes Schafsblut hinzufügen. 1,00 ml einer 10 mg/ml Polymixin B-Brühe. 1,00 ml eines 10 mg/ml-Oxolinsäurestocks.
      HINWEIS: In Teller einfüllen und maximal 1 Monat bei 4 °C aufbewahren. Lassen Sie die Platten vor der Verwendung bis zu 24 h vorher bei Raumtemperatur trocknen, bevor sie geimpft werden. PSA wurde mit P. melaninogenica und Prevotella intermedia validiert. SSA wurde mit S. sanguinis und der Streptococcus milleri-Gruppe (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius und Streptococcus anginosus, bezeichnet als SMG) validiert. Es wird dringend empfohlen, diese selektiven Medien de novo zu validieren, wenn neue Stämme getestet werden sollen.

3. Vorbereitung und Wachstumsbedingungen für bakterielle flüssige Medien

1. Um routinemäßig P . aeruginosa und S. aureus zu züchten, verwenden Sie ein steriles, reichhaltiges Medium (z. B. Lysogenbrühe (LB) oder TSB).
   1. Beginnen Sie mit der Flüssigkeit über Nacht, indem Sie eine einzelne Kolonie auswählen, die zuvor 20-24 Stunden lang bei 37 °C auf einer LB/TSB-Agarplatte gezüchtet wurde.
   2. Ziehen Sie die Brühenkulturen über Nacht bei 37 °C heran und schütteln Sie sie bei 250 U/min für 16-18 Stunden.
2. Um Streptococcus spp. zu züchten, verwenden Sie sterile Todd Hewitt Bouillon, die mit 0,5 % Hefeextrakt (THB-YE) ergänzt wird.
   1. Starten Sie die Flüssigkultur über Nacht aus einem einzelnen Volk, das zuvor auf einer TSB-Agarplatte, ergänzt mit 5 % defibriertem Schafsblut (Blutagarplatte), für 24 h bei 37 °C + 5 % CO₂ gezüchtet wurde.
   2. Ziehen Sie die THB-YE-Kulturen anaerob oder bei 37 °C + 5% CO₂ über Nacht an, ohne sie 18-22 h lang zu schütteln.
3. Für den Anbau von Prevotella spp. bereiten Sie 1 l Prevotella Wachstumsmedium (PGM) vor, indem Sie Folgendes in eine saubere Flasche geben:
   1. 30,0 g TSB. 5,00 g Hefeextrakt. 0,50 g L-Cysteinhydrochlorid. 10,0 ml eines 0,5 mg/ml-Häminstocks und 100 μl eines 10 mg/ml-Menadionstocks.
   2. 990 mL diH₂O zugeben. Durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 min sterilisieren. Wickeln Sie die Flasche in Alufolie ein, um sie vor Licht zu schützen.
   3. Prevotella spp.-Kolonien werden auf einer Blutagarplatte gezüchtet, die anaerob bei 37 °C für 48 h inkubiert wird.
   4. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie mit PGM und wachsen Sie über Nacht ohne Schütteln bei 37 °C anaerob für 24 Stunden.
      HINWEIS: PGM kann bis zu zwei Wochen bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Es wird dringend empfohlen, vor der Verwendung Sterilitätstests an jedem Wachstumsmedium durchzuführen. Wenn keine anaerobe Kammer verwendet wird, kann es notwendig sein, über Nacht mit Flüssigkeit von Prevotella spp. aus einem Fleck von Kolonien zu beginnen.

4. Vorbereitung des Co-Kultur-Experiments

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt einen zusammengefassten experimentellen Arbeitsablauf. Der Aufbau des Experiments kann unter oxischen Bedingungen erfolgen, wenn die Vorbereitungszeit weniger als 1 h beträgt. Wenn zu erwarten ist, dass es länger dauert, wird dringend empfohlen, den Versuch in einer anaeroben Kammer (mit 10 % CO₂, 10 % H₂ und 80 % N₂ Mischgas) durchzuführen. Anaerobe Gläser können auch zur Inkubation der Versuchsproben verwendet werden.

1. Vorbereitung der Monokulturen und Co-Kulturen
   HINWEIS: Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 10.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur durch. Mischen Sie für die Co-Kulturen die Bakterienproben kurz vor dem Beimpfen der 96-Well-Platten. In der Regel wird ein Volumen von 1 ml für P. aeruginosa - und S. aureus-Stämme aus den Übernachtkulturen entnommen. Bei Streptococcus spp. und Prevotella spp. können die Übernachtvolumina zwischen 2-4 ml variieren. Diese Volumina können je nach Anzahl der zu testenden Bedingungen angepasst werden.
   1. Führen Sie unter Verwendung der Bakterienflüssigkeit aus den Übernachtkulturen die folgenden Schritte durch:
      1. Bei P. aeruginosa - und S. aureus-Stämmen zweimal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
      2. Bei Streptococcus spp. und Prevotella spp. einmal mit sterilem PBS waschen.
         HINWEIS: Verwenden Sie eine Pipette, um Überstände vorsichtig zu entsorgen, da die Pellets leicht verloren gehen können.
      3. Nach den Wäschen resuspendieren Sie jedes Pellet in 1 ml 1x wasserverdünntem ASMb.
      4. Nehmen Sie eine Verdünnung von 1:10 jeder Probe in sterilem PBS vor und messen Sie den OD₆₀₀.
      5. Passen Sie alle Kulturen an einen OD₆₀₀ von 0,2 in ASM an.
      6. Unter Verwendung der Suspensionen OD₆₀₀ = 0,2 werden die Bakterienproben in ASM auf einen endgültigen OD₆₀₀ von 0,01 (für jede Mikrobe) für die Monokulturen und Cokulturen verdünnt.
      7. 5 s lang gründlich vortexen.
         HINWEIS: Um beispielsweise insgesamt 1 ml P . aeruginosa Monokultur-ASM-Suspension bei OD₆₀₀ = 0,01 herzustellen, fügen Sie 50 μl P. aeruginosa bei OD₆₀₀ = 0,2 zu einem Volumen von 950 μl ASM hinzu. Für die Co-Kultur werden je 50 μl der Suspensionen von P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. und Prevotella spp. bei einem OD₆₀₀ = 0,2 entnommen und auf 800 μl ASM gegeben.
      8. Geben Sie mit einer Pipette 100 μl der Monokultur- und Cokultursuspensionen in drei separate Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Kunststoffplatte mit flachem Boden.
      9. Die Platte (ohne Schütteln) 24 Stunden lang bei 37 °C unter anoxischen Bedingungen inkubieren.
         HINWEIS: Hier können auch andere Sauerstoffspannungen (z.B. Mikroxie, Normoxie) verwendet werden. Das Modell wurde jedoch unter anoxischen Bedingungen entwickelt und validiert. Bestätigen Sie die Anfangsinokula durch serielles Verdünnen der Mono- und Co-Kultur-Bakteriensuspensionen und Plattieren auf PIA, MSA, SSA und PSA wird dringend empfohlen. Die angestrebte Ausgangskonzentration für jede Bakterienart beträgt 1 × 10⁷ KBE/ml (P. aeruginosa), 3,5 × 10⁶ KBE/ml (S. aureus), 1,2 × 10⁶ KBE/ml (Streptococcus spp.) und 4,6 × 10⁶ KBE/ml (Prevotella spp.). Bakterielle Inokula kann auch modifiziert werden, wie von Jean-Pierre und Kollegen^{beschrieben 10}.
2. Tauschen Sie das Medium nach der Biofilmbildung aus.
   1. Nach 24 Stunden Inkubation werden die nicht gebundenen (planktonen) Zellen durch Aspiration mit einer Mehrkanalpipette entfernt.
   2. Füllen Sie die vorgeformten Biofilme mit 100 μl frischem ASM oder der gewünschten Behandlung (z. B. Antibiotika, Metaboliten usw.) auf.
   3. Die Platte wird weitere 24 Stunden bei 37 °C unter anoxischen Bedingungen inkubiert.
      HINWEIS: Diese Schritte können aerob durchgeführt werden, wenn sie schnell ausgeführt werden (d. h. weniger als 1 Minute). Andernfalls verwenden Sie bitte eine anaerobe Kammer.

5. Entnahme und Beschichtung der Proben

1. Nach den zusätzlichen 24 Stunden Inkubation aspirieren Sie die nicht gebundenen (planktonen) Zellen mit einer Mehrkanalpipette.
   HINWEIS: Die planktonische Fraktion kann aufbewahrt, seriell verdünnt und auf selektiven Medien plattiert oder verworfen werden.
2. Waschen Sie die Biofilme zweimal vorsichtig mit 125 μl sterilem PBS und entsorgen Sie die Volumina.
3. Fügen Sie 50 μl steriles PBS hinzu und lösen Sie die Biofilme, indem Sie die Zellen mit einem 96-poligen Replikator vorsichtig von der Platte abkratzen.
4. Übertragen Sie die resuspendierten Biofilmzellen in Reihe A einer neuen sterilen 96-Well-Platte.
   HINWEIS: Die 96-Well-Platte enthält steriles PBS in den Reihen B bis H.
5. Führen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung der planktonischen (falls erforderlich) und Biofilmfraktionen durch.
6. Platte 3-5 μl jeder Verdünnungsprobe auf PIA, MSA, SSA und PSA.
7. Lassen Sie die Impfstellen trocknen.

6. Inkubation der selektiven Platten und Zählung der koloniebildenden Einheit (KBE)

1. P. aeruginosa und S. aureus 18-20 h bei 37 °C inkubieren.
2. Streptococcus spp. 24 h lang bei 37 °C unter anoxischen Bedingungen inkubieren.
3. Prevotella spp. 48 h lang bei 37 °C unter anoxischen Bedingungen inkubieren.
4. Zählen Sie nach der Inkubation die Kolonien (~10-35 pro Spot) und berechnen Sie die KBE pro ml.
5. Plotten Sie die Daten mit einem Visualisierungstool.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 2 dargestellt, wurden mehrere Phänotypen berichtet, darunter (1) eine Verringerung der Anzahl lebensfähiger Zellen von P. aeruginosa und S. aureus , wenn sie in gemischten Planktongemeinschaften im Vergleich zu Monokulturen gezüchtet wurden, (2) eine Zunahme des polymikrobiellen Wachstums von S. sanguinis-Zellen und (3) das Wachstum von P. melaninogenica in gemischten Gemeinschaften, wie zuvor von Jean-...

Diskussion

Der Nutzen dieses klinisch informierten In-vitro-Co-Kultursystems liegt in seiner Fähigkeit, polymikrobiell spezifische bakterielle Funktionen zu erkennen. Das heißt, durch die Verwendung dieses Modells haben wir mikrobielle Phänotypen berichtet, die vom gemeinschaftsspezifischen Wachstum von Prevotella spp. (Abbildung 2) bis hin zu Veränderungen in der Anfälligkeit für CF Abx in der Frontlinie von P. aeruginosa, S. aureu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Fisher Scientific	NC0387928	Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)	Sigma	M1254	Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicator	Fisher Scientific	05-450-9	Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lid	Fisher Scientific	62406-081
Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular Jar	Fisher Scientific	23-246-385
CaCl2*2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's blood			To prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma	D7290	Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O	Fisher Scientific	AA1449830	Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaks	Fisher Scientific	B260678
Glucose	Fisher Scientific	D16-3	Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
Hemin	Sigma	51280	Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
Kanamycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KCl	Fisher Scientific	P217-500	Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3	Fisher Scientific	P263-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochloride	Fisher Scientific	AAA1038922
L-Lactic acid	Sigma	L1750	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-Tryptophan	Sigma	T0254	Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt Agar	Fisher Scientific	B11407	Prepare using manufacturer's recommendations.
Menadione	Sigma	M5625	Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O	Fisher Scientific	AA12288A9	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II	Sigma	M2378	Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4	Fisher Scientific	S375-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine	Sigma	A8625	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2O	Fisher Scientific	S369-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOH	Fisher Scientific	S318-500	Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4Cl	Fisher Scientific	A661-500	Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acid			Prepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin B			Prepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation Agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6	Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy Broth	Fisher Scientific	DF0370-17-3	Prepare using manufacturer's recommendations.
Vancomycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast Extract	Fisher Scientific	B11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan	Sigma	Y1876	Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.