Cultiver un biofilm polymicrobien pertinent pour la fibrose kystique afin de sonder les phénotypes des communautés

Résumé

Ce protocole décrit un modèle de biofilm polymicrobien de quatre espèces de fibrose kystique pertinent pour les poumons qui peut être utilisé pour explorer l’impact des interactions bactériennes interespèces.

Résumé

La plupart des modèles in vitro n’ont pas la capacité de sonder pleinement les phénotypes bactériens émergeant des interactions complexes observées dans des environnements réels. Cela est particulièrement vrai dans le contexte des infections chroniques et polymicrobiennes difficiles à traiter détectées dans les voies respiratoires des personnes atteintes de mucoviscidose, une maladie génétique multiviscérale. Bien que de nombreuses études sur le microbiome aient permis de définir les compositions microbiennes détectées dans les voies respiratoires des personnes atteintes de mucoviscidose, aucun modèle in vitro n’a jusqu’à présent pleinement intégré les caractéristiques pulmonaires critiques pertinentes à la mucoviscidose. Par conséquent, il existe une lacune importante dans les connaissances sur la capacité d’étudier les mécanismes à l’origine de la pathogenèse des infections pulmonaires de la mucoviscidose d’espèces mixtes. Ici, nous décrivons un modèle de communauté microbienne de quatre espèces récemment développé, y compris Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis et Prevotella melaninogenica cultivés dans des conditions similaires à celles de la mucoviscidose. Grâce à l’utilisation de ce système, des phénotypes cliniquement pertinents, tels que la récalcitrance antimicrobienne de plusieurs agents pathogènes, ont été observés et explorés au niveau moléculaire. L’utilité de ce modèle in vitro réside dans son flux de travail standardisé qui peut faciliter l’étude des interactions interespèces dans le contexte des infections pulmonaires chroniques de la mucoviscidose.

Introduction

Les stratégies visant à éradiquer les microbes pathogènes tels que ceux détectés dans les voies respiratoires de la fibrose kystique (FK), une maladie génétique multiviscérale, échouent souvent¹. C’est-à-dire que la présence de communautés microbiennes résilientes semblables à un biofilm qui se développent dans l’environnement pulmonaire riche en mucus peut provoquer des infections chroniques s’étendant sur plusieurs décennies². De plus, bien que l’utilisation d’antimicrobiens de première ligne (Abx) et de modulateurs ait entraîné de meilleurs résultats chez les personnes atteintes de FK, l’approche clinique « un insecte, une infection » généralement employée contre les agents pathogènes canoniques de la FK tels que Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus s’est avérée inefficace pour résoudre les infections difficiles à traiter détectées dans les poumons de ces personnes ^{3,4, 5, 6, 7}.

Au cours des deux dernières décennies, de nombreuses études ont changé notre compréhension de la maladie pulmonaire chronique de la mucoviscidose⁸. C’est-à-dire que les rapports indiquent que les infections détectées dans les voies respiratoires des personnes atteintes de fibrose kystique ne sont pas causées uniquement par un seul agent pathogène, mais sont plutôt de nature polymicrobienne⁸. De plus, bien que la pathogenèse des infections pulmonaires mixtes de la mucoviscidose soit encore mal comprise, les preuves cliniques montrent que les personnes atteintes de fibrose kystique qui sont co-infectées par S. aureus et P. aeruginosa dans leurs voies respiratoires ont une fonction pulmonaire plus détériorée que les individus colonisés par l’un ou l’autre de ces deux agents pathogènes⁹.

On suppose que les interactions interespèces entre les agents pathogènes de la mucoviscidose sont l’une des raisons pour lesquelles les infections à base de biofilm polymicrobien ne sont pas facilement éradiquées par l’utilisation de traitements de la mucoviscidose, ce qui finit par avoir un impact sur les résultats pour les patients³. À l’appui de cette affirmation, des études in vitro ont démontré que les interactions entre des microbes tels que P. aeruginosa, S. aureus et d’autres peuvent avoir un impact sur des phénotypes cliniquement pertinents tels que la réactivité d’Abx aux médicaments de première ligne contre la mucoviscidose, y compris la vancomycine et la tobramycine ^6,10,11. Par conséquent, il reste à revoir les stratégies de traitement actuelles visant à éradiquer les agents pathogènes de la mucoviscidose dans le contexte des infections d’espèces mixtes.

L’étalon-or dans la prise en charge des infections pulmonaires microbiennes de la mucoviscidose repose en grande partie sur l’utilisation de tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) pour guider les interventions cliniques¹². Cependant, l’AST est généralement effectuée à l’aide de monocultures bactériennes cultivées dans des cultures riches et bien mélangées, ce qui ne reflète pas les conditions de croissance microbienne détectées dans les voies respiratoires de la mucoviscidose ^3,13. Compte tenu de l’écart important entre les résultats pour les patients et le succès du traitement, les rapports cliniques préconisent maintenant le développement de nouvelles approches intégrant les caractéristiques critiques du poumon de la mucoviscidose^12,14.

Peu d’études ont mis au point des systèmes multi-espèces bactériens pertinents pour la mucoviscidose in vitro contenant plus de deux agents pathogènes^15,16. Cependant, ces modèles (1) ne reflètent pas entièrement la nature polymicrobienne et semblable à un biofilm du poumon de la mucoviscidose et (2) n’utilisent pas de conditions nutritionnelles et environnementales se rapprochant de celles détectées dans les voies respiratoires de la mucoviscidose^15,16. Grâce à l’exploitation de grands ensembles de données et au calcul de grands ensembles de données sur les gènes de l’ARNr 16S dérivés de poumons de la FK, Jean-Pierre et ses collègues ont récemment mis au point un modèle de co-culture in vitro intégrant les caractéristiques mentionnées ci-dessus¹⁰. Ce système comprend P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. et Prevotella spp. cultivés dans des conditions semblables à celles des voies respiratoires de la mucoviscidose et stables jusqu’à 14 jours. Les auteurs ont également signalé une croissance spécifique de Prevotella spp. et plusieurs changements dans la réactivité Abx de ces agents pathogènes de la mucoviscidose par des mécanismes qui restent à identifier¹⁰. Ce système in vitro traitable a également offert la possibilité d’approfondir des questions à focalisation mécanique liées à la récalcitrance Abx d’une variante commune de P. aeruginosa fréquemment détectée dans les voies respiratoires de pwCF¹⁰. Par conséquent, l’objectif de ce protocole est de fournir à la communauté de recherche sur la fibrose kystique un flux de travail expérimental normalisé pour cultiver un biofilm in vitro qui a le potentiel d’être élargi pour s’attaquer à un certain nombre de questions pertinentes pour la fibrose kystique.

Protocole

Les détails de tous les réactifs et équipements sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation d’un milieu d’expectoration artificiel

REMARQUE : Tout au long de ce protocole, le milieu artificiel d’expectoration (ASM) est défini comme le milieu pertinent pour la FC modifié à partir de SCFM2, précédemment publié par Turner et ses collègues¹⁷. Vous trouverez ci-dessous une description des étapes de préparation de ce support. Voir la table des matériaux pour faire des solutions mères et les conditions de stockage. Cette version de l’ASM diffère de celle de Turner et ^al.17 , car le pouvoir tampon de la version originale ne permet pas d’obtenir un pH stable dans le temps. C’est-à-dire que l’activité de fermentation exercée par Streptococcus spp. et les anaérobies comme Prevotella spp. entraîne l’acidification du milieu de croissance (observations non publiées). Par conséquent, la concentration en acide 3-morpholinopropane-1-sulfonique (MOPS) a été ajustée de 10 mM à 100 mM.

REMARQUE : La préparation d’une solution mère 2x ASM base (ASMb) facilite l’ajout de composants tels que la mucine, la gélose, l’eau, etc., sans affecter la concentration finale des molécules présentes dans ASM^10,18. Les 2x ASMb peuvent être préparés à l’avance et conservés à 4 °C jusqu’à deux semaines dans un endroit sombre. Si le milieu jaunit, jetez-le.

1. Pour préparer 2x huile de base ASM, dans un bécher propre contenant 400 mL de diH₂O, ajoutez ce qui suit en remuant :
   1. Ajouter 6,50 mL d’un 0,2 M NaH₂PO₄. H₂O stock ; 6,25 mL d’une crosse de 0,2 M Na₂HPO₄  ; 348 μL d’une crosse KNO₃ de 1 M ; 1,084 mL d’une crosse de 0,25 M K₂SO₄ .
   2. Ajouter 4,0 g de levure synthétique sans tryptophane ; 3,032 g de NaCl ; 20,92 g de MOPS ; 1,116 g de KCl et 0,124 g de NH₄Cl.
   3. Ajouter 9,30 mL d’un bouillon d’acide L-lactique de 1 M ; 2,70 mL d’un stock de glucose de 1,1 M ; 1,75 mL d’une pâte de 1 M CaCl_{2,2H 2}O ; 1,20 mL d’un stock de N-acétylglucosamine de 0,25 M et 1,00 mL d’un stock de FeSO _{4,7H 2}O de 3,6 mM.
   4. Ajouter 660 μL d’une pâte de tryptophane de 0,1 M ; 606 μL d’une crosse de 1 M MgCl_{2.6H 2}O ; 0,60 g d’acide désoxyribonucléique provenant de spermatozoïdes de hareng ; 400 μL d’un stock de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) de 250 mg/mL.
   5. Une fois tous les composants ajoutés, ajustez le pH à 6,80 avec un stock de NaOH de 5 M. Compléter à 500 mL avec du diH₂O. Stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C.
2. Pour préparer un bouillon de mucine de 10 mg/mL (2x), utilisez une bouteille en verre propre contenant 250 mL de_diH2O et en remuant :
   1. Ajouter 5,0 g de mucine de l’estomac porcin - Type II. Mélangez la suspension pendant 10 min. Compléter à 500 mL avec diH₂O.
   2. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Conserver à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
3. Reconstituer l’ASM.
   REMARQUE : Cette étape doit être effectuée le jour de l’expérience.
   1. Mélangez un rapport volumique de 1:1 entre le stock ASMb 2x et le stock de mucine 10 mg/mL.
   2. Agitez soigneusement avant utilisation.

2. Préparation de milieux sélectifs de communautés polymicrobiennes

REMARQUE : Vous trouverez ci-dessous les quantités nécessaires pour préparer un volume de 1 L de support.

1. Pour préparer la gélose au sel de mannitol (MSA) et la gélose d’isolement à Pseudomonas (PIA), suivez les instructions du fabricant.
2. Pour préparer la gélose sélective Prevotella (PSA), dans une bouteille en verre propre, ajoutez ce qui suit :
   1. 30,0 g de bouillon de soja tryptique (TSB). 15,0 g d’agar-agar. 5,00 g d’extrait de levure. 0,50 g de chlorhydrate de L-cystéine.
   2. 10,0 mL d’un stock d’hémine de 0,5 mg/mL. 100 μL d’un stock de ménadione à 10 mg/mL.
   3. Ajouter 940 mL de diH₂O et remuer. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
   4. Une fois refroidi (c’est-à-dire que la bouteille peut être tenue à mains nues), ajoutez en remuant : 50,0 ml de sang de mouton défribriné. 2,00 mL d’un stock de kanamycine à 50 mg/mL. 150 μL d’un stock de vancomycine à 50 mg/mL. 500 μL d’une pâte de polymixine B de 10 mg/mL.
3. Pour préparer la gélose sélective à streptocoques (SSA), dans une bouteille en verre propre, ajoutez ce qui suit :
   1. 30,0 g de TSB. 15,0 g d’agar-agar.
   2. Ajouter 950 mL de diH₂O et remuer. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
   3. Une fois refroidi (c’est-à-dire que la bouteille peut être tenue à mains nues), ajoutez en remuant : 50,0 ml de sang de mouton défribriné. 1,00 mL d’une pâte de polymixine B de 10 mg/mL. 1,00 mL d’un stock d’acide oxolinique de 10 mg/mL.
      REMARQUE : Verser dans des assiettes et conserver à 4 °C pendant un mois maximum. Avant utilisation, laissez sécher les plaques à température ambiante jusqu’à 24 h à l’avance avant de les inoculer. Le PSA a été validé avec P. melaninogenica et Prevotella intermedia. L’ASS a été validée avec S. sanguinis et le groupe des Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius et Streptococcus anginosus, désigné SMG). Il est fortement recommandé de valider de novo ces milieux sélectifs si de nouvelles souches doivent être testées.

3. Préparation des milieux liquides bactériens et conditions de croissance

1. Pour cultiver régulièrement P. aeruginosa et S. aureus, utilisez un milieu riche stérile (p. ex. bouillon de lysogénie ou TSB).
   1. Commencez les nuits de liquide en prélevant une seule colonie préalablement cultivée sur une plaque gélosée LB/TSB pendant 20 à 24 h à 37 °C.
   2. Cultivez les cultures de bouillon à 37 °C pendant la nuit en secouant à 250 tr/min pendant 16 à 18 h.
2. Pour cultiver Streptococcus spp., utilisez du bouillon Todd Hewitt stérile complété par 0,5 % d’extrait de levure (THB-YE).
   1. Commencer la culture liquide pendant la nuit à partir d’une seule colonie préalablement cultivée sur une plaque de gélose TSB complétée par 5 % de sang de mouton défibriné (plaque de gélose au sang) pendant 24 h à 37 °C + 5 % de CO₂.
   2. Cultivez les cultures de THB-YE en anaérobie ou à 37 °C + 5 % CO₂ pendant la nuit sans agiter pendant 18 à 22 h.
3. Pour cultiver Prevotella spp., préparez 1 L de milieu de croissance Prevotella (MGP) en ajoutant les éléments suivants dans une bouteille propre :
   1. 30,0 g de TSB. 5,00 g d’extrait de levure. 0,50 g de chlorhydrate de L-cystéine. 10,0 mL d’un stock d’hémine de 0,5 mg/mL et 100 μL d’un stock de ménadion de 10 mg/mL.
   2. Ajouter 990 mL de diH₂O. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Enveloppez la bouteille dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.
   3. Cultivez les colonies de Prevotella spp. sur une plaque de gélose au sang incubée en anaérobie à 37 °C pendant 48 h.
   4. Inoculer une seule colonie de MGP et cultiver pendant la nuit sans secouer à 37 °C en anaérobie pendant 24 h.
      REMARQUE : Les MGP peuvent être conservés à température ambiante jusqu’à deux semaines. Il est fortement recommandé d’effectuer des tests de stérilité sur chaque milieu de culture avant utilisation. Si vous n’utilisez pas de chambre anaérobie, il peut être nécessaire de commencer des nuits liquides de Prevotella spp. à partir d’une parcelle de colonies.

4. Préparation de l’expérience de co-culture

REMARQUE : La figure 1 représente un résumé du flux de travail expérimental. La mise en place de l’expérience peut se faire dans des conditions oxiques si le temps de préparation est inférieur à 1 h. Si l’on s’attend à ce que cela prenne plus de temps, il est fortement recommandé d’effectuer l’expérience à l’aide d’une chambre anaérobie (avec 10 % de CO₂, 10 % de H₂ et 80 % de gaz mélangé N₂ ). Des bocaux anaérobies peuvent également être utilisés pour incuber les échantillons expérimentaux.

1. Préparation des monocultures et co-cultures
   REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de centrifugation à 10 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Pour les co-cultures, mélangez les échantillons bactériens juste avant d’inoculer les plaques de 96 puits. En règle générale, un volume de 1 mL pour les souches de P. aeruginosa et de S. aureus est prélevé dans les cultures de nuit. Pour Streptococcus spp. et Prevotella spp., les volumes pendant la nuit peuvent varier entre 2 et 4 mL. Ces volumes peuvent être ajustés en fonction du nombre de conditions à tester.
   1. À l’aide du liquide bactérien des cultures de nuit, effectuez les étapes suivantes :
      1. Pour les souches de P. aeruginosa et de S. aureus , laver deux fois avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
      2. Pour Streptococcus spp. et Prevotella spp., laver une fois avec du PBS stérile.
         REMARQUE : Utilisez une pipette pour jeter soigneusement les surnageants, car les granulés peuvent facilement être perdus.
      3. Après les lavages, remettre en suspension chaque granule dans 1 mL d’ASMb dilué dans l’eau.
      4. Faites une dilution de 1:10 de chaque échantillon dans du PBS stérile et mesurez la DO₆₀₀.
      5. Ajustez toutes les cultures à un OD₆₀₀ de 0,2 en ASM.
      6. À l’aide des suspensions DO₆₀₀ = 0,2, diluer dans l’ASM les échantillons bactériens jusqu’à une DO_{finale de 600} de 0,01 (pour chaque microbe) pour les monocultures et les co-cultures.
      7. Vortex à fond pendant 5 s.
         REMARQUE : Par exemple, pour préparer un total de 1 mL de suspension d’ASM en monoculture de P. aeruginosa à₆₀₀ OD = 0,01, ajoutez 50 μL de P. aeruginosa à₆₀₀ OD = 0,2 à un volume de 950 μL d’ASM. Pour la coculture, prélever 50 μL de chaque suspension de P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. et Prevotella spp. à une DO_{de 600} = 0,2 et ajouter à 800 μL d’ASM.
      8. À l’aide d’une pipette, ajouter 100 μl de suspensions de monoculture et de coculture dans trois puits séparés d’une plaque en plastique stérile à fond plat à 96 puits.
      9. Incuber la plaque (sans agiter) pendant 24 h à 37 °C dans des conditions anoxiques.
         REMARQUE : D’autres tensions d’oxygène (par exemple, microxie, normoxie) peuvent également être utilisées ici. Cependant, le modèle a été développé et validé dans des conditions anoxiques. Confirmez l’inoculum de départ en diluant en série les suspensions bactériennes de mono et de co-culture, et le placage sur PIA, MSA, SSA et PSA est fortement recommandé. La concentration initiale visée pour chaque espèce bactérienne est de 1 × 10^{à 7} UFC/mL (P. aeruginosa), de 3,5 × à 10⁶ UFC/mL (S. aureus), de 1,2 × à 10⁶ UFC/mL (Streptococcus spp.) et de 4,6 × 10^{à 6} UFC/mL (Prevotella spp.). L’inoculum bactérien peut également être modifié, comme le décrivent Jean-Pierre et ses collègues¹⁰.
2. Remplacez le média après la formation du biofilm.
   1. Après 24 h d’incubation, prélever les cellules non attachées (planctoniques) par aspiration à l’aide d’une pipette multicanaux.
   2. Réapprovisionnez les biofilms préformés avec 100 μL d’ASM frais ou le traitement souhaité (par exemple, antibiotiques, métabolites, etc.).
   3. Incuber la plaque pendant 24 h supplémentaires à 37 °C dans des conditions anoxiques.
      REMARQUE : Ces étapes peuvent être effectuées en aérobie si elles sont effectuées rapidement (c’est-à-dire moins de 1 min). Sinon, veuillez utiliser une chambre anaérobie.

5. Collecte et placage des échantillons

1. Après les 24 heures supplémentaires d’incubation, aspirez les cellules non attachées (planctoniques) à l’aide d’une pipette multicanaux.
   REMARQUE : La fraction planctonique peut être conservée, diluée en série et plaquée sur des milieux sélectifs ou jetée.
2. Lavez délicatement les biofilms deux fois avec 125 μL de PBS stérile et jetez les volumes.
3. Ajoutez 50 μL de PBS stérile et détachez les biofilms en grattant doucement les cellules de la plaque à l’aide d’un réplicateur à 96 broches.
4. Transférez les cellules de biofilm remises en suspension dans la rangée A d’une nouvelle plaque stérile à 96 puits.
   REMARQUE : La plaque à 96 puits contiendra du PBS stérile dans les rangées B à H.
5. Effectuez une dilution en série de 10x des fractions planctoniques (si nécessaire) et du biofilm.
6. Déposer 3 à 5 μL de chaque échantillon de dilution sur PIA, MSA, SSA et PSA.
7. Laissez sécher les points d’inoculation.

6. Incubation des plaques sélectives et comptage des unités formant colonies (UFC)

1. Pour P. aeruginosa et S. aureus, incuber à 37 °C pendant 18 à 20 h.
2. Pour Streptococcus spp, incuber à 37 °C dans des conditions anoxiques pendant 24 h.
3. Pour Prevotella spp, incuber à 37 °C dans des conditions anoxiques pendant 48 h.
4. Après l’incubation, comptez les colonies (~10-35 par endroit) et calculez l’UFC par ml.
5. Tracez les données à l’aide d’un outil de visualisation.

Résultats

Comme le montre la figure 2, plusieurs phénotypes ont été rapportés, notamment (1) une réduction du nombre de cellules viables de P. aeruginosa et de S. aureus lors de la culture de communautés planctoniques mixtes par rapport à la monoculture, (2) une augmentation de la croissance polymicrobienne des cellules de S. sanguinis et, (3) une croissance des communautés mixtes de P. melaninogenica comme précédemment ra...

Discussion

L’utilité de ce système de co-culture in vitro cliniquement informé réside dans sa capacité à détecter des fonctions bactériennes spécifiques polymicrobiennes. C’est-à-dire que grâce à l’utilisation de ce modèle, nous avons signalé des phénotypes microbiens allant de la croissance spécifique à la communauté de Prevotella spp. (figure 2) à des changements de sensibilité à l’Abx de la FK de première ligne de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Fisher Scientific	NC0387928	Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)	Sigma	M1254	Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicator	Fisher Scientific	05-450-9	Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lid	Fisher Scientific	62406-081
Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular Jar	Fisher Scientific	23-246-385
CaCl2*2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's blood			To prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma	D7290	Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O	Fisher Scientific	AA1449830	Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaks	Fisher Scientific	B260678
Glucose	Fisher Scientific	D16-3	Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
Hemin	Sigma	51280	Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
Kanamycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KCl	Fisher Scientific	P217-500	Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3	Fisher Scientific	P263-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochloride	Fisher Scientific	AAA1038922
L-Lactic acid	Sigma	L1750	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-Tryptophan	Sigma	T0254	Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt Agar	Fisher Scientific	B11407	Prepare using manufacturer's recommendations.
Menadione	Sigma	M5625	Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O	Fisher Scientific	AA12288A9	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II	Sigma	M2378	Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4	Fisher Scientific	S375-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine	Sigma	A8625	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2O	Fisher Scientific	S369-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOH	Fisher Scientific	S318-500	Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4Cl	Fisher Scientific	A661-500	Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acid			Prepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin B			Prepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation Agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6	Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy Broth	Fisher Scientific	DF0370-17-3	Prepare using manufacturer's recommendations.
Vancomycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast Extract	Fisher Scientific	B11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan	Sigma	Y1876	Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.