LPS و ATP الناجم عن موت البلاعم THP-1 المتمايزة PMA والتحقق من صحتها

Summary

يعتمد هذا البروتوكول على الموت الناجم عن LPS و ATP لبلاعم THP-1 المتمايزة PMA. نستخدم قياس التدفق الخلوي لتحليل التلوين المزدوج Annexin V و 7-AAD للكشف عن موت الخلايا ، باستخدام الخلية بأكملها واستخدام المجهر الإلكتروني الماسح لمراقبة مورفولوجيا غشاء الخلية.

Abstract

موت الخلايا هو عملية أساسية في جميع الكائنات الحية. ينشئ البروتوكول عديد السكاريد الشحمي (LPS) والأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) الناجم عن ترسب الدهون المتمايز فوربول -12-ميريستات -13-أسيتات (PMA) في نموذج البلاعم البشرية (THP-1) لمراقبة موت الخلايا. LPS جنبا إلى جنب مع ATP هي طريقة تحريض التهابية كلاسيكية ، وغالبا ما تستخدم لدراسة pyroptosis ، ولكن موت الخلايا المبرمج و necroptosis تستجيب أيضا للتحفيز بواسطة LPS / ATP. في ظل الظروف العادية ، يتم توطين فوسفاتيديل سيرين فقط في النشرة الداخلية لغشاء البلازما. ومع ذلك ، في المراحل المبكرة من pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، و necroptosis ، يظل غشاء الخلية سليما ويتعرض للفوسفاتيديل سيرين ، وفي المراحل اللاحقة ، يفقد غشاء الخلية سلامته. هنا ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل تلطيخ Annexin V و 7-Aminoactinomycin D (AAD) للكشف عن موت الخلايا من الخلايا بأكملها. تظهر النتائج أن الخلايا الكبيرة ماتت بعد التحفيز باستخدام LPS / ATP. باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ، نلاحظ الأشكال المحتملة لموت الخلايا في الخلايا الفردية. تشير النتائج إلى أن الخلايا قد تخضع لداء البروبتيس أو موت الخلايا المبرمج أو التنخر بعد التحفيز باستخدام LPS / ATP. يركز هذا البروتوكول على مراقبة موت الضامة بعد التحفيز باستخدام LPS / ATP. أظهرت النتائج أن موت الخلايا بعد تحفيز LPS و ATP لا يقتصر على pyroptosis وأن موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا المبرمج الناخر يمكن أن يحدث أيضا ، مما يساعد الباحثين على فهم موت الخلايا بشكل أفضل بعد تحفيز LPS و ATP واختيار طريقة تجريبية أفضل.

Introduction

موت الخلايا هو عملية فسيولوجية أساسية في جميع الكائنات الحية. في السنوات الأخيرة ، أظهرت دراسات جوهرية أن موت الخلايا يشارك في المناعة والتوازن داخل الكائن الحي. تساعدنا دراسة موت الخلايا على فهم ظهور الأمراض وتطورها بشكل أفضل. تم وصف عدة أشكال من موت الخلايا المبرمج ، وتم تحديد بعض الأهداف الرئيسية في هذه العمليات. Pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، و necroptosis هي مسارات موت الخلايا الثلاثة المبرمجة المحددة وراثيا والتي تشارك في التوازن الداخلي والمرض¹.

يتميز Pyroptosis بتكوين مسام الغشاء وإطلاق محتويات الخلية. تشق الكاسباز أو الجرانزيمات المنشطة gasdermins لفصل مجالاتها الطرفية N ، والتي تقوم بعد ذلك بتكوين oligo....

Protocol

1. خط الخلية وثقافة الخلية

1. ينمو خط الخلايا البشرية وحيدة الخلية THP-1 في وسط زراعة كامل RPMI-1640 مع مصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 0.05 مللي متر β-ميركابتوإيثانول. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ هواء مرطب. خلايا الثقافة الفرعية كل 2-3 أيام.
   ملاحظة: THP-1 عبارة عن خلية تعليق ، حدد لتغيير نصف الوسط للزراعة الفرعية. عند مراقبة العديد من شظايا الخلايا تحت المجهر الضوئي ، يتم استخدام أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة الخلايا الكاملة الطازجة التي تم تسخينها مسبقا.
2. استخدم الخلايا (في المقاطع 4-10) في مرحلة النمو اللوغاريتمي ....

النتائج

تمت معالجة عينات الخلايا كما هو موضح في البروتوكول وتم الكشف عن التدفق الخلوي. لا يمكن تلطيخ الخلايا الطبيعية بالملحق الخامس و 7-AAD (الملحق V- / 7-AAD-). في المراحل المبكرة من داء البروبتيس ، موت الخلايا المبرمج ، والتنخر ، تعرض PS وارتبط بالملحق الخامس ، لكن غشاء الخلية كان لا يزال سليما واستبعد 7-.......

Discussion

في هذه المخطوطة ، تم استخدام طريقتين للكشف عن LPS والموت الناجم عن ATP لبلاعم THP-1 المتمايزة PMA. تم استخدام التلوين المزدوج الملحق V / 7-AAD ، وتم تحليل النتائج بواسطة قياس التدفق الخلوي من التلوين الكلي. كما هو الحال مع تحليل التدفق الخلوي الآخر ، تم إنشاء مجموعة من الخلايا غير الملوثة ومجموعتين م?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1