PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증

요약

이 프로토콜은 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸을 기반으로 합니다. 당사는 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-AAD 이중 염색을 분석하여 세포 사멸을 검출하며, 전체 세포를 사용하고 주사 전자 현미경을 사용하여 세포막 형태를 관찰합니다.

초록

세포 사멸은 모든 살아있는 유기체의 근본적인 과정입니다. 이 프로토콜은 세포 사멸을 관찰하기 위해 인간 단핵구(THP-1) 대식세포 모델에서 지질다당류(LPS) 및 아데노신 삼인산(ATP) 유도 phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) 분화 지질 침착을 확립합니다. LPS와 ATP가 결합된 LPS는 전형적인 염증 유도 방법으로, 발톱증을 연구하는 데 자주 사용되지만, 세포사멸과 괴사도 LPS/ATP에 의한 자극에 반응합니다. 정상적인 상황에서, 포스파티딜세린은 원형질막의 안쪽 leaflet에서만 국한됩니다. 그러나 pyroptosis, apoptosis, necroptosis의 초기 단계에서는 세포막이 온전한 상태로 포스파티딜세린에 노출되고 후기 단계에서는 세포막이 무결성을 잃게 됩니다. 여기에서 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-Aminoactinomycin D(AAD) 이중 염색을 분석하여 전체 세포에서 세포 사멸을 검출했습니다. 그 결과, LPS/ATP로 자극을 받은 후 상당한 세포가 죽었다는 것을 알 수 있었다. 주사 전자 현미경을 사용하여 개별 세포에서 가능한 세포 사멸 형태를 관찰합니다. 결과는 세포가 LPS/ATP로 자극된 후 발열증, 세포사멸사 또는 괴사(necroptosis)를 겪을 수 있음을 나타냅니다. 이 프로토콜은 LPS/ATP로 자극한 후 대식세포의 사멸을 관찰하는 데 중점을 둡니다. 그 결과, LPS 및 ATP 자극 후 세포 사멸이 파이롭토시스에 국한되지 않고 세포사멸 및 괴사멸도 발생할 수 있음을 보여주었으며, 이는 연구자들이 LPS 및 ATP 자극 후 세포 사멸을 더 잘 이해하고 더 나은 실험 방법을 선택하는 데 도움이 되었습니다.

서문

세포 사멸은 모든 살아있는 유기체에서 기본적인 생리학적 과정입니다. 최근 몇 년 동안 상당한 연구에 따르면 세포 사멸이 유기체 내의 면역과 균형에 관여합니다. 세포 사멸을 연구하면 질병의 발병과 발병을 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다. 프로그램된 세포 사멸의 여러 형태가 설명되었으며, 이러한 과정에서 일부 주요 표적이 확인되었습니다. Pyroptosis, apoptosis, necroptosis는 내부 균형 및 질병에 관여하는 유전적으로 정의된 세 가지 프로그램된 세포 사멸 경로입니다¹.

Pyroptosis는 막 구멍의 형성과 세포 내용물의 방출을 특징으로합니다. 활성화된 카스파제 또는 그랜자임은 가스더민을 절단하여 N-말단 도메인을 분리한 다음 올리고머화되어 멤브레인에 결합하고 기공 ^2,3,4를 형성합니다. gasdermin pore는 세포막을 가로지르는 비정형 분비 채널을 제공하여 함량 방출 및 이온 유입 ^2,3,4<....

프로토콜

1. 세포주와 세포배양

1. 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.05mM β-메르캅토에탄올을 함유한 RPMI-1640 완전 배양 배지에서 인간 단핵구 세포주 THP-1을 성장시킵니다. 37°C에서 5%_CO2 가습 공기에서 세포를 배양합니다. 2-3일마다 하위 배양 세포.
   참고: THP-1은 부유 세포이므로 하위 배양을 위해 배지의 절반을 변경하려면 선택합니다. 광학 현미경으로 많은 세포 단편을 관찰할 때는 실온에서 300 x g 으로 3분 동안 원심분리합니다. 미리 따뜻해진 신선한 완전한 세포 배양 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
2. 모든 실험에 대해 로그 성장 단계에서 세포(단락 4-10)를 사용합니다. 세포의 상태가 양호하고 대수적 성장 단계에 있을 때, 세포는 둥글고 밝고 조밀하며 100 x의 광학 현미경에서 덩어리와 세포 조각이 없습니다.

2. THP-1 세포의 분화

1. 1mM 농도의 PMA 원액을 준비합니다(PMA 1mg을 디메틸 설폭사이드 1.62mL에 용해). PMA 원액을 완전한 세포 배양 배지로 희석하여 최종 작업 농도 100nM로 합니다.
<....

토론

이 원고에서는 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS와 ATP 유도 사멸을 감지하기 위해 두 가지 방법을 사용했습니다. Annexin V/7-AAD 이중 염색을 사용하였으며, 전체 염색으로부터 유세포 분석으로 결과를 분석하였다. 다른 유세포 분석과 마찬가지로, 염색되지 않은 세포 그룹과 단일 염색된 세포 두 그룹을 설정하여 위양성 및 위음성 결과를 제외했습니다. 그 결과, LPS/ATP 자극 후 여러 세포가 막 무결성을 잃?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1