LPS e morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e sua validazione

Riepilogo

Questo protocollo si basa sulla LPS e sulla morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. Utilizziamo la citometria a flusso per analizzare l'annessina V e la doppia colorazione 7-AAD per rilevare la morte cellulare, utilizzando l'intera cellula e impiegando la microscopia elettronica a scansione per osservare la morfologia della membrana cellulare.

Abstract

La morte cellulare è un processo fondamentale in tutti gli organismi viventi. Il protocollo stabilisce una deposizione lipidica differenziata da lipopolisaccaride (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) indotta da forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) in un modello di macrofagi monociti umani (THP-1) per osservare la morte cellulare. L'LPS combinato con l'ATP è un classico metodo di induzione infiammatoria, spesso utilizzato per studiare la piroptosi, ma anche l'apoptosi e la necroptosi rispondono alla stimolazione da parte di LPS/ATP. In circostanze normali, la fosfatidilserina è localizzata solo nel lembo interno della membrana plasmatica. Tuttavia, nelle prime fasi della piroptosi, dell'apoptosi e della necroptosi, la membrana cellulare rimane intatta ed esposta alla fosfatidilserina e, nelle fasi successive, la membrana cellulare perde la sua integrità. Qui, la citometria a flusso è stata utilizzata per analizzare la doppia colorazione dell'annessina V e della 7-amminoattinomicina D (AAD) per rilevare la morte cellulare da intere cellule. I risultati mostrano che le cellule sostanziali sono morte dopo la stimolazione con LPS/ATP. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, osserviamo le possibili forme di morte cellulare nelle singole cellule. I risultati indicano che le cellule possono andare incontro a piroptosi, apoptosi o necroptosi dopo la stimolazione con LPS/ATP. Questo protocollo si concentra sull'osservazione della morte dei macrofagi dopo la stimolazione con LPS/ATP. I risultati hanno mostrato che la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP non si limita alla piroptosi e che possono verificarsi anche apoptosi e apoptosi necrotica, aiutando i ricercatori a comprendere meglio la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP e a scegliere un metodo sperimentale migliore.

Introduzione

La morte cellulare è un processo fisiologico fondamentale in tutti gli organismi viventi. Negli ultimi anni, studi sostanziali hanno dimostrato che la morte cellulare è coinvolta nell'immunità e nell'equilibrio all'interno dell'organismo. Studiare la morte cellulare ci aiuta a comprendere meglio l'insorgenza e lo sviluppo delle malattie. Sono state descritte diverse forme di morte cellulare programmata e sono stati identificati alcuni bersagli chiave in questi processi. La piroptosi, l'apoptosi e la necroptosi sono le tre vie di morte cellulare programmata geneticamente definite coinvolte nell'equilibrio interno e nella malattia¹.

La piroptosi è caratterizzata dalla formazione di pori di membrana e dal rilascio di contenuto cellulare. Le caspasi attivate o granzimi scindono le gasdermine per separare i loro domini N-terminali, che poi oligomerizzano, si legano alla membrana e formano pori ^2,3,4. Il poro di gasdermin fornisce un canale di secrezione atipico attraverso le membrane cellulari, con conseguente risposta cellulare a valle, tra cui il rilascio di contenuto e l'afflusso di ioni ^2,3,4. Alla fine, le cellule alla fine subiscono la rottura della membrana plasmatica e la lisi piptotica facilitata dalla ninferina-1⁵. Nell'apoptosi, Bax e Bak attivati formano oligomeri sulla membrana esterna mitocondriale e rilasciano citocromo C, che è regolato da un equilibrio tra proteine proapoptotiche e antiapoptotiche della famiglia BCL-2, caspasi iniziatrici (caspasi-8, -9 e -10) e caspasi effettrici (caspasi-3, -6 e -7)^1,6,7. I cambiamenti morfologici dell'apoptosi includono il blebbing della membrana, il restringimento cellulare, la frammentazione nucleare, la condensazione della cromatina e la formazione di corpi apoptotici ^6,8. La serina/treonina-proteina chinasi 1 (RIPK3) che interagisce con il recettore e il dominio chinasi a linea mista (MLKL) sono due componenti fondamentali a valle del meccanismo necroptotico¹. RIPK3 recluta e fosforila MLKL, p-MLKL oligomerizza, si associa con la membrana cellulare, avvia perforazioni di membrana, provoca afflusso di ioni, aumenta l'osmolarità intracellulare e infine la rottura cellulare ^6,9. Gasdermins e MLKL si legano alla membrana plasmatica e mediano rispettivamente la piroptosi e la necroptosi, mentre BAX/BAK media l'apoptosi legandosi alla membrana esterna dei mitocondri⁶.

Sebbene ogni percorso abbia meccanismi ed esiti specifici, portano a cambiamenti simili sulla membrana cellulare. In circostanze normali, la fosfatidilserina (PS) è localizzata solo nel lembo interno della membrana plasmatica. Tuttavia, nelle prime fasi della piroptosi, dell'apoptosi e della necroptosi, il PS sarà esposto, al di fuori della membrana plasmatica. La caspasi-3/caspasi-7 attiva le famiglie TMEM16 e XKR, che porta a una membrana cellulare asimmetrica ed esternalizza il PS durante l'apoptosi¹⁰. L'afflusso di Ca²⁺ mediato da Gasdermin D e MLKL porta alla perdita della simmetria del doppio strato fosfolipidico sulla membrana cellulare e all'esposizione di PS. L'esposizione avviene prima della perdita dell'integrità della membrana cellulare^11,12. Sulla base dei cambiamenti simili nella membrana di questi tre tipi di morte cellulare programmata, utilizziamo la citometria a flusso per analizzare la doppia colorazione dell'annessina V/7-amminoactinomicina D (7-AAD) per rilevare la morte cellulare. L'annessina V, una proteina legante i fosfolipidi calcio-dipendente, ha un'elevata affinità per la PS, che può fungere da sonda sensibile per rilevare la PS esposta sulla superficie della membrana plasmatica¹³. Il 7-AAD è una colorazione di acido nucleico che non può passare attraverso l'intera membrana cellulare. È simile allo ioduro di propidio (PI), un colorante di acidi nucleici comunemente usato. Hanno caratteristiche di fluorescenza simili, ma 7-AAD ha uno spettro di emissione più ristretto e meno interferenze con altri canali di rivelazione. A causa di queste somiglianze, non è sufficiente distinguere tra piroptosi, apoptosi e necroptosi. Abbiamo usato la citometria a flusso per rilevare la morte cellulare da cellule intere. Un secondo metodo viene utilizzato per catturare la membrana cellulare utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) per osservare le possibili forme di morte cellulare nelle singole cellule.

Abbiamo stabilito un modello di deposizione lipidica differenziata da lipopolisaccaride (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) indotta da forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) in un modello di macrofagi monociti umani (THP-1) per osservare la morte cellulare. Questo protocollo si concentra sull'osservazione della morte cellulare piuttosto che sullo studio dei meccanismi.

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Protocollo

1. Linea cellulare e coltura cellulare

1. Coltivare la linea cellulare monocitica umana THP-1 in un terreno di coltura completo RPMI-1640 con il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina-streptomicina e 0,05 mM di β-mercaptoetanolo. Coltivare le cellule a 37 °C in aria umidificata al 5% di CO₂ . Sottocoltura delle cellule ogni 2-3 giorni.
   NOTA: THP-1 è una cella di sospensione, selezionare per cambiare metà del mezzo per la sub-coltura. Quando si osservano molti frammenti cellulari al microscopio ottico, centrifugare a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule nel terreno di coltura cellulare completo fresco preriscaldato.
2. Utilizzare le cellule (nei passaggi 4-10) nella fase di crescita logaritmica per tutti gli esperimenti. Quando le cellule sono in buone condizioni e in fase di crescita logaritmica, sono rotonde, luminose, dense e senza grumi e frammenti cellulari al microscopio ottico a 100 x.

2. Differenziamento delle cellule THP-1

1. Preparare una soluzione madre di PMA con una concentrazione di 1 mM (sciogliere 1 mg di PMA in 1,62 mL di dimetilsolfossido). Diluire la soluzione madre di PMA con un terreno di coltura cellulare completo fino a una concentrazione finale di 100 nM.
2. Raccogliere le cellule nella piastra di coltura in una provetta da centrifuga sterile da 10 mL. Centrifugare a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente, risospendere le cellule con 3 mL di terreno di coltura completo contenente PMA.
3. Aprire il contatore di celle e il software di conteggio. Pipettare 20 μL di sospensione cellulare nella scheda contacellule e inserirla nella scheda contacellule. Fare clic su Anteprima B1, ruotare la manopola in basso a destra dello strumento e regolare la distanza focale per rendere le celle con un centro luminoso con contorni chiari sul software. Fare clic su Conteggio per avviare il conteggio.
4. Sulla base dei risultati del conteggio, utilizzare un terreno di coltura completo contenente PMA per regolare la densità cellulare a 1 x 10⁶ cellule/mL. Seminare le cellule in una piastra a 6 pozzetti, incubare la piastra per 24 ore a 37 °C e 5% di CO₂ prima di iniziare un ulteriore trattamento.

3. Trattamento delle cellule THP-1

1. Preparare una soluzione madre di LPS con una concentrazione di 1 mg/mL (sciogliere 1 mg di LPS in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)). Diluire la soluzione madre di LPS con terreno privo di siero fino a una concentrazione di lavoro finale di 1 μg/mL. Preparare una soluzione madre di Na₂ATP con una concentrazione di 500 mM (sciogliere 0,3026 g di ATP in 1 mL di PBS).
2. Aspirare il terreno contenente PMA dai pozzetti e lavare con PBS 1x. Aggiungere il terreno senza siero al gruppo di controllo e il terreno senza siero contenente LPS al gruppo di modelli. Incubare la piastra per 6 ore a 37 °C + 5% CO₂ prima di procedere con ulteriori trattamenti.
3. Dopo 6 ore, aggiungere la soluzione madre di ATP al gruppo modello fino a una concentrazione di lavoro finale di 500 nM. Incubare la piastra per 45 minuti a 37 °C + 5% CO₂ prima di procedere.

4. Analisi di citometria a flusso (Metodo 1)

1. Preparazione di campioni sperimentali
   1. Seminare e incubare le cellule in piastre a 6 pozzetti secondo la fase 2. Stabilire quattro gruppi di controllo senza trattamento: un controllo senza macchie, due controlli a colorazione singola (uno per ogni colorazione) e un controllo a doppia colorazione. Stabilire un gruppo di trattamento e trattare secondo il passaggio 3.
   2. Dopo il trattamento, aspirare tutto il surnatante dai pozzetti e lavare con PBS 2x. Aggiungere 500 μl di tripsina allo 0,05% (non EDTA) a ciascun pozzetto e incubare nell'incubatore per 30 s.
   3. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura completo RPMI-1640 a ciascun pozzetto per evitare il distacco delle cellule e raccogliere le cellule nella provetta da 5 mL. Centrifugare a 300 x g per 3 min a temperatura ambiente.
   4. Aggiungere 1 mL di PBS per risospendere le cellule. Mettere le provette con le cellule a bagnomaria a 37 °C per 3 minuti. Centrifugare tutti i campioni a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
   5. Diluire 200 μl di tampone legante 5x con 800 μl di acqua distillata in 1x tampone legante. Aggiungere 100 μl di tampone legante 1x per risospendere le cellule e trasferire le cellule nella provetta da 5 mL.
   6. Aggiungere 5 μL di soluzione di Annessina V-PE a una provetta di cellule del gruppo di controllo per 10 minuti e 5 μL di soluzione 7-AAD a un'altra provetta di cellule del gruppo di controllo per 5 minuti (come controlli a colorazione singola separatamente). Agitare delicatamente ogni provetta per mescolare, colorare e incubare i campioni a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Aggiungere 400 μl di PBS a ciascuna provetta e agitare delicatamente per terminare l'incubazione.
   7. Aggiungere 5 μL di soluzione di Annessina V-PE alle provette rimanenti e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Agitare delicatamente ogni provetta per mescolare, colorare e incubare i campioni a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Dopo 5 minuti, aggiungere 5 μL di soluzione di 7-AAD per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 400 μl di PBS a ciascuna provetta e agitare delicatamente per terminare l'incubazione.
   8. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando una rete di nylon da 35 μm che fa parte dei tubi a fondo tondo in polistirene da 5 mL. Posizionare il tubo sul ghiaccio e attendere il test. Mescolare delicatamente prima di eseguire il test e quindi inserirlo nello strumento.
2. Citometria a flusso
   1. Utilizzare un citometro a flusso di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza per il test. Aprire il software di analisi dei dati del citometro a flusso e confermare le prestazioni del rivelatore e del laser. Fare clic sul citometro e scegliere Avvio fluidics, attendere che il sistema sia pronto. Escludere le bolle della camera di flusso facendo clic su Citometro > Modalità di pulizia > Cella di flusso Degassosa.
   2. Fare clic su Esperimento, selezionare in sequenza Nuova cartella, Esperimento, Campione, Tubo e Modifica nome. Una freccia di forma pentagonale davanti al tubo, diventa verde quando si accende.
   3. Fare clic sull'icona del citometro FACSCelesta (un'icona con un tasto di scelta rapida), selezionare Parametro, quindi selezionare FSC, SSC e segnale PE . Fare clic sull'icona del foglio di lavoro globale (un'icona del tasto di scelta rapida) per stabilire l'istogramma PE. Per il citometro a flusso utilizzato in questo studio, utilizzare PE per l'annessina V a 586 nm e tracciare sull'asse X; PerCP-Cy5.5 per 7-AAD a 700 nm e grafico sull'asse Y.
   4. Inserire prima il campione di controllo non colorato nello strumento. Fare clic sull'icona di Acquisition Dashboard (un'icona di scelta rapida), acquisire un minimo di 10.000 eventi dalla popolazione desiderata. Escludere i detriti utilizzando un punto di iniezione (P1) su un diagramma a punti FSC-A e SSC-A. Regola la portata alla velocità media e registra i dati. Regolare la tensione per posizionare la popolazione cellulare sulla diagonale dell'istogramma FSC/SSC e fare clic su Riavvia. Regola la portata alla velocità media e registra i dati.
   5. Fare clic su Tubo successivo, eseguire i controlli di colorazione singola dell'annessina V e del 7-AAD per regolare la compensazione. Esegui le provette rimanenti e raccogli i dati.

5. Imaging SEM (Metodo 2)

1. Preparazione di campioni sperimentali
   1. Seminare e incubare le cellule in piastre a 6 pozzetti secondo la fase 2 e trattare secondo la fase 3.
   2. Dopo il trattamento, aspirare tutto il surnatante dai pozzetti e lavare 2 volte con PBS. Aggiungere 500 μl di tripsina allo 0,05% (non EDTA) a ciascun pozzetto e incubare nell'incubatore per 30 s.
   3. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura completo RPMI-1640 a ciascun pozzetto per evitare il distacco delle cellule e raccogliere le cellule nella provetta da 5 mL. Centrifugare a 300 x g per 3 min a temperatura ambiente.
   4. Fissare le cellule con 500 μL di fissativo per microscopio elettronico (dialdeide glutarica al 2,5%, sali di fosforo 100 mM) per 2 ore a temperatura ambiente, seguite da una notte a 4 °C.
   5. Preparare la soluzione di allume di cromo: aggiungere 1,0 g di gelatina a 100 ml di acqua ultrapura, riscaldamento a bagnomaria a 70 °C e mescolare uniformemente. Aggiungere 0,05 g di allume di cromo, mescolare uniformemente e filtrare con carta da filtro. Immergere il vetro di copertura pulito in una soluzione di allume di cromo per 2 ore a 37 °C e asciugarlo in forno a 37 °C per un uso successivo.
      NOTA: Lo scopo è quello di prevenire il distacco delle cellule durante l'esperimento.
   6. Raccogliere le cellule dalla soluzione fissa. Centrifugare a 300 x g per 3 min a temperatura ambiente. Aggiungere 100 μl di PBS e soffiare via delicatamente le cellule. Lasciare cadere la sospensione della cella sul vetro di copertura, lasciare riposare per 5 minuti. Aspirare tutto il surnatante e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta.
      NOTA: L'operazione deve essere eseguita delicatamente per evitare il distacco delle celle. Non agitare energicamente, muoverti lentamente e aggiungere lentamente il liquido lungo il muro.
   7. Aggiungere 500 μl di fissazione dell'acido osmico all'1% per 1 ora. Aspirare tutto il surnatante e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta.
   8. Disidratare i campioni in successione in una serie di concentrazioni di etanolo (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) per 15 minuti per soluzione di EtOH.
      NOTA: I bicchieri copri possono essere conservati in 100% EtOH per diversi giorni a 4 °C ma devono asciugarsi il prima possibile per evitare un'eccessiva disidratazione.
   9. Accendere l'essiccatore a punto critico, aprire il serbatoio di CO₂ e raffreddare la camera a 10 °C. Avvolgere rapidamente il campione con carta da filtro quando la pressione della camera è 0 psi e inserirlo nella camera.
   10. Aprire la valvola di ingresso, osservare attraverso la finestra di osservazione CO₂ , aumentare il livello di CO₂ del liquido tra le due linee rosse (non superare il limite superiore), chiudere la valvola di ingresso. Immergere il campione per 10 minuti. Aprire contemporaneamente le valvole di aspirazione e di scarico per equalizzare la CO₂ per 1 min (la CO₂ liquida sostituisce l'EtOH). Chiudere la valvola di scarico per aumentare il livello di CO₂ del liquido nella posizione specificata, chiudere la valvola di aspirazione.
   11. Impostare la temperatura a 35 °C e la pressione a 1250 psi. Una volta che la temperatura e la pressione si sono stabilizzate, depressurizzare a 100 psi/min. Estrarre il campione quando la pressione della camera è zero e spegnere lo strumento.
   12. Montare i campioni su portacampioni in alluminio SEM utilizzando nastro conduttivo. Utilizzare un rivestimento sputter per coprire i campioni con uno strato (2-5 nm) di oro.
2. Imaging
   1. Utilizzare il SEM ad emissione di campo freddo ad alta risoluzione per l'imaging. Impostare la tensione di accelerazione del SEM a 3 kV. Impostare la distanza di lavoro su 10 mm. Impostare l'ingrandimento su 1.000x per osservare il panorama. Impostare l'ingrandimento su 5.000x e 20.000x per individuare la membrana plasmatica e visualizzare il campione.
      NOTA: Il processo di visualizzazione dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA tramite SEM è simile ad altri tipi di cellule e tessuti e dipende dagli strumenti utilizzati. La referenza¹⁴ fornisce un protocollo SEM dettagliato con video di accompagnamento.

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Risultati

I campioni di cellule sono stati trattati come descritto nel protocollo ed è stato effettuato il rilevamento con citometria a flusso. Le cellule normali non possono essere colorate con l'annessina V e il 7-AAD (annessina V-/7-AAD-). Nelle prime fasi della piroptosi, dell'apoptosi e della necroptosi, il PS era esposto e legato all'annessina V, ma la membrana cellulare era ancora intatta ed escludeva il 7-AAD dallo spazio extracellulare (annessina V+/7-AAD-). Nelle fasi successive, la membrana cellulare perde la sua integ...

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Discussione

In questo manoscritto, sono stati utilizzati due metodi per rilevare LPS e la morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. È stata utilizzata la doppia colorazione con annessina V/7-AAD e i risultati sono stati analizzati mediante citometria a flusso dalla colorazione complessiva. Come per altre analisi citofluorimetriche, un gruppo di cellule non colorate e due gruppi di cellule colorate singolarmente sono stati impostati per escludere risultati falsi positivi e falsi negativi. I risultati mostrano ch...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1