LPS und ATP-induzierter Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und deren Validierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll basiert auf LPS und ATP-induziertem Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen. Wir verwenden die Durchflusszytometrie zur Analyse von Annexin V und 7-AAD-Doppelfärbung, um den Zelltod zu erkennen, wobei wir die gesamte Zelle verwenden und Rasterelektronenmikroskopie einsetzen, um die Zellmembranmorphologie zu beobachten.

Zusammenfassung

Der Zelltod ist ein grundlegender Prozess in allen lebenden Organismen. Das Protokoll etabliert eine Lipopolysaccharid (LPS) und Adenosintriphosphat (ATP)-induzierte Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)-differenzierte Lipidablagerung im humanen Monozyten (THP-1)-Makrophagenmodell, um den Zelltod zu beobachten. LPS in Kombination mit ATP ist eine klassische Entzündungsindufuhrmethode, die häufig zur Untersuchung von Pyroptose verwendet wird, aber Apoptose und Nekroptose reagieren auch auf die Stimulation durch LPS/ATP. Unter normalen Umständen ist Phosphatidylserin nur im inneren Segel der Plasmamembran lokalisiert. In den frühen Stadien der Pyroptose, Apoptose und Nekroptose bleibt die Zellmembran jedoch intakt und Phosphatidylserin ausgesetzt, und in den späteren Stadien verliert die Zellmembran ihre Integrität. Hier wurde die Durchflusszytometrie verwendet, um die Doppelfärbung von Annexin V und 7-Aminoactinomycin D (AAD) zu analysieren, um den Zelltod der gesamten Zellen nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass substanzielle Zellen nach Stimulation mit LPS/ATP abstarben. Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie beobachten wir die möglichen Formen des Zelltods in einzelnen Zellen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zellen nach Stimulation mit LPS/ATP Pyroptose, Apoptose oder Nekroptose durchlaufen können. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beobachtung des Todes von Makrophagen nach Stimulation mit LPS/ATP. Die Ergebnisse zeigten, dass der Zelltod nach LPS- und ATP-Stimulation nicht auf Pyroptose beschränkt ist und dass auch Apoptose und nekrotische Apoptose auftreten können, was den Forschern hilft, den Zelltod nach LPS- und ATP-Stimulation besser zu verstehen und eine bessere experimentelle Methode zu wählen.

Einleitung

Der Zelltod ist ein grundlegender physiologischer Prozess in allen lebenden Organismen. In den letzten Jahren haben umfangreiche Studien gezeigt, dass der Zelltod an der Immunität und dem Gleichgewicht im Organismus beteiligt ist. Die Erforschung des Zelltods hilft uns, den Ausbruch und die Entwicklung von Krankheiten besser zu verstehen. Es wurden mehrere Formen des programmierten Zelltods beschrieben, und es wurden einige wichtige Ziele in diesen Prozessen identifiziert. Pyroptose, Apoptose und Nekroptose sind die drei genetisch definierten programmierten Zelltodwege, die am inneren Gleichgewicht und an der Krankheit beteiligt sind¹.

Protokoll

1. Zelllinie und Zellkultur

1. Die humane monozytäre Zelllinie THP-1 wird in RPMI-1640 vollständigem Kulturmedium mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM β-Mercaptoethanol gezüchtet. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5 % CO₂ -befeuchteter Luft. Subkulturzellen alle 2-3 Tage.
   HINWEIS: THP-1 ist eine Suspensionszelle, wählen Sie diese Option, um die Hälfte des Mediums für die Subkultivierung zu wechseln. Bei der Betrachtung vieler Zellfragmente unter dem Lichtmikroskop zentrifugieren Sie bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen in dem vorgewärmten, frischen ....

Diskussion

In diesem Manuskript wurden zwei Methoden zum Nachweis von LPS und ATP-induziertem Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen verwendet. Es wurde eine Annexin V/7-AAD-Doppelfärbung verwendet, und die Ergebnisse wurden durchflusszytometrisch aus der Gesamtfärbung analysiert. Wie bei anderen durchflusszytometrischen Analysen wurden eine Gruppe von ungefärbten Zellen und zwei Gruppen von einfach gefärbten Zellen gebildet, um falsch positive und falsch negative Ergebnisse auszuschließen. Die Ergebnisse zeigen, dass n.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1