Muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA y su validación

Resumen

Este protocolo se basa en la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-AAD para detectar la muerte celular, utilizando toda la célula y empleando microscopía electrónica de barrido para observar la morfología de la membrana celular.

Resumen

La muerte celular es un proceso fundamental en todos los organismos vivos. El protocolo establece un modelo de lipídico diferenciado por forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) inducido por lipopolisacárido (LPS) y trifosfato de adenosina (ATP) en macrófagos monocitos humanos (THP-1) para observar la muerte celular. El LPS combinado con ATP es un método clásico de inducción inflamatoria, a menudo utilizado para estudiar la piroptosis, pero la apoptosis y la necroptosis también responden a la estimulación por LPS/ATP. En circunstancias normales, la fosfatidilserina solo se localiza en la valva interna de la membrana plasmática. Sin embargo, en las primeras etapas de piroptosis, apoptosis y necroptosis, la membrana celular permanece intacta y expuesta a la fosfatidilserina, y en las etapas posteriores, la membrana celular pierde su integridad. En este caso, se utilizó citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-aminoactinomicina D (AAD) para detectar la muerte celular de las células enteras. Los resultados muestran que células sustanciales murieron después de la estimulación con LPS/ATP. Utilizando microscopía electrónica de barrido, observamos las posibles formas de muerte celular en células individuales. Los resultados indican que las células pueden sufrir piroptosis, apoptosis o necroptosis después de la estimulación con LPS/ATP. Este protocolo se centra en observar la muerte de los macrófagos tras la estimulación con LPS/ATP. Los resultados mostraron que la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP no se limita a la piroptosis y que también pueden ocurrir apoptosis y apoptosis necróticas, lo que ayuda a los investigadores a comprender mejor la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP y elegir un mejor método experimental.

Introducción

La muerte celular es un proceso fisiológico fundamental en todos los organismos vivos. En los últimos años, estudios sustanciales han demostrado que la muerte celular está involucrada en la inmunidad y el equilibrio dentro del organismo. El estudio de la muerte celular nos ayuda a comprender mejor la aparición y el desarrollo de las enfermedades. Se han descrito varias formas de muerte celular programada y se han identificado algunos objetivos clave en estos procesos. La piroptosis, la apoptosis y la necroptosis son las tres vías de muerte celular programada genéticamente definidas que participan en el equilibrio interno y^{la enfermedad.}

La piroptosis se caracteriza por la formación de poros en la membrana y la liberación de contenido celular. Las caspasas o granzimas activadas escinden las gasderminas para separar sus dominios N-terminales, que luego se oligomerizan, se unen a la membrana y forman poros ^2,3,4. El poro de gasdermina proporciona un canal de secreción atípico a través de las membranas celulares, lo que da lugar a respuestas celulares posteriores, incluida la liberación de contenido y la afluencia de iones ^2,3,4. En última instancia, las células finalmente experimentan la ruptura de la membrana plasmática y la lisis piroptótica facilitada por la ninjurina-1⁵. En la apoptosis, Bax y Bak activados forman oligómeros en la membrana externa mitocondrial y liberan citocromo C, que está regulado por un equilibrio entre proteínas proapoptóticas y antiapoptóticas de la familia BCL-2, caspasas iniciadoras (caspasas-8, -9 y -10) y caspasas efectoras (caspasas-3, -6 y -7)^1,6,7. Los cambios morfológicos de la apoptosis incluyen la formación de ampollas en la membrana, la contracción celular, la fragmentación nuclear, la condensación de la cromatina y la formación de cuerpos apoptóticos ^6,8. La serina/treonina-proteína quinasa 1 (RIPK3) que interactúa con el receptor y el dominio similar a la quinasa de linaje mixto (MLKL) son dos componentes centrales del mecanismo necroptótico¹. RIPK3 recluta y fosforila MLKL, p-MLKL oligomeriza, se asocia con la membrana celular, inicia perforaciones de membrana, causa afluencia de iones, aumenta la osmolaridad intracelular y, finalmente, la ruptura celular ^6,9. Las gasderminas y MLKL se unen a la membrana plasmática y median la piroptosis y la necroptosis, respectivamente, mientras que BAX/BAK media la apoptosis al unirse a la membrana externa de las mitocondrias⁶.

Aunque cada vía tiene mecanismos y resultados específicos, conducen a cambios similares en la membrana celular. En circunstancias normales, la fosfatidilserina (PS) solo se localiza en la valva interna de la membrana plasmática. Sin embargo, en las primeras etapas de piroptosis, apoptosis y necroptosis, la PS estará expuesta, fuera de la membrana plasmática. La caspasa-3/caspasa-7 activa las familias TMEM16 y XKR, lo que conduce a una membrana celular asimétrica y externaliza la PS durante la apoptosis¹⁰. La afluencia de Ca²⁺ mediada por Gasdermin D y MLKL conduce a la pérdida de la simetría de la bicapa de fosfolípidos en la membrana celular y a la exposición de PS. La exposición ocurre antes de la pérdida de la integridad de la membrana celular^11,12. Sobre la base de los cambios similares en la membrana de estos tres tipos de muerte celular programada, utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de la anexina V/7-aminoactinomicina D (7-AAD) para detectar la muerte celular. La anexina V, una proteína de unión a fosfolípidos dependiente del calcio, tiene una alta afinidad por la PS, que puede servir como una sonda sensible para detectar la PS expuesta en la superficie de la membrana plasmática¹³. El 7-AAD es una tinción de ácido nucleico que no puede atravesar toda la membrana celular. Es similar al yoduro de propidio (PI), un colorante de ácido nucleico comúnmente utilizado. Tienen características de fluorescencia similares, pero el 7-AAD tiene un espectro de emisión más estrecho y menos interferencia con otros canales de detección. Debido a estas similitudes, no es suficiente distinguir entre piroptosis, apoptosis y necroptosis. Utilizamos la citometría de flujo para detectar la muerte celular de células enteras. Un segundo método se utiliza para capturar la membrana celular mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) para observar las posibles formas de muerte celular en células individuales.

Establecimos un modelo de macrófagos diferenciados por forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) inducido por lipopolisacárido (LPS) y trifosfato de adenosina (ATP) en macrófagos monocitos humanos (THP-1) para observar la muerte celular. Este protocolo se centra en la observación de la muerte celular más que en la investigación de los mecanismos.

Protocolo

1. Línea celular y cultivo celular

1. Cultive la línea celular monocítica humana THP-1 en el medio de cultivo completo RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,05 mM de β-mercaptoetanol. Cultivar las células a 37 °C en aire humidificado con 5% de CO₂ . Subcultivo de células cada 2-3 días.
   NOTA: THP-1 es una célula de suspensión, seleccione para cambiar la mitad del medio para subcultivo. Cuando observe muchos fragmentos de células bajo el microscopio óptico, centrifugar a 300 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células en el medio de cultivo celular completo fresco precalentado.
2. Utilice células (en los pasajes 4-10) en la fase de crecimiento logarítmico para todos los experimentos. Cuando las células están en buen estado y fase de crecimiento logarítmico, son redondas, brillantes, densas y sin grumos ni fragmentos celulares bajo el microscopio óptico a 100 x.

2. Diferenciación de las células THP-1

1. Prepare una solución madre de PMA con una concentración de 1 mM (disuelva 1 mg de PMA en 1,62 mL de dimetilsulfóxido). Diluir la solución madre de PMA con medio de cultivo celular completo hasta una concentración de trabajo final de 100 nM.
2. Recoja las células de la placa de cultivo en un tubo de centrífuga estéril de 10 ml. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente, resuspender las células con 3 mL de medio de cultivo completo que contenga PMA.
3. Abra el contador de celdas y el software de conteo. Pipetear 20 μL de suspensión celular en la placa de contador de células e insertarla en la placa de contador de células. Haga clic en Vista previa B1, gire la perilla en la parte inferior derecha del instrumento y ajuste la distancia focal para que las celdas tengan un centro brillante con contornos claros en el software. Haga clic en Contar para comenzar a contar.
4. En función de los resultados del recuento, utilice un medio de cultivo completo que contenga PMA para ajustar la densidad celular a 1 x 10⁶ células/mL. Las células de siembra se colocan en una placa de 6 pocillos, se incuba la placa durante 24 h a 37 °C y 5% de_CO2 antes de comenzar el tratamiento posterior.

3. Tratamiento de las células THP-1

1. Prepare una solución madre de LPS con una concentración de 1 mg/mL (disuelva 1 mg de LPS en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS)). Diluir la solución madre de LPS con medio sin suero hasta una concentración de trabajo final de 1 μg/mL. Prepare una solución madre de Na₂ATP con una concentración de 500 mM (disuelva 0,3026 g de ATP en 1 mL de PBS).
2. Aspire el medio que contiene PMA de los pocillos y lávelo con PBS 1x. Añada un medio sin suero al grupo de control y un medio sin suero que contenga LPS al grupo modelo. Incubar la placa durante 6 h a 37 °C + 5% de CO₂ antes de continuar con el tratamiento.
3. Después de 6 h, agregue la solución madre de ATP al grupo modelo hasta una concentración de trabajo final de 500 nM. Incubar la placa durante 45 minutos a 37 °C + 5% de CO₂ antes de continuar.

4. Análisis de citometría de flujo (Método 1)

1. Preparación de muestras experimentales
   1. Siembre e incube las células en placas de 6 pocillos de acuerdo con el paso 2. Establezca cuatro grupos de control sin tratamiento: un control sin tinción, dos controles con tinción simple (uno para cada mancha) y un control con tinción doble. Establezca un grupo de tratamiento y trate de acuerdo con el paso 3.
   2. Después del tratamiento, aspire todo el sobrenadante de los pocillos y lave con PBS 2x. Añadir 500 μL de tripsina al 0,05% (sin EDTA) a cada pocillo e incubar en la incubadora durante 30 s.
   3. Agregue 1 mL de medio de cultivo completo RPMI-1640 a cada pocillo para detener el desprendimiento de células y recoja las células en el tubo de 5 mL. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
   4. Agregue 1 mL de PBS para resuspender las células. Coloque los tubos con células en un baño de agua a 37 °C durante 3 min. Centrifugar todas las muestras a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
   5. Diluir 200 μL de tampón de unión 5x con 800 μL de agua destilada en 1x tampón de unión. Agregue 100 μL de tampón de unión 1x para resuspender las células y transferir las células al tubo de 5 mL.
   6. Añada 5 μL de solución de anexina V-PE a un tubo de células del grupo de control durante 10 min y 5 μL de solución de 7-AAD a otro tubo de células del grupo de control durante 5 min (como controles de tinción única por separado). Agite suavemente cada tubo para mezclar, colorear e incubar las muestras a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Agregue 400 μL de PBS a cada tubo y haga un vórtice suavemente para finalizar la incubación.
   7. Añadir 5 μL de solución de anexina V-PE a los tubos restantes e incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Agite suavemente cada tubo para mezclar, colorear e incubar las muestras a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Después de 5 minutos, agregue 5 μL de solución de 7-AAD durante 5 minutos a temperatura ambiente. Agregue 400 μL de PBS a cada tubo y haga un vórtice suavemente para finalizar la incubación.
   8. Filtre la suspensión celular con una malla de nailon de 35 μm que forman parte de los tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mL. Coloque el tubo sobre hielo y espere a que se haga la prueba. Mezcle suavemente antes de probar y luego insértelo en el instrumento.
2. Citometría de flujo
   1. Utilice un citómetro de flujo de clasificación celular activado por fluorescencia para las pruebas. Abra el software de análisis de datos del citómetro de flujo y confirme el rendimiento del detector y el láser. Haga clic en el citómetro y elija Inicio de fluidos, espere a que el sistema esté listo. Excluya las burbujas de la cámara de flujo haciendo clic en Citómetro > modos de limpieza > celda de flujo de desgasificación.
   2. Haga clic en Experimento, seleccione en secuencia Nueva carpeta, Experimento, Muestra, Tubo y Editar nombre. Una flecha de forma pentagonal frente del tubo, se vuelve verde cuando se ilumina.
   3. Haga clic en el icono del citómetro FACSCelesta (un icono de tecla de acceso directo), seleccione Parámetro y, a continuación, seleccione FSC, SSC y señal PE . Haga clic en el icono de Hoja de cálculo global (un icono de tecla de acceso directo) para establecer el histograma de PE. Para el citómetro de flujo utilizado en este estudio, utilice PE para la anexina V a 586 nm y trace en el eje X; PerCP-Cy5.5 para 7-AAD a 700 nm y trazado en el eje Y.
   4. Inserte primero la muestra de control sin teñir en el instrumento. Haga clic en el icono del Panel de control de adquisiciones (un icono de tecla de acceso directo), adquiera un mínimo de 10.000 eventos de la población deseada. Excluya los escombros mediante una puerta (P1) en un diagrama de puntos FSC-A y SSC-A. Ajuste el caudal a la velocidad media y registre los datos. Ajuste el voltaje para colocar la población de celdas en la diagonal del histograma FSC/SSC y haga clic en Reiniciar. Ajuste el caudal a la velocidad media y registre los datos.
   5. Haga clic en Siguiente tubo, ejecute controles de tinción individuales de anexina V y 7-AAD para ajustar la compensación. Ejecute los tubos restantes y recopile datos.

5. Imágenes SEM (Método 2)

1. Preparación de muestras experimentales
   1. Siembre e incube las células en placas de 6 pocillos de acuerdo con el paso 2 y trátelas de acuerdo con el paso 3.
   2. Después del tratamiento, aspire todo el sobrenadante de los pocillos y lave 2 veces con PBS. Añadir 500 μL de tripsina al 0,05% (sin EDTA) a cada pocillo e incubar en la incubadora durante 30 s.
   3. Agregue 1 mL de medio de cultivo completo RPMI-1640 a cada pocillo para detener el desprendimiento de células y recoja las células en el tubo de 5 mL. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
   4. Fije las células con 500 μL de fijador de microscopio electrónico (dialdehído glutárico al 2,5%, 100 mM de sales de fósforo) durante 2 h a temperatura ambiente, seguido de toda la noche a 4 °C.
   5. Prepare la solución de alumbre y cromo: Agregue 1,0 g de gelatina a 100 ml de agua ultrapura, calentamiento al baño de agua a 70 °C y revuelva uniformemente. Añadir 0,05 g de alumbre de cromo, remover uniformemente y filtrar con papel de filtro. Sumerja el cubreobjetos limpio en una solución de cromo y alumbre durante 2 h a 37 °C y séquelo en un horno a 37 °C para su uso posterior.
      NOTA: El propósito es evitar el desprendimiento de células durante el experimento.
   6. Recoja células de solución fija. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Agregue 100 μL de PBS y sople suavemente las células. Deje caer la suspensión de la celda sobre el cubreobjetos, déjela reposar durante 5 minutos. Aspire todo el sobrenadante y lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez.
      NOTA: La operación debe realizarse con suavidad para evitar el desprendimiento de la célula. No agite vigorosamente, muévase lentamente y agregue líquido lentamente a lo largo de la pared.
   7. Añadir 500 μL de fijación de ácido ósmico al 1% durante 1 hora. Aspire todo el sobrenadante y lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez.
   8. Deshidratar las muestras sucesivamente en una serie de concentraciones de etanol (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) durante 15 min por solución de EtOH.
      NOTA: Los cubreobjetos se pueden mantener en 100% EtOH durante varios días a 4 °C, pero deben secarse lo antes posible para evitar una deshidratación excesiva.
   9. Encienda el secador de puntos críticos, abra el tanque de CO₂ , enfríe la cámara a 10 °C. Envuelva rápidamente la muestra con papel de filtro cuando la presión de la cámara sea de 0 psi y colóquela en la cámara.
   10. Abra la válvula de entrada, observe a través de la ventana de observación de CO₂ , eleve el nivel de CO₂ líquido entre las dos líneas rojas (no exceda el límite superior), cierre la válvula de entrada. Remoje la muestra durante 10 min. Abra las válvulas de entrada y escape simultáneamente para igualar el CO₂ durante 1 minuto (el CO₂ líquido desplaza al EtOH). Cierre la válvula de escape para elevar el nivel de CO₂ líquido a la posición especificada, cierre la válvula de entrada.
   11. Ajuste la temperatura a 35 °C y la presión a 1250 psi. Una vez que la temperatura y la presión se estabilicen, despresurice a 100 psi/min. Extraiga la muestra cuando la presión de la cámara sea cero y apague el instrumento.
   12. Monte las muestras en soportes de muestras de aluminio SEM con cinta conductora. Emplee un recubridor de pulverización catódica para cubrir las muestras con una capa (2-5 nm) de oro.
2. Imagenológico
   1. Utilice SEM de emisión de campo frío de alta resolución para la obtención de imágenes. Ajuste el voltaje de aceleración de SEM a 3 kV. Ajuste la distancia de trabajo a 10 mm. Ajuste el aumento a 1.000x para observar el panorama. Ajuste el aumento a 5.000x y 20.000x para localizar la membrana plasmática y obtener una imagen de la muestra.
      NOTA: El proceso de visualización de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA a través de SEM es similar al de otros tipos de células y tejidos y depende de los instrumentos utilizados. La referencia¹⁴ proporciona un protocolo SEM detallado con videos adjuntos.

Resultados

Las muestras celulares se trataron como se describe en el protocolo y se realizó la detección por citometría de flujo. Las células normales no se pueden teñir con anexina V y 7-AAD (anexina V-/7-AAD-). En las primeras etapas de la piroptosis, apoptosis y necroptosis, la PS estaba expuesta y unida a la anexina V, pero la membrana celular aún estaba intacta y excluía la 7-AAD del espacio extracelular (anexina V+/7-AAD-). En las etapas posteriores, la membrana celular pierde su integridad, las células se tiñen simu...

Discusión

En este manuscrito, se utilizaron dos métodos para detectar la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Se utilizó la tinción doble con anexina V/7-AAD y los resultados se analizaron mediante citometría de flujo a partir de la tinción general. Al igual que con otros análisis de citometría de flujo, se configuró un grupo de células sin tinción y dos grupos de células con una sola tinción para excluir los resultados falsos positivos y falsos negativos. Los resultados muestran qu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1