Muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA y su validación

Resumen

Este protocolo se basa en la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-AAD para detectar la muerte celular, utilizando toda la célula y empleando microscopía electrónica de barrido para observar la morfología de la membrana celular.

Resumen

La muerte celular es un proceso fundamental en todos los organismos vivos. El protocolo establece un modelo de lipídico diferenciado por forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) inducido por lipopolisacárido (LPS) y trifosfato de adenosina (ATP) en macrófagos monocitos humanos (THP-1) para observar la muerte celular. El LPS combinado con ATP es un método clásico de inducción inflamatoria, a menudo utilizado para estudiar la piroptosis, pero la apoptosis y la necroptosis también responden a la estimulación por LPS/ATP. En circunstancias normales, la fosfatidilserina solo se localiza en la valva interna de la membrana plasmática. Sin embargo, en las primeras etapas de piroptosis, apoptosis y necroptosis, la membrana celular permanece intacta y expuesta a la fosfatidilserina, y en las etapas posteriores, la membrana celular pierde su integridad. En este caso, se utilizó citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-aminoactinomicina D (AAD) para detectar la muerte celular de las células enteras. Los resultados muestran que células sustanciales murieron después de la estimulación con LPS/ATP. Utilizando microscopía electrónica de barrido, observamos las posibles formas de muerte celular en células individuales. Los resultados indican que las células pueden sufrir piroptosis, apoptosis o necroptosis después de la estimulación con LPS/ATP. Este protocolo se centra en observar la muerte de los macrófagos tras la estimulación con LPS/ATP. Los resultados mostraron que la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP no se limita a la piroptosis y que también pueden ocurrir apoptosis y apoptosis necróticas, lo que ayuda a los investigadores a comprender mejor la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP y elegir un mejor método experimental.

Introducción

La muerte celular es un proceso fisiológico fundamental en todos los organismos vivos. En los últimos años, estudios sustanciales han demostrado que la muerte celular está involucrada en la inmunidad y el equilibrio dentro del organismo. El estudio de la muerte celular nos ayuda a comprender mejor la aparición y el desarrollo de las enfermedades. Se han descrito varias formas de muerte celular programada y se han identificado algunos objetivos clave en estos procesos. La piroptosis, la apoptosis y la necroptosis son las tres vías de muerte celular programada genéticamente definidas que participan en el equilibrio interno y^{la enfermedad.}

Protocolo

1. Línea celular y cultivo celular

1. Cultive la línea celular monocítica humana THP-1 en el medio de cultivo completo RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,05 mM de β-mercaptoetanol. Cultivar las células a 37 °C en aire humidificado con 5% de CO₂ . Subcultivo de células cada 2-3 días.
   NOTA: THP-1 es una célula de suspensión, seleccione para cambiar la mitad del medio para subcultivo. Cuando observe muchos fragmentos de células bajo el microscopio óptico, centrifugar a 300 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células en el medio de cultivo celular comp....

Discusión

En este manuscrito, se utilizaron dos métodos para detectar la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Se utilizó la tinción doble con anexina V/7-AAD y los resultados se analizaron mediante citometría de flujo a partir de la tinción general. Al igual que con otros análisis de citometría de flujo, se configuró un grupo de células sin tinción y dos grupos de células con una sola tinción para excluir los resultados falsos positivos y falsos negativos. Los resultados muestran qu.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1