LPS和ATP诱导的PMA分化THP-1巨噬细胞死亡及其验证

摘要

该方案基于 LPS 和 ATP 诱导的 PMA 分化 THP-1 巨噬细胞的死亡。我们使用流式细胞术分析膜联蛋白V和7-AAD双染色以检测细胞死亡，使用整个细胞并采用扫描电子显微镜观察细胞膜形态。

摘要

细胞死亡是所有生物体的基本过程。该方案建立了脂多糖 （LPS） 和三磷酸腺苷 （ATP） 诱导的佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 （PMA） 分化的人单核细胞 （THP-1） 巨噬细胞中的脂质沉积模型，以观察细胞死亡。LPS联合ATP是一种经典的炎症诱导方法，常用于研究焦亡，但细胞凋亡和坏死性凋亡也对LPS/ATP的刺激有反应。在正常情况下，磷脂酰丝氨酸仅局限于质膜的内小叶中。然而，在细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的早期阶段，细胞膜保持完整并暴露于磷脂酰丝氨酸，而在后期阶段，细胞膜失去其完整性。本文采用流式细胞术分析膜联蛋白V和7-氨基放线菌素D（AAD）双染色，检测全细胞的细胞死亡情况。结果显示，在用LPS/ATP刺激后，大量细胞死亡。使用扫描电子显微镜，我们观察了单个细胞中细胞死亡的可能形式。结果表明，在用LPS/ATP刺激后，细胞可能会发生焦亡、凋亡或坏死性凋亡。该协议的重点是观察用LPS / ATP刺激后巨噬细胞的死亡。结果表明，LPS和ATP刺激后的细胞死亡不仅限于焦亡，还可以发生凋亡和坏死性细胞凋亡，有助于研究人员更好地了解LPS和ATP刺激后的细胞死亡，并选择更好的实验方法。

引言

细胞死亡是所有生物体的基本生理过程。近年来，大量研究表明，细胞死亡与生物体内的免疫和平衡有关。研究细胞死亡有助于我们更好地了解疾病的发生和发展。已经描述了几种形式的程序性细胞死亡，并且已经确定了这些过程中的一些关键靶点。焦亡、凋亡和坏死性凋亡是参与内部平衡和疾病¹ 的三种遗传定义的程序性细胞死亡途径。

细胞焦亡的特征是膜孔的形成和细胞内容物的释放。活化的半胱天冬酶或颗粒酶裂解 gasdermins 以分离其 N 端结构域，然后这些结构域寡聚化，与膜结合并形成孔 ^2,3,4。Gasdermin 孔提供跨细胞膜的非典型分泌通道，导致下游细胞反应，包括内容物释放和离子流入 ^2,3,4。最终，细胞最终经历质膜破裂和由 ninjurin-1⁵ 促进的焦亡裂解。在凋亡中，活化的 Bax 和 Bak 在线粒体外膜上形成寡聚体并释放细胞色素 C，细胞色素 C 受 BCL-2 家族的促凋亡和抗凋亡蛋白、起始蛋白半胱天冬酶（casp....

研究方案

1. 细胞系和细胞培养

1. 在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素和 0.05 mM β-巯基乙醇的 RPMI-1640 完全培养基中培养人单核细胞系 THP-1。在37°C的5%CO₂ 湿润空气中培养细胞。每 2-3 天传代培养一次细胞。
   注意：THP-1 是悬浮细胞，选择更换一半的培养基进行传代培养。当在光学显微镜下观察许多细胞片段时，在室温下以300× g 离心3分钟。将细胞重悬于预热的新鲜完全细胞培养基中。
2. 使用对数生长阶段的细胞（在第4-10代中）进行所有实验。当细胞处于良好状态和对数生长阶段时，它们在100x的光学显微镜下是圆形的，明亮的，致密的，没有团块和细胞碎片。

2. THP-1细胞的分化

1. 制备浓度为 1 mM 的 PMA 储备溶液（将 1 mg PMA 溶解在 1.62 mL 二甲基亚砜中）。用完全细胞培养基稀释PMA储备溶液至终工作浓度为100nM。
2. 将培养皿中的细胞收集到 10 mL 无菌离心管中。在室温下以 300 x g 离心 3 分钟，用 3 mL 含有 PMA 的完全培养基重悬细胞。
3. 打开细胞计数仪和计数软件。将 20 μL 细胞悬液移液到细胞计数板上，并将其插入细胞计数板。点击 ....

讨论

在本文中，使用两种方法检测 LPS 和 ATP 诱导的 PMA 分化 THP-1 巨噬细胞的死亡。采用膜联蛋白V/7-AAD双染色，采用流式细胞术分析整体染色结果。与其他流式细胞术分析一样，设置一组未染色细胞和两组单染色细胞以排除假阳性和假阴性结果。结果表明，LPS/ATP刺激后，几种细胞失去了膜的完整性，表明可能已经发生了细胞死亡。这种检测方法使我们能够评估整个细胞的细胞死亡。值得注意的是，Anne.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1