تلخيص الإصابة علاجية المنشأ: تقنية الاستئصال الكهربائي لنمذجة تضيق مجرى البول في الفئران

Summary

في هذه الدراسة ، نقدم نموذجا جديدا وفعالا ومستقرا للفئران لتضيق مجرى البول الذي تم إنشاؤه من خلال الاستئصال الكهربائي لمجرى البول في الفئران ، والذي يحاكي بشكل فعال الإصابة علاجية المنشأ التي لوحظت في البيئات السريرية.

Abstract

تضيق مجرى البول (الولايات المتحدة) هو حالة سريرية شائعة في جراحة المسالك البولية ، وتتميز بارتفاع معدل الانتشار والمراضة في جميع الأعمار. تفشل العلاجات الحالية للحالات الأميركية، مثل توسيع مجرى البول واستئصال الإحليل الداخلي، في حل الحالة بشكل كامل وترتبط بمعدلات عالية من التكرار والمضاعفات.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن التسبب في الولايات المتحدة غير مفهوم جيدا. لاستكشاف التسبب في الولايات المتحدة وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة ، من الأهمية بمكان إنشاء نموذج موحد للفئران يعكس بدقة المظاهر السريرية. توضح هذه الدراسة طريقة مباشرة وقابلة للتكرار لحث الولايات المتحدة في الفئران باستخدام سكين كهربائي عالي التردد. تتضمن الطريقة عمل شق طولي باستخدام السكين الكهربائي الذي تم ضبطه على وضع القطع المختلط أحادي القطب عند 4 واط ، مما يتسبب في تلف كبير في مجرى البول. يظهر التحليل النسيجي المرضي سماكة الظهارة البولية ، والتسلل الالتهابي ، وألياف الكولاجين غير المنظمة. يكرر هذا النموذج بشكل فعال الإصابة علاجية المنشأ من خلال الاستئصال الكهربائي في مجرى البول الفئران. باختصار ، نجحت هذه الدراسة في إنشاء نموذج فئران جديد وفعال ومستقر للولايات المتحدة يحاكي عن كثب السيناريو السريري ، مما يوفر أداة قيمة لمزيد من البحث في الآليات والعلاجات الجديدة للولايات المتحدة.

Introduction

يعد تضيق مجرى البول (الولايات المتحدة) من بين أقدم حالات المسالك البولية ولا يزال منتشرا على نطاق واسع. تشير البيانات الحديثة إلى أن هناك ما بين 229 و 627 حالة من الولايات المتحدة لكل 100,000 ذكر¹. يعاني أولئك الذين يعانون من الولايات المتحدة من مجموعة من الأعراض بما في ذلك أعراض المسالك البولية^{السفلية 2} ، والألم³ ، والضعف الجنسي⁴. تتوفر العديد من العلاجات الطبية ، مثل بضع الإحليل ورأب الإحليل والتوسع⁵. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هذه العلاجات معقدة بسبب مشاكل مثل النزيف والعدوى وسلس البول ، مما يساهم في عبء المرض ويظهر معدلات متفاوتة من التكرار^6،7. وبالتالي ، يظل تحديد الأساليب العلاجية الأكثر فعالية يمثل تحديا حاسما لإشراك الباحثين والأطباء.

تتميز الولايات المتحدة عموما بأنها تضيق في مجرى البول الأمامي الناجم عن التليف وتسطيخ الغشاء المخاطي لمجرى البول والأنسجة الإسفنجية^{المحيطة 8}. على الرغم من انتشاره ، فإن الأسباب والآليات الكامنة وراء الولايات المتحدة غير مفهومة جيدا ، وهناك نقص في النماذج الحيوانية المناسبة للدراسة المتعمقة. تعد الإصابة علاجية المنشأ ، الناتجة عن الجراحة عبر الإحليل ، السبب الرئيسي حاليا للولايات المتحدة ، حيث تمثل 41٪ من الحالات⁹. لذلك ، يجب أن يكرر النموذج الحيواني المثالي للأبحاث الأمريكية الإصابات السريرية الشائعة بدقة ، ويظهر أوجه تشابه جينومية وبروتينية وثيقة مع البشر ، ويظهر الكفاءة والاستقرار. مثل هذا النموذج من شأنه أن يسهل إلى حد كبير إجراء تحقيقات أعمق في التسبب في الولايات المتحدة وتطوير علاجات أكثر فعالية.

للتحقيق في العملية المسببة للأمراض وآلية الأنواع السريرية الشائعة ، تم تطوير نماذج حيوانية مختلفة باستخدام كبيرة مثل الأرانب^10،1112 والخنازير^13،14 باستخدام تقنيات مثل التخثير الكهربائي والاستئصال^{الكهربائي 15} وحقن البيوميسين¹⁶. ومع ذلك ، غالبا ما تواجه هذه النماذج تحديات بسبب قيود حجم العينة والاختلافات الجينية من البشر. بالإضافة إلى ذلك ، يجب مراعاة فعالية تكلفة استخدام الكبيرة. على الرغم من التكاليف المرتفعة المرتبطة بالرعاية اليومية ، فإن الكبيرة تنطوي أيضا على مخاطر كبيرة للعدوى ، مما يستلزم رعاية مكثفة بعد الجراحة ونفقات كبيرة. من الموثق جيدا أن القوارض تشترك في الخصائص الفسيولوجية والمرضية مع البشر في العديد من أجهزة الأعضاء. أظهرت دراسة حديثة التماثل بين خلايا المسالك البولية للحيوانات القوارض والبشر¹⁷. علاوة على ذلك ، فإن تكاليف شراء الفئران وإسكانها ورعايتها بعد الجراحة أقل بكثير من تكاليف الكبيرة¹⁸. وبالتالي ، يعتبر نموذج الفئران للولايات المتحدة مناسبا. ومع ذلك ، لم يتم وصف تطوير مثل هذه النماذج في الفئران بشكل كاف.

استخدمت الدراسات السابقة أدوات جراحية مثل الشفرات أو الإبر لحث الولايات المتحدة في نماذج الفئران¹⁹. ارتبط هذا النهج بمخاطر مثل إتلاف الأوعية الدموية حول الإحليل ، مما يؤدي إلى نزيف حاد. يمكن أن تؤدي الطبيعة الذاتية لهذه الإجراءات الجراحية أيضا إلى تباين في مدى الإصابة الميكانيكية ، وتفتقر إلى المعايير الكمية للنمذجة ، مما قد يؤثر على تقييم نتائج إصلاح مجرى البول في الدراسات العلاجية اللاحقة.

بالنظر إلى هذه الاعتبارات ، هناك حاجة واضحة لتطوير نموذج فئران أمريكي إضافي. لإنشاء نموذج أمريكي فعال وفعال من حيث التكلفة ومستقر في الفئران ، استخدمنا آلة سكين كهربائية عالية التردد في بحثنا. سيسهل هذا النموذج إجراء مزيد من التحقيقات في آليات الولايات المتحدة وتقييم الأساليب العلاجية الجديدة قبل الشروع في التجارب السريرية.

Protocol

في هذا التحقيق ، تم توظيف عشرين فأرا من ذكور Sprague-Dawley يبلغ من العمر 6 أشهر ، يزن كل منها 400-500 جرام. تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لإرشادات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في المستشفى الخامس التابع لجامعة صن يات سين (رقم الموافقة: 00349). تم إيواء في منشأة ذات درجة حرارة وظروف إضاءة خاضعة للرقابة. السمة الأساسية لتضيق مجرى البول هي تطور التندب داخل مجرى البول. بناء على الجدول الزمني المحدد لتكوين الندبة ، والذي يحدث عادة في غضون 4 أسابيع من الإصابة ، حددنا وجود نسيج ندبي ملحوظ في مجرى البول عند علامة 4 أسابيع بعد الجراحة كنقطة نهاية تجريبية.

1. تحضير الأدوات الجراحية

1. تحضير المواد الجراحية التالية: قسطرة مطلية بالتفلون (0.6 × 1 مم) ، خيوط قابلة للامتصاص (6-0) ، مقص خياطة ، ملقط الأنسجة ، كماشة إبرة ، ملقط ناعم ، وحدة الجراحة الكهربائية عالية التردد (الشكل 1) ، بما في ذلك لوحة السكين الكهربائي عالي التردد ، وسكين الجراحة الكهربائية عالي التردد ، والقضيب الموصل الشرجي (انظر جدول المواد).
2. نظف منطقة الجراحة بمناديل كحولية تحتوي على 75٪ إيثانول.
3. التحضير لاستخدام سكين كهربائي عالي التردد في وضع القطع الكهربائي أحادي القطب.
   1. قم بتوصيل السكين الكهربائي عالي التردد بمصدر الطاقة الرئيسي المؤرض 220 فولت باستخدام سلك طاقة.
   2. أدخل مقبض السكين المعقم الذي يتم التحكم فيه يدويا والقضيب الموصل في مآخذهما (الشكل 1 ج).
      ملاحظة: تأكد من توصيل جميع كابلات الطاقة بإحكام للحفاظ على سلامة الجراحة.

2. تحضير

1. اسحب البنتوباربيتال الصوديوم (60 مجم / كجم) في حقنة.
2. قم بتأمين الجرذ عن طريق الإمساك بذيله باليد المهيمنة وإمساك جلد أذنيه ورقبته باليد غير المهيمنة للتأكد من تثبيته بإحكام.
3. كشف أسفل بطن الفئران وتطهير المنطقة باستخدام كرات قطنية مبللة بنسبة 75٪ من الإيثانول.
4. أدخل إبرة المحقنة حوالي 1-2 مم بجانب خط الوسط البطني في أسفل البطن ، وتوجيهها إلى تجويف البطن بزاوية 45 درجة.
   ملاحظة: ستشعر بفقدان المقاومة عندما تخترق الإبرة الصفاق.
5. اسحب مكبس المحقنة برفق للتأكد من عدم وجود دم أو سوائل في المحقنة.
6. حقن بنتوباربيتال الصوديوم ببطء. اسحب الإبرة ، واستكمل الحقن ، وقم بتطهير الموقع مرة أخرى بكرات قطنية مبللة بنسبة 75٪ من الإيثانول.
7. راقب إيقاع تنفس الفئران واضغط على مخلبه الخلفي للتحقق من ردود الفعل.
   ملاحظة: تأكد من أن تنفس الفئران ثابت وأنه لا يظهر أي ردود أفعال قبل الشروع في الجراحة.
8. اعصر مرهم الإريثروميسين واغمس قطعة قطن في المرهم. ضع المرهم بقطعة قطن على قرنية كلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء العملية.
9. استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلاقة أسفل البطن والعجان بعد تأكيد التخدير.
10. امسح الشعر المتساقط من المنطقة المحلوقة بمنديل مبلل بالمحلول الملحي.
11. قم بتطهير المنطقة عن طريق مسحها مرتين بإسفنجة شاش مبللة باليودوفور لتقليل تهيج الجلد.
12. ضع الجرذ المخدر بعمق على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية في وضع ضعيف. تأكد من العقم أثناء العمليات الجراحية من خلال ارتداء القفازات الطبية.

3. إجراء قسطرة مجرى البول والإصابة

1. أدخل القضيب الموصل في فتحة الشرج للفأر لإنشاء دائرة حلقة مغلقة فعالة لآلة السكين الكهربائية عالية التردد (الشكل 2 أ).
2. قم بقسطرة مجرى البول للفأر للمساعدة في تحديد الوضع وتقديم الدعم أثناء خطوات ما بعد المعالجة للجراحة.
   1. قم بتليين القسطرة البولية بزيت البارافين.
   2. كشف القضيب عن طريق الضغط على الجلد المحيط به لإخراجه من البطن.
   3. تطهير قضيب الفئران بإسفنجة شاش مبللة باليودوفور.
   4. افتح فتحة مجرى البول برفق باستخدام ملقط ناعم وأدخل القسطرة المشحمة في مجرى البول.
   5. أدخل القسطرة المطلية بالتفلون بعناية في مجرى البول مع إيقاع تقلص مجرى البول. تجنب أي إدخال قوي (الشكل 2 ب).
   6. إذا تمت مواجهة مقاومة ، اسحب القضيب برفق باتجاه الجانب البطني لضبط زاوية الانحناء للقضيب واستمر في دفع القسطرة إلى المثانة حتى يتدفق البول للخارج (الشكل 2 ج).
   7. تأكد من نجاح القسطرة عن طريق التأكد من أن القضيب يشكل زاوية تقريبية تبلغ 45 درجة مع البطن (الشكل 2 د).
3. قم بتشغيل آلة السكين الكهربائية عالية التردد ، وانقر فوق أزرار لوحة السكين عالية التردد لتحديد وضع القطع المختلط أحادي القطب ، واضبط الطاقة على 4 واط للخطوات التالية للاستئصال الكهربائي للقضيب طبقة تلو الأخرى.
4. قم بمحاذاة الشق مع القسطرة. اضغط على الزر الأصفر الموجود على مقبض السكين الجراحي الكهربائي وقم بعمل شق على طول خط تعليم القسطرة من جلد القضيب إلى الطبقة الخارجية من مجرى البول باستخدام السكين الكهربائي حتى يتعرض مجرى البول (الشكل 3 أ ، ب).
   ملاحظة: تأكد من الضغط على الزر الأصفر للاستئصال الكهربائي ، وليس الزر الأزرق للتخثير الكهربائي.
5. استمر في عمل شق طولي بطول 0.5 سم في مجرى البول بالسكين الكهربائي ، مع ضمان قطر عرضي يبلغ 0.1 سم ، حتى تظهر القسطرة (الشكل 3 ج).
6. خياطة الجرح وطبقة الجلد السطحية بطبقة باستخدام خيوط قابلة للامتصاص (6-0) إما بغرز مستمرة أو متقطعة (الشكل 3D ، E).
7. قم بإزالة قسطرة مجرى البول وأعد وضع القضيب (الشكل 3F).
8. قم بإيقاف تشغيل السكين الكهربائي عالي التردد وإزالة القضيب الموصل من فتحة الشرج للفئران.
9. نظف المواد الجراحية بمناديل الكحول (75٪ إيثانول).

4. رعاية ما بعد الجراحة

1. ضع الجرذ على وسادة دافئة (37 درجة مئوية) وراقب تعافيه من التخدير عن كثب. انتبه جيدا للحالة الجسدية للفئران ، بما في ذلك إيقاع التنفس ودرجة حرارة الجسم ومستوى الوعي.
   ملاحظة: لا تعيد الجرذ إلى قفصه حتى يتم ملاحظة الشفاء التام.
2. ضع الفئران في قفص نظيف واملأ زجاجة الماء بالماء المليء بالمورفين (0.4 مجم / كجم) للتحكم اليومي في الألم بعد الشفاء.
3. يجب إعطاء الأدوية غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (مثل كاربروفين، 0.5 ملغم/كغ، الحقن تحت الجلد) للشفاء التام للفئران من آلام ما بعد الجراحة.

5. التقييم النسيجي

1. بعد أربعة أسابيع من الجراحة ، قم بتحفيز منعكس التبول عن طريق رفع ذيول الفئران. ضع الجرذ في صندوق القتل الرحيم ، وافتح صمام أنبوب نقل ثاني أكسيد الكربون₂ ، وقتل الفئران بشكل إنساني بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون₂.
2. أغلق الصمام بعد التأكد من أن الجرذ بلا حراك ولا يتنفس وملاحظة أن التلميذ متسع. استمر في مراقبة الحالة الجسدية للفأر لمدة دقيقتين للتأكد من نجاح القتل الرحيم.
3. أخرج الجرذ من صندوق القتل الرحيم.
4. نظف المنطقة الجراحية والمواد الجراحية بمناديل مبللة بالإيثانول بنسبة 75٪.
5. قم بتشريح البطن لمراقبة حالة ملء المثانة وحصاد مجرى البول بالكامل.
6. بعد حصاد مجرى البول ، ضع الجرذ في كيس مانع للتسرب وقم بتخزينه في ثلاجة 4 درجات مئوية للمعالجة من قبل فنيي المختبرات.
7. تقييم الولايات المتحدة من الناحية الشكلية لعلم الأمراض الجسيم ، مع التركيز على لون ونعومة الأنسجة.
8. تلطيخ أنسجة مجرى البول بالهيماتوكسيلين واليوزين (H&E) لتصور بنية الجرح وطبقة الخلايا البولية.
   1. اغمس الشرائح في الزيلين لإزالة البارافين (2 × 5 دقائق).
   2. أعد ترطيب الشرائح في الإيثانول بالترتيب (100٪ 1 × 3 دقائق ، 95٪ 1 × 3 دقائق ، 85٪ 1 × 3 دقائق ، 75٪ 1 × 3 دقائق).
   3. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (2 دقيقة).
   4. تلطخ الشرائح بالهيماتوكسيلين (10 دقائق).
   5. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (5 دقائق).
   6. ميز العينات بمحلول التمايز (40 ثانية).
   7. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (2 × 3 دقائق).
   8. تلطخ الشرائح باليوزين (2 دقيقة).
   9. أعد ترطيب الشرائح في الإيثانول بترتيب (100٪ 1 × 3 ثوان ، 95٪ 1 × 3 ثوان ، 85٪ 1 × 3 ثوان ، 75٪ 1 × 3 ثوان)
   10. اغمس الشرائح في 100٪ من الإيثانول (1 دقيقة) وقم بشفافية الشرائح بالزيلين (2 × 1 دقيقة).
   11. أضف بلسم محايد وأغلقه بالغطاء.
9. ضع صبغة ماسون ثلاثية الألوان على أنسجة مجرى البول لإبراز بنية ألياف الكولاجين.
   1. اغمس الشرائح في الزيلين لإزالة البارافين (2 × 5 دقائق).
   2. أعد ترطيب الشرائح في الإيثانول بالترتيب (100٪ 1 × 3 دقائق ، 95٪ 1 × 3 دقائق ، 85٪ 1 × 3 دقائق ، 75٪ 1 × 3 دقائق).
   3. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (2 دقيقة).
   4. تلطخ الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين الحديدي من Weigert (5 دقائق).
   5. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (5 دقائق).
   6. تلطخ الشرائح في Biebrich Scarlet-Acid Fucshin (5 دقائق).
   7. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (2 × 3 دقائق).
   8. تلطخ الشرائح بمحلول حمض الفوسفوروموليبديك (5 دقائق).
   9. ضع الشرائح في محلول الأنيلين الأزرق (5 دقائق). تجاهل الحل.
   10. اشطف الشرائح ، وجففها من خلال الكحول ، وقم بإزالتها في الزيلين.
   11. أضف بلسم محايد وأغلقه بالغطاء.
10. قم بإجراء تلطيخ التألق المناعي باستخدام جسم مضاد TGF-β لتقييم طبقة الخلايا البولية.
    1. أضف المخزن المؤقت المناسب لاسترجاع المستضد إلى قدر الضغط. ضع قدر الضغط على لوح التسخين وقم بتشغيله بكامل طاقته.
    2. بمجرد الغليان ، انقل الشرائح من ماء الصنبور إلى قدر الضغط. قم بتشغيل الماء البارد فوق الطباخ وقم بتسخين الشرائح لمدة 10 دقائق.
    3. قم بإيقاف تشغيل قدر الضغط وإزالة الشرائح. قم بتبريد الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة.
    4. اغسل الشرائح بمحلول PBS.
    5. ضع علامة على هوامش العينات بقلم مانع السائل.
    6. اغمس الشرائح في PBS بالإضافة إلى 0.3٪ Triton X-100 لمدة 30 دقيقة.
    7. اغسل الشرائح في PBS بتحريك لطيف (2 × 5 دقائق).
    8. ضعي مصل الماعز بنسبة 10٪ في PBS في درجة حرارة الغرفة (60 دقيقة).
    9. المخزن المؤقت لحجب الشفط واحتضانه بالجسم المضاد الأساسي عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    10. اغسل الشرائح باستخدام 1x PBS (3 × 5 دقائق).
    11. احتضان الجسم المضاد الثانوي المسمى بالفلوروكروم المخفف في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة.
    12. اغسل الشرائح باستخدام 1x PBS (3 × 3 دقائق).
    13. قم بتركيب الشرائح وإغلاقها.
11. امسح الشرائح الملطخة رقميا باستخدام هدف 40x في ماسح ضوئي للشرائح.
12. قم بتحليل الصور وقياس سمك اليوثريثيليوم باستخدام البرنامج المشار إليه (جدول المواد).
    1. افتح البرنامج.
    2. انقر فوق Local Computer لتحديد صور الشرائح الملونة.
    3. انقر فوق قياس المسافة لقياس سمك الظهارة البولية.
    4. سجل البيانات عن سمك الظهارة البولية.

النتائج

نجح البروتوكول الموضح في هذه الدراسة في إنشاء تضيق مستقر في مجرى البول في الفئران وأظهر قابلية عالية للتكاثر. كان متوسط مدة العمليات 20 دقيقة ، ولم تنشأ أي مشاكل فنية أثناء الإجراءات. تم حصاد عينات مجرى البول بنجاح بعد 4 أسابيع من العملية.

في المجموعة التجري...

Discussion

تشكل الولايات المتحدة عبئا كبيرا في مجال الرعاية الصحية له تأثير اقتصادي كبير ، مما يؤثر سلبا على كل من الصحة النفسية^{والجسدية 20}. لا تزال هناك حاجة لعلاج لا يعالجنا تماما فحسب ، بل يمنع تكراره بشكل فعال.

في هذه الدراسة ، استخدمنا نموذج الفئران ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable sutures (6-0)	KERONG COMPANY	KR2230814
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
CaseViewer 2.4	3DHISTECH Ltd.
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-2
H&E Stain Kit	Abcam	ab150669
high-frequency electrosurgical unit	Beijing Taktvoll Technology Company	ES-100v
Masson staining kit	Merck	HT15
needle-holding pliers	RWD Life Science	S15001-11
Paraffin oil	NA	NA
smooth forceps	RWD Life Science	F13019-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
suture scissors	RWD Life Science	S15001-11
Teflon coated catheter (0.6 mm x 1 mm)	DGZF new materials company	NA
TGF Beta 1 Polyclonal antibody	Proteintech	21898-1-AP
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14