סיכום פגיעה יאטרוגנית: טכניקת כריתה חשמלית למידול היצרות שופכה בחולדות

Summary

במחקר זה, אנו מציגים מודל חולדה חדשני, יעיל ויציב של היצרות שופכה שנוצר באמצעות כריתה חשמלית של שופכת החולדה, המדמה ביעילות פגיעה יאטרוגנית שנצפתה במסגרות קליניות.

Abstract

היצרות שופכה (US) היא מצב קליני שכיח באורולוגיה, המאופיין בשכיחות גבוהה ותחלואה בכל הגילאים. הטיפולים הנוכחיים ל-US, כגון הרחבת שופכה וכריתת שופכה פנימית, אינם מצליחים לפתור את המצב באופן מלא וקשורים לשיעורים גבוהים של הישנות וסיבוכים.

בנוסף, הפתוגנזה של US אינה מובנת היטב. כדי לחקור את הפתוגנזה של US ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, חיוני להקים מודל חולדה סטנדרטי המשקף במדויק את הביטויים הקליניים. מחקר זה מתאר שיטה פשוטה וניתנת לחזרה להשראת US בחולדות באמצעות סכין חשמלית בתדר גבוה. השיטה כוללת ביצוע חתך אורכי כאשר הסכין החשמלית מכוונת למצב חיתוך מעורב חד קוטבי ב-4 וואט, מה שגורם לנזק משמעותי לשופכה. ניתוח היסטופתולוגי מראה עיבוי של האורותליום, הסתננות דלקתית וסיבי קולגן לא מאורגנים. מודל זה משכפל ביעילות פגיעה יאטרוגנית באמצעות כריתה חשמלית בשופכת החולדה. לסיכום, מחקר זה מבסס בהצלחה מודל חולדה חדש, יעיל ויציב של US המחקה מקרוב את התרחיש הקליני, ומספק כלי רב ערך למחקר נוסף על המנגנונים והטיפולים החדשים ל-US.

Introduction

היצרות השופכה (US) היא בין המצבים האורולוגיים העתיקים ביותר וממשיכה להיות נפוצה מאוד. נתונים עדכניים מצביעים על כך שיש בין 229 ל-627 מקרים של US לכל 100,000 גברים¹. הסובלים מ-US חווים מגוון תסמינים כולל תסמינים בדרכי השתן התחתונות², כאב³ והפרעות בתפקוד המיני⁴. קיימים מספר טיפולים רפואיים, כגון כריתת שופכה, ניתוח שופכה והרחבה⁵. עם זאת, טיפולים אלה מסובכים לעתים קרובות על ידי נושאים כמו דימום, זיהום ובריחת שתן, התורמים לנטל המחלה ומציגים שיעורים משתנים של הישנות ^6,7. כתוצאה מכך, זיהוי הגישות הטיפוליות היעילות ביותר נותר אתגר קריטי המעסיק חוקרים וקלינאים.

US מאופיין בדרך כלל כהיצרות של השופכה הקדמית הנגרמת על ידי פיברוזיס וציקטריזציה של רירית השופכה ורקמת הספונגיוזום שמסביב⁸. למרות שכיחותו, הגורמים והמנגנונים העומדים בבסיס US אינם מובנים היטב, וחסרים מודלים מתאימים של בעלי חיים למחקר מעמיק. פגיעה יאטרוגנית, בעיקר מניתוח דרך השופכה, היא כיום הגורם המוביל ל-US, ומהווה 41% מהמקרים⁹. לכן, מודל אידיאלי של בעלי חיים למחקר בארה"ב צריך לשכפל במדויק פגיעות קליניות נפוצות, להפגין דמיון גנומי ופרוטאומי קרוב לבני אדם, ולהפגין יעילות ויציבות כאחד. מודל כזה יקל מאוד על חקירות מעמיקות יותר של הפתוגנזה של US ופיתוח טיפולים יעילים יותר.

כדי לחקור את התהליך והמנגנון הפתוגני של סוגים קליניים נפוצים, פותחו מודלים שונים של בעלי חיים באמצעות בעלי חיים גדולים כגון ארנבים^10,11, כלבים¹² וחזירים^13,14 תוך שימוש בטכניקות כמו קרישה חשמלית, אלקטרו-כריתה¹⁵ והזרקות בלאומיצין¹⁶. עם זאת, מודלים אלה מתמודדים לעתים קרובות עם אתגרים עקב מגבלות גודל המדגם והבדלים גנטיים מבני אדם. בנוסף, יש לקחת בחשבון את העלות-תועלת של שימוש בבעלי חיים גדולים; למרות העלויות הגבוהות הכרוכות בטיפול יומיומי, בעלי חיים גדולים נושאים גם סיכונים משמעותיים לזיהום, המחייבים טיפול נרחב לאחר הניתוח והוצאות ניכרות. מתועד היטב כי מכרסמים חולקים מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים עם בני אדם במערכות איברים רבות. מחקר שנערך לאחרונה הראה הומולוגיה בין תאי דרכי השתן של בעלי חיים מכרסמים ובני אדם¹⁷. יתר על כן, עלויות הרכישה, הדיור והטיפול לאחר הניתוח בחולדות נמוכות משמעותית מאלו של בעלי חיים גדולים¹⁸. כתוצאה מכך, מודל עכברוש של ארה"ב נחשב מתאים; עם זאת, התפתחותם של מודלים כאלה בחולדות לא תוארה כראוי.

מחקרים קודמים השתמשו בכלים כירורגיים כגון להבים או מחטים כדי לגרום ל-US במודלים של חולדות¹⁹. גישה זו נקשרה לסיכונים כמו פגיעה בכלי הדם סביב השופכה, מה שמוביל לדימום משמעותי. האופי הסובייקטיבי של הליכים כירורגיים אלה יכול גם לגרום לשונות בהיקף הפגיעה המכנית, ללא קריטריונים כמותיים למודל, מה שעשוי להשפיע על הערכת תוצאות תיקון השופכה במחקרים טיפוליים עוקבים.

בהתחשב בשיקולים אלה, יש צורך ברור בפיתוח מודל חולדות אמריקאי נוסף. כדי לבסס מודל אמריקאי יעיל, חסכוני ויציב בחולדות, השתמשנו במכונת סכינים חשמלית בתדר גבוה במחקר שלנו. מודל זה יאפשר חקירות נוספות של מנגנוני US והערכה של גישות טיפוליות חדשות לפני המשך הניסויים הקליניים.

Protocol

במחקר זה הועסקו עשרים חולדות ספראג-דולי זכרות בנות 6 חודשים, כל אחת במשקל 400-500 גרם. כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית החולים המסונף החמישי של אוניברסיטת סון יאט-סן (מספר אישור: 00349). החיות שוכנו במתקן עם תנאי טמפרטורה ותאורה מבוקרים. מאפיין בסיסי של היצרות השופכה הוא התפתחות הצטלקות בתוך השופכה. בהתבסס על ציר הזמן שנקבע להיווצרות צלקת, המתרחשת בדרך כלל תוך 4 שבועות מהפציעה, ייעדנו את נוכחותה של רקמת צלקת ניכרת בשופכה בסימן 4 שבועות לאחר הניתוח כנקודת הסיום של הניסוי.

1. הכנת מכשירים כירורגיים

1. הכן את החומרים הכירורגיים הבאים: קטטר מצופה טפלון (0.6 x 1 מ"מ), תפרים נספגים (6-0), מספריים לתפרים, מלקחיים לרקמות, צבת החזקת מחט, מלקחיים חלקים, יחידה אלקטרוכירורגית בתדר גבוה (איור 1), כולל הפאנל של הסכין החשמלית בתדר גבוה, סכין אלקטרוכירורגית אלקטרודה כירורגית בתדר גבוה והמוט המוליך האנאלי (ראה טבלת חומרים).
2. נקו את אזור הניתוח עם מגבוני אלכוהול המכילים 75% אתנול.
3. הכנה לשימוש בסכין חשמלית בתדר גבוה במצב חיתוך חשמלי חד קוטבי.
   1. חבר את הסכין החשמלית בתדר גבוה לאספקת החשמל הראשית של 220 וולט באמצעות כבל חשמל.
   2. הכנס את ידית הסכין המעוקרת הנשלטת ביד ואת המוט המוליך לשקעים שלהם (איור 1C).
      הערה: ודא שכל כבלי החשמל מחוברים היטב כדי לשמור על בטיחות הניתוח.

2. הכנת החיה

1. משכו את הנתרן פנטוברביטל (60 מ"ג/ק"ג) למזרק.
2. אבטח את החולדה על ידי אחיזת הזנב שלה ביד הדומיננטית והחזקת עור האוזניים והצוואר ביד הלא דומיננטית כדי להבטיח שהיא מקובעת היטב.
3. חשפו את הבטן התחתונה של החולדה וחטאו את האזור באמצעות כדורי צמר גפן ספוגים באתנול 75%.
4. הכנס את מחט המזרק כ-1-2 מ"מ ליד קו האמצע של הבטן התחתונה, וכוון אותה לחלל הבטן בזווית של 45 מעלות.
   הערה: תרגיש אובדן התנגדות כאשר המחט חודרת לצפק.
5. משוך בעדינות את בוכנת המזרק לאחור כדי לוודא שאין דם או נוזל במזרק.
6. יש להזריק לאט את הנתרן פנטוברביטל. משוך את המחט, השלם את ההזרקה וחטא את המקום שוב בכדורי צמר גפן ספוגים באתנול 75%.
7. עקוב אחר קצב הנשימה של החולדה וצבט את כפה האחורית כדי לבדוק אם יש רפלקסים.
   הערה: ודא שהנשימה של החולדה יציבה ושהיא לא מראה רפלקסים לפני שתמשיך בניתוח.
8. סוחטים את משחת האריתרומיצין וטובלים צמר גפן במשחה. מרחו את המשחה עם צמר גפן על קרניות שתי העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית במהלך ההליך.
9. השתמש במכונת גילוח חשמלית כדי לגלח את הבטן התחתונה והפרינאום לאחר אישור ההרדמה.
10. נגב שיער פזור מהאזור המגולח עם טישו רטוב במי מלח.
11. חטאו את האזור על ידי ניגובו פעמיים עם ספוג גזה ספוג ביודופור כדי למזער גירוי בעור.
12. הנח את החולדה המורדמת עמוק על כרית חימום המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס במצב שכיבה. הקפידו על סטריליות במהלך ההליכים הכירורגיים על ידי לבישת כפפות רפואיות.

3. הליך צנתור ופציעה בשופכה

1. הכניסו את המוט המוליך לפי הטבעת של החולדה כדי ליצור מעגל יעיל בלולאה סגורה עבור מכונת הסכינים החשמלית בתדר גבוה (איור 2A).
2. צנתר את השופכה של החולדה כדי לסייע במיקום ולספק תמיכה במהלך שלבי העיבוד של הניתוח.
   1. יש לשמן את קטטר השתן בשמן פרפין.
   2. חשוף את הפין על ידי סחיטת העור סביבו כדי לבלוט אותו מהבטן.
   3. יש לחטא את איבר המין של החולדה בעזרת ספוג גזה ספוג ביודופור.
   4. פתח בעדינות את פתח השופכה בעזרת מלקחיים חלקים והכנס את הקטטר המשומן לשופכה.
   5. הכנס בזהירות את הצנתר המצופה טפלון לשופכה בקצב התכווצות השופכה; הימנע מכל החדרה בכוח (איור 2B).
   6. אם נתקלים בהתנגדות, משכו בעדינות את הפין לכיוון הגחון כדי להתאים את זווית הכיפוף של הפין, והמשיכו לקדם את הקטטר לתוך שלפוחית השתן עד שהשתן יזרום החוצה (איור 2C).
   7. אשר צנתור מוצלח על ידי הקפדה על יצירת זווית של 45 מעלות עם הבטן (איור 2D).
3. הפעל את מכונת הסכינים החשמלית בתדר גבוה, לחץ על הכפתורים של לוח הסכינים בתדר גבוה כדי לבחור את מצב החיתוך המעורב החד-קוטבי, והגדר את ההספק ל-4 וואט עבור השלבים הבאים של כריתה חשמלית של הפין שכבה אחר שכבה.
4. יישר את החתך עם הצנתר. לחצו על הכפתור הצהוב על ידית הסכין האלקטרו-כירורגית ובצעו חתך לאורך קו סימון הצנתר מעור הפין לשכבה החיצונית של השופכה באמצעות הסכין החשמלית עד לחשיפת השופכה (איור 3A,B).
   הערה: הקפד ללחוץ על הכפתור הצהוב לכריתה חשמלית, ולא על הכפתור הכחול לקרישה חשמלית.
5. המשיכו לבצע חתך אורכי של 0.5 ס"מ בשופכה בעזרת הסכין החשמלית, תוך הקפדה על קוטר רוחבי של 0.1 ס"מ, עד שהקטטר נראה לעין (איור 3C).
6. לתפור את הפצע ואת העור השטחי שכבה אחר שכבה באמצעות תפרים נספגים (6-0) עם תפרים רציפים או קטועים (איור 3D,E).
7. הסר את קטטר השופכה ומקם מחדש את הפין (איור 3F).
8. כבה את הסכין החשמלית בתדר גבוה והסר את המוט המוליך מפי הטבעת של החולדה.
9. נקו את חומרי הניתוח עם מגבוני אלכוהול (75% אתנול).

4. טיפול לאחר הניתוח

1. הניחו את החולדה על כרית מחוממת (37 מעלות צלזיוס) ועקבו מקרוב אחר התאוששותה מההרדמה. שימו לב היטב למצבה הגופני של החולדה, כולל קצב הנשימה, טמפרטורת הגוף ורמת ההכרה.
   הערה: אין להחזיר את החולדה לכלוב שלה עד להחלמה מלאה.
2. הכניסו את החולדות לכלוב נקי ומלאו את בקבוק המים במים עם מורפיום (0.4 מ"ג/ק"ג) לטיפול יומיומי בכאב לאחר ההחלמה.
3. מתן תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות (כגון קרפרופן, 0.5 מ"ג/ק"ג, זריקה תת עורית) להחלמה מלאה של החולדות מכאבים לאחר הניתוח.

5. הערכה היסטולוגית

1. ארבעה שבועות לאחר הניתוח, הפעילו את רפלקס המיקטוריציה על ידי הרמת זנבות החולדות. הנח את החולדה בקופסת המתת חסד, פתח את שסתום צינור ההולכה CO₂ והורד את החולדות באופן אנושי עם מנת יתר של CO₂.
2. כבה את השסתום לאחר שווידאת שהחולדה חסרת תנועה ואינה נושמת והתבוננת שהאישון מורחב. המשך להתבונן במצבה הגופני של החולדה במשך 2 דקות כדי לאשר שהמתת החסד הצליחה.
3. הוציאו את החולדה מקופסת המתת החסד.
4. נקו את אזור הניתוח וחומרי הניתוח עם מגבונים ספוגים באתנול 75%.
5. נתח את הבטן כדי להתבונן במצב מילוי שלפוחית השתן ולקצור את כל השופכה.
6. לאחר קציר השופכה מכניסים את החולדה לשקית איטום ומאחסנים אותה במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לעיבוד על ידי טכנאי מעבדה.
7. להעריך מורפולוגית את ארה"ב לפתולוגיה גסה, תוך התמקדות בצבע והחלקות של הרקמה.
8. צבעו את רקמת השופכה בהמטוקסילין ואאוזין (H&E) כדי להמחיש את מבנה הפצע ושכבת תאי השתן.
   1. טובלים את השקופיות בקסילן לדפרפיניזציה (2 x 5 דקות).
   2. לחות את השקופיות באתנול לפי הסדר (100% 1 x 3 דקות, 95% 1 x 3 דקות, 85% 1 x 3 דקות, 75% 1 x 3 דקות).
   3. שוטפים את המגלשות במים נטולי יונים (2 דקות).
   4. מכתים את השקופיות בהמטוקסילין (10 דקות).
   5. שוטפים את המגלשות במים נטולי יונים (5 דקות).
   6. הבדיל בין הדגימות עם תמיסת בידול (40 שניות).
   7. שטפו את המגלשות במים נטולי יונים (2 x 3 דקות).
   8. הכתים את השקופיות באאוזין (2 דקות).
   9. לחות מחדש את השקופיות באתנול בסדר (100% 1 x 3 שניות, 95% 1 x 3 שניות, 85% 1 x 3 שניות, 75% 1 x 3 שניות)
   10. טובלים את השקופיות ב-100% אתנול (דקה אחת) ושקופים את השקופיות עם קסילן (2 x 1 דקה).
   11. הוסף בלזם ניטרלי ואוטם עם הכיסוי.
9. מרחו את כתם הטריכרום של מאסון על רקמת השופכה כדי להדגיש את מבנה סיבי הקולגן.
   1. טובלים את השקופיות בקסילן לדפרפיניזציה (2 x 5 דקות).
   2. לחות את השקופיות באתנול לפי הסדר (100% 1 x 3 דקות, 95% 1 x 3 דקות, 85% 1 x 3 דקות, 75% 1 x 3 דקות).
   3. שוטפים את המגלשות במים נטולי יונים (2 דקות).
   4. מכתימים את השקופיות בתמיסת המטוקסילין ברזל של וייגרט (5 דקות).
   5. שוטפים את המגלשות במים נטולי יונים (5 דקות).
   6. מכתים את השקופיות בביבריך סקרלט-חומצה פוקשין (5 דקות).
   7. שטפו את המגלשות במים נטולי יונים (2 x 3 דקות).
   8. מכתים את השקופיות בתמיסת חומצה פוספומוליבדית (5 דקות).
   9. יש להניח את השקופיות בתמיסת אנילין כחול (5 דקות). זרוק את התמיסה.
   10. שוטפים את המגלשות, מייבשים באמצעות אלכוהול ומנקים בקסילן.
   11. הוסף בלזם ניטרלי ואוטם עם הכיסוי.
10. בצע צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדן TGF-β כדי להעריך את שכבת התאים האורותליים.
    1. הוסף את מאגר אחזור האנטיגן המתאים לסיר הלחץ. הנח את סיר הלחץ על משטח החימום והפעל אותו במלוא העוצמה.
    2. לאחר הרתיחה, העבירו את השקופיות ממי הברז לסיר הלחץ. העבירו מים קרים על הכיריים וחממו את המגלשות למשך 10 דקות.
    3. כבה את סיר הלחץ והסר את השקופיות. מצננים את השקופיות לטמפרטורת החדר.
    4. שוטפים את השקופיות בתמיסת PBS.
    5. סמן את שולי הדגימות בעט חוסם נוזלים.
    6. טבלו את השקופיות ב-PBS בתוספת 0.3% Triton X-100 למשך 30 דקות.
    7. שטפו את השקופיות ב-PBS עם תסיסה עדינה (2 x 5 דקות).
    8. חסום 10% סרום עיזים ב- PBS בטמפרטורת החדר (60 דקות).
    9. שאפו את המאגר החוסם ודגרו עם נוגדן ראשוני בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    10. שטפו את השקופיות עם 1x PBS (3 x 5 דקות).
    11. דגירה עם נוגדן משני המסומן בפלואורוכרום מדולל במאגר דילול נוגדנים.
    12. שטפו את השקופיות עם 1x PBS (3 x 3 דקות).
    13. הרכיב ואטום את המגלשות.
11. סרוק דיגיטלית את השקופיות המוכתמות באמצעות אובייקט פי 40 בסורק שקופיות.
12. נתח את התמונות ומדוד את עובי האורותליום באמצעות התוכנה המוזכרת (טבלת חומרים).
    1. פתח את התוכנה.
    2. לחץ על מחשב מקומי כדי לבחור את תמונות השקופיות המוכתמות.
    3. לחצו על 'מדוד מרחק ' כדי למדוד את עובי האורותליום.
    4. רשום את הנתונים על עובי האורותליום.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר במחקר זה ביסס בהצלחה היצרות שופכה יציבה בחולדות והוכיח יכולת שחזור גבוהה. משך הניתוחים הממוצע היה 20 דקות, ולא התעוררו בעיות טכניות במהלך ההליכים. דגימות שופכה נקטפו בהצלחה 4 שבועות לאחר ההליך.

בקבוצת הניסוי, שלפוחית השתן של החולדות הראתה ?...

Discussion

ארה"ב מהווה נטל בריאותי משמעותי עם השפעה כלכלית משמעותית, המשפיעה לרעה על הרווחה הפסיכולוגית והפיזית²⁰. עדיין יש צורך בטיפול שלא רק מרפא אותנו לחלוטין אלא גם מונע ביעילות את הישנותה.

במחקר זה, השתמשנו במודל חולדה כדי לפתח שיטה פשוטה וניתנת לשח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable sutures (6-0)	KERONG COMPANY	KR2230814
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
CaseViewer 2.4	3DHISTECH Ltd.
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-2
H&E Stain Kit	Abcam	ab150669
high-frequency electrosurgical unit	Beijing Taktvoll Technology Company	ES-100v
Masson staining kit	Merck	HT15
needle-holding pliers	RWD Life Science	S15001-11
Paraffin oil	NA	NA
smooth forceps	RWD Life Science	F13019-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
suture scissors	RWD Life Science	S15001-11
Teflon coated catheter (0.6 mm x 1 mm)	DGZF new materials company	NA
TGF Beta 1 Polyclonal antibody	Proteintech	21898-1-AP
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14