Résumé des lésions iatrogènes : technique d’électroexcision pour la modélisation du rétrécissement urétral chez le rat

Résumé

Dans cette étude, nous présentons un modèle nouveau, efficace et stable de rétrécissement urétral chez le rat, créé par électroexcision de l’urètre chez le rat, qui simule efficacement les lésions iatrogènes observées en milieu clinique.

Résumé

Le rétrécissement de l’urètre est une affection clinique courante en urologie, caractérisée par une prévalence et une morbidité élevées à tous les âges. Les traitements actuels de l’échographie, tels que la dilatation urétrale et l’urétrotomie interne, ne parviennent pas à résoudre complètement la maladie et sont associés à des taux élevés de récidive et de complications.

De plus, la pathogenèse de l’échographie n’est pas bien comprise. Pour explorer la pathogenèse de l’échographie et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est crucial d’établir un modèle de rat standardisé qui reflète avec précision les manifestations cliniques. Cette étude décrit une méthode simple et reproductible pour induire l’échographie chez les rats à l’aide d’un couteau électrique à haute fréquence. La méthode consiste à faire une incision longitudinale avec le couteau électrique réglé sur un mode de coupe mixte unipolaire à 4 W, ce qui inflige des dommages urétraux importants. L’analyse histopathologique montre un épaississement de l’urothélium, une infiltration inflammatoire et des fibres de collagène désorganisées. Ce modèle reproduit efficacement les lésions iatrogènes par électroexcision dans l’urètre du rat. En résumé, cette étude a réussi à établir un nouveau modèle de rat efficace et stable de l’échographie qui imite étroitement le scénario clinique, fournissant un outil précieux pour la recherche ultérieure sur les mécanismes et les nouveaux traitements de l’échographie par échographie.

Introduction

Le rétrécissement urétral (US) est l’une des affections urologiques les plus anciennes et continue d’être largement répandu. Des données récentes suggèrent qu’il y a entre 229 et 627 cas d’échographies pour 100 000 hommes¹. Les personnes souffrant d’échographie, qui souffrent d’échographie, présentent une gamme de symptômes, notamment des symptômes des voies urinaires inférieures², une douleur³ et un dysfonctionnement sexuel⁴. Plusieurs traitements médicaux sont disponibles, tels que l’urétrotomie, l’urétroplastie et la dilatation⁵. Cependant, ces traitements sont souvent compliqués par des problèmes tels que les saignements, les infections et l’incontinence, ce qui contribue au fardeau de la maladie et présente des taux variables de récidive ^6,7. Par conséquent, l’identification des approches thérapeutiques les plus efficaces reste un défi crucial pour les chercheurs et les cliniciens.

L’échographie est généralement caractérisée par un rétrécissement de l’urètre antérieur causé par une fibrose et une cicatrisation de la muqueuse urétrale et du tissu spongieux environnant⁸. Malgré sa prévalence, les causes et les mécanismes sous-jacents à l’échographie sont mal compris, et il y a un manque de modèles animaux appropriés pour une étude approfondie. Les lésions iatrogènes, principalement dues à la chirurgie transurétrale, sont actuellement la principale cause d’échographie, représentant 41 % des cas⁹. Par conséquent, un modèle animal idéal pour la recherche américaine devrait reproduire avec précision les lésions cliniques courantes, présenter des similitudes génomiques et protéomiques étroites avec les humains et démontrer à la fois l’efficacité et la stabilité. Un tel modèle faciliterait grandement des investigations plus approfondies sur la pathogenèse de l’échographie et le développement de traitements plus efficaces.

Pour étudier le processus pathogène et le mécanisme des types cliniques courants, divers modèles animaux ont été développés en utilisant de grands animaux tels que des lapins^10,11, des chiens¹² et des porcs^13,14 en utilisant des techniques telles que l’électrocoagulation, l’électrorésection¹⁵ et les injections de bléomycine¹⁶. Cependant, ces modèles sont souvent confrontés à des défis en raison des limites de taille des échantillons et des différences génétiques avec les humains. De plus, il faut tenir compte de la rentabilité de l’utilisation de gros animaux ; Malgré les coûts élevés associés aux soins quotidiens, les grands animaux présentent également des risques importants d’infection, nécessitant des soins postopératoires importants et des dépenses considérables. Il est bien documenté que les rongeurs partagent des caractéristiques physiologiques et pathologiques avec les humains dans de nombreux systèmes organiques. Une étude récente a montré une homologie entre les cellules des voies urinaires des rongeurs et des humains¹⁷. De plus, les coûts d’achat, de logement et de soins postopératoires des rats sont nettement inférieurs à ceux des grands animaux¹⁸. Par conséquent, un modèle de rat des États-Unis est jugé approprié ; Cependant, le développement de tels modèles chez le rat n’a pas été décrit de manière adéquate.

Des études antérieures ont utilisé des outils chirurgicaux tels que des lames ou des aiguilles pour induire l’échographie chez des modèles de rats¹⁹. Cette approche a été associée à des risques tels que l’endommagement des vaisseaux sanguins périurétraux, entraînant des saignements importants. La nature subjective de ces interventions chirurgicales peut également entraîner une variabilité de l’étendue des lésions mécaniques, en l’absence de critères quantitatifs pour la modélisation, ce qui peut affecter l’évaluation des résultats de la réparation de l’urètre dans les études thérapeutiques ultérieures.

Compte tenu de ces considérations, il est clairement nécessaire de développer un modèle supplémentaire de rat américain. Pour établir un modèle américain efficace, rentable et stable chez les rats, nous avons utilisé une machine à couteau électrique à haute fréquence dans nos recherches. Ce modèle facilitera la poursuite des investigations sur les mécanismes de l’échographie et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques avant de passer aux essais cliniques.

Protocole

Dans cette enquête, vingt rats Sprague-Dawley mâles de 6 mois, pesant chacun de 400 à 500 g, ont été utilisés. Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du cinquième hôpital affilié de l’Université Sun Yat-Sen (numéro d’approbation : 00349). Les animaux ont été logés dans une installation où la température et les conditions d’éclairage étaient contrôlées. Une caractéristique fondamentale du rétrécissement de l’urètre est le développement de cicatrices dans l’urètre. Sur la base de la chronologie établie pour la formation de cicatrices, qui se produit généralement dans les 4 semaines suivant la blessure, nous avons désigné la présence de tissu cicatriciel discernable dans l’urètre à la marque postopératoire de 4 semaines comme critère d’évaluation expérimental.

1. Préparation des instruments chirurgicaux

1. Préparez le matériel chirurgical suivant : cathéter recouvert de téflon (0,6 x 1 mm), sutures résorbables (6-0), ciseaux à suture, pince à tissus, pince porte-aiguille, pince lisse, unité électrochirurgicale à haute fréquence (figure 1), y compris le panneau du couteau électrique à haute fréquence, l’électrode chirurgicale, le couteau électrochirurgical à haute fréquence et la tige conductrice anale (voir le tableau des matériaux).
2. Nettoyez la zone chirurgicale avec des lingettes imbibées d’alcool contenant 75 % d’éthanol.
3. Préparation à l’utilisation d’un couteau électrique à haute fréquence en mode de coupe électrique unipolaire.
   1. Connectez le couteau électrique haute fréquence à l’alimentation principale 220 V mise à la terre à l’aide d’un cordon d’alimentation.
   2. Insérez le manche du couteau stérilisé à commande manuelle et la tige conductrice dans leurs douilles respectives (Figure 1C).
      REMARQUE : Assurez-vous que tous les câbles d’alimentation sont correctement connectés pour maintenir la sécurité de la chirurgie.

2. Préparation de l’animal

1. Prélevez le pentobarbital sodique (60 mg/kg) dans une seringue.
2. Sécurisez le rat en saisissant sa queue avec la main dominante et en tenant la peau de ses oreilles et de son cou avec la main non dominante pour s’assurer qu’il est fermement fixé.
3. Exposez le bas-ventre du rat et désinfectez la zone à l’aide de boules de coton imbibées d’éthanol à 75 %.
4. Insérez l’aiguille de la seringue à environ 1 à 2 mm à côté de la ligne médiane abdominale dans la partie inférieure de l’abdomen, en la dirigeant dans la cavité abdominale à un angle de 45°.
   REMARQUE : Vous ressentirez une perte de résistance lorsque l’aiguille pénètre dans le péritoine.
5. Tirez doucement sur le piston de la seringue pour vous assurer qu’il n’y a pas de sang ou de liquide dans la seringue.
6. Injectez lentement le pentobarbital sodique. Retirez l’aiguille, terminez l’injection, et désinfectez à nouveau le site avec des boules de coton imbibées d’éthanol à 75 %.
7. Surveillez le rythme respiratoire du rat et pincez sa patte arrière pour vérifier s’il a des réflexes.
   REMARQUE : Confirmez que la respiration du rat est régulière et qu’il ne présente aucun réflexe avant de procéder à la chirurgie.
8. Pressez la pommade à l’érythromycine et trempez un coton-tige dans la pommade. Appliquez la pommade avec le coton-tige sur les cornées des deux yeux pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la procédure.
9. Utilisez un rasoir électrique pour raser le bas-ventre et le périnée après la confirmation de l’anesthésie.
10. Essuyez les cheveux lâches de la zone rasée avec un mouchoir imbibé de solution saline.
11. Désinfectez la zone en l’essuyant deux fois avec une éponge de gaze imbibée d’iodophor pour minimiser l’irritation de la peau.
12. Placez le rat profondément anesthésié sur un coussin chauffant réglé à 37°C en position couchée. Assurez la stérilité pendant les interventions chirurgicales en portant des gants médicaux.

3. Cathétérisme urétral et procédure de blessure

1. Insérez la tige conductrice dans l’anus du rat afin d’établir un circuit en boucle fermée efficace pour la machine à couteaux électriques à haute fréquence (Figure 2A).
2. Cathétériser l’urètre du rat pour aider au positionnement et fournir un soutien pendant les étapes de post-traitement de la chirurgie.
   1. Lubrifiez le cathéter urinaire avec de l’huile de paraffine.
   2. Exposez le pénis en pressant la peau qui l’entoure pour le faire saillir de l’abdomen.
   3. Désinfectez le pénis du rat avec une éponge de gaze imbibée d’iodophore.
   4. Ouvrez doucement l’orifice de l’urètre à l’aide d’une pince lisse et insérez le cathéter lubrifié dans l’urètre.
   5. Insérez soigneusement le cathéter recouvert de téflon dans l’urètre en suivant le rythme de contraction de l’urètre ; éviter toute insertion forcée (Figure 2B).
   6. En cas de résistance, tirez doucement le pénis vers le côté ventral pour ajuster l’angle de flexion du pénis et continuez à faire avancer le cathéter dans la vessie jusqu’à ce que l’urine s’écoule (Figure 2C).
   7. Confirmez que le cathétérisme a réussi en vous assurant que le pénis forme un angle d’environ 45° avec l’abdomen (figure 2D).
3. Allumez la machine à couteaux électriques à haute fréquence, cliquez sur les boutons du panneau de couteaux à haute fréquence pour sélectionner le mode de coupe mixte unipolaire et réglez la puissance sur 4 W pour les étapes suivantes d’électro-excisation du pénis couche par couche.
4. Alignez l’incision avec le cathéter. Appuyez sur le bouton jaune du manche du couteau électrochirurgical et faites une incision le long de la ligne de marquage du cathéter entre la peau du pénis et la couche externe de l’urètre à l’aide du couteau électrique jusqu’à ce que l’urètre soit exposé (Figure 3A,B).
   REMARQUE : Assurez-vous d’appuyer sur le bouton jaune pour l’électroexcision, et non sur le bouton bleu pour l’électrocoagulation.
5. Continuez à faire une incision longitudinale de 0,5 cm dans l’urètre avec le couteau électrique, en assurant un diamètre transversal de 0,1 cm, jusqu’à ce que le cathéter soit visible (Figure 3C).
6. Suturez la plaie et la peau superficielle couche par couche à l’aide de sutures résorbables (6-0) avec des points de suture continus ou interrompus (Figure 3D,E).
7. Retirez le cathéter urétral et repositionnez le pénis (Figure 3F).
8. Éteignez le couteau électrique à haute fréquence et retirez la tige conductrice de l’anus du rat.
9. Nettoyez le matériel chirurgical avec des lingettes à base d’alcool (75 % d’éthanol).

4. Soins postopératoires

1. Placez le rat sur un tampon chauffé (37 °C) et surveillez de près sa récupération de l’anesthésie. Portez une attention particulière à l’état physique du rat, y compris le rythme respiratoire, la température corporelle et le niveau de conscience.
   REMARQUE : Ne remettez pas le rat dans sa cage tant qu’il n’a pas complètement récupéré.
2. Hébergez les rats dans une cage propre et remplissez la bouteille d’eau avec de l’eau enrichie en morphine (0,4 mg/kg) pour la gestion quotidienne de la douleur après la guérison.
3. Administrer des anti-inflammatoires non stéroïdiens (tels que le carprofène, 0,5 mg/kg, injection sous-cutanée) pour que les rats se rétablissent complètement de la douleur postopératoire.

5. Évaluation histologique

1. Quatre semaines après l’opération, induisez le réflexe de miction en soulevant la queue des rats. Placez le rat dans une boîte d’euthanasie, ouvrez le robinet du tuyau de transmission de CO₂ et euthanasiez sans cruauté les rats présentant une surdose de CO₂.
2. Fermez la valve après avoir vérifié que le rat est immobile et ne respire pas et observé que la pupille est dilatée. Continuez à observer l’état physique du rat pendant 2 min pour confirmer que l’euthanasie a réussi.
3. Retirez le rat de la boîte d’euthanasie.
4. Nettoyez la zone chirurgicale et le matériel chirurgical avec des lingettes imbibées d’éthanol à 75 %.
5. Disséquez l’abdomen pour observer l’état de remplissage de la vessie et prélevez l’urètre entier.
6. Après avoir récolté l’urètre, mettez le rat dans un sac scellé et conservez-le dans un réfrigérateur à 4 °C pour être traité par des techniciens de laboratoire.
7. Évaluer morphologiquement les États-Unis pour la pathologie macroscopique, en se concentrant sur la couleur et la douceur du tissu.
8. Teindre le tissu de l’urètre avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) pour visualiser la structure de la plaie et la couche de cellules urothéliales.
   1. Trempez les lames dans du xylène pour la déparaffinisation (2 x 5 min).
   2. Réhydratez les lames dans l’éthanol dans l’ordre (100 % 1 x 3 min, 95 % 1 x 3 min, 85 % 1 x 3 min, 75 % 1 x 3 min).
   3. Lavez les lames à l’eau déminéralisée (2 min).
   4. Colorer les lames avec de l’hématoxyline (10 min).
   5. Lavez les lames à l’eau déminéralisée (5 min).
   6. Différencier les échantillons avec la solution de différenciation (40 s).
   7. Lavez les lames à l’eau déminéralisée (2 x 3 min).
   8. Teintez les lames avec de l’éosine (2 min).
   9. Réhydrater les lames dans de l’éthanol dans un ordre (100 % 1 x 3 s, 95 % 1 x 3 s, 85 % 1 x 3 s, 75 % 1 x 3 s)
   10. Trempez les lames dans de l’éthanol à 100 % (1 min) et transparentisez les lames avec du xylène (2 x 1 min).
   11. Ajouter le baume neutre et sceller avec la lamelle.
9. Appliquez la coloration trichrome de Masson sur le tissu de l’urètre pour mettre en valeur la structure des fibres de collagène.
   1. Trempez les lames dans du xylène pour la déparaffinisation (2 x 5 min).
   2. Réhydratez les lames dans l’éthanol dans l’ordre (100 % 1 x 3 min, 95 % 1 x 3 min, 85 % 1 x 3 min, 75 % 1 x 3 min).
   3. Lavez les lames à l’eau déminéralisée (2 min).
   4. Teindre les lames dans la solution d’hématoxyline de fer de Weigert (5 min).
   5. Lavez les lames à l’eau déminéralisée (5 min).
   6. Teindre les lames avec du Fucshin Biebrich Scarlet-Acid (5 min).
   7. Lavez les lames à l’eau déminéralisée (2 x 3 min).
   8. Colorer les lames avec une solution d’acide phosphomolybdique (5 min).
   9. Placer les lames dans une solution de bleu d’aniline (5 min). Jeter la solution.
   10. Rincez les lames, déshydratez-les à l’alcool et éclaircissez-les au xylène.
   11. Ajouter le baume neutre et sceller avec la lamelle.
10. Effectuer une coloration par immunofluorescence à l’aide d’un anticorps β TGF-pour évaluer la couche de cellules urothéliales.
    1. Ajoutez le tampon de récupération d’antigène approprié dans l’autocuiseur. Placez l’autocuiseur sur la plaque chauffante et allumez-le à pleine puissance.
    2. Une fois à ébullition, transférez les lames de l’eau du robinet dans l’autocuiseur. Faites couler de l’eau froide sur la cuisinière et chauffez les lames pendant 10 min.
    3. Éteignez l’autocuiseur et retirez les glissières. Refroidissez les lames à température ambiante.
    4. Lavez les lames avec la solution PBS.
    5. Marquez les marges des échantillons avec un stylo bloqueur de liquide.
    6. Trempez les diapositives dans du PBS plus 0,3 % de Triton X-100 pendant 30 min.
    7. Lavez les lames dans du PBS en agitant doucement (2 x 5 min).
    8. Bloquer dans du sérum de chèvre à 10 % dans du PBS à température ambiante (60 min).
    9. Aspirer le tampon bloquant et incuber avec l’anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit.
    10. Lavez les lames avec 1x PBS (3 x 5 min).
    11. Incuber avec un anticorps secondaire marqué au fluorochrome dilué dans un tampon de dilution d’anticorps.
    12. Lavez les lames avec 1x PBS (3 x 3 min).
    13. Montez et scellez les lames.
11. Numérisez numériquement les lames colorées à l’aide d’un objectif 40x dans un scanner de diapositives.
12. Analyser les images et mesurer l’épaisseur de l’urothélium à l’aide du logiciel référencé (Table des Matériaux).
    1. Ouvrez le logiciel.
    2. Cliquez sur Ordinateur local pour sélectionner les images de diapositives colorées.
    3. Cliquez sur Mesurer la distance pour mesurer l’épaisseur de l’urothélium.
    4. Enregistrez les données sur l’épaisseur de l’urothélium.

Résultats

Le protocole décrit dans cette étude a permis d’établir une sténose urétrale stable chez le rat et a démontré une reproductibilité élevée. La durée moyenne des opérations était de 20 min, et aucun problème technique n’est survenu au cours des procédures. Les échantillons urétraux ont été prélevés avec succès 4 semaines après l’intervention.

Dans le groupe expérimental, les vessies des rats présentaient des signes de surdistension...

Discussion

Les États-Unis représentent un fardeau important pour les soins de santé avec un impact économique substantiel, affectant négativement le bien-être psychologique et physique²⁰. Il est toujours nécessaire de mettre au point un traitement qui non seulement guérit complètement l’échographie, mais qui prévient également efficacement sa récidive.

Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle de rat pour développer une mé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable sutures (6-0)	KERONG COMPANY	KR2230814
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
CaseViewer 2.4	3DHISTECH Ltd.
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-2
H&E Stain Kit	Abcam	ab150669
high-frequency electrosurgical unit	Beijing Taktvoll Technology Company	ES-100v
Masson staining kit	Merck	HT15
needle-holding pliers	RWD Life Science	S15001-11
Paraffin oil	NA	NA
smooth forceps	RWD Life Science	F13019-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
suture scissors	RWD Life Science	S15001-11
Teflon coated catheter (0.6 mm x 1 mm)	DGZF new materials company	NA
TGF Beta 1 Polyclonal antibody	Proteintech	21898-1-AP
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14