医原性損傷の再現:ラットの尿道狭窄モデリングのための電気切除技術

要約

この研究では、ラット尿道の電気切除によって作成された尿道狭窄の新しく効率的で安定したラットモデルを提示します。これは、臨床現場で観察される医原性損傷を効果的にシミュレートします。

要約

尿道狭窄 (US) は、泌尿器科で一般的な臨床状態であり、すべての年齢で高い有病率と罹患率を特徴としています。尿道拡張術や内尿道切開術など、現在の米国の治療法は、状態を完全に解決することができず、高い再発率と合併症に関連しています。

さらに、米国の病因はよく理解されていません。米国の病因を探り、新たな治療戦略を開発するためには、臨床症状を正確に反映する標準化されたラットモデルを確立することが重要です。この研究では、高周波電動ナイフを使用してラットにUSを誘導するための簡単で再現性のある方法を概説しています。この方法では、電動ナイフを4Wのユニポーラ混合切断モードに設定して縦方向に切開しますが、これは重大な尿道損傷を与えます。病理組織学的解析では、尿路上皮の肥厚、炎症性浸潤、および無秩序なコラーゲン線維が示されています。このモデルは、ラット尿道の電気切除を通じて医原性損傷を効果的に再現します。要約すると、この研究は、臨床シナリオを厳密に模倣した、新しく効率的で安定した米国のラットモデルを確立することに成功し、米国のメカニズムと新しい治療法に関するさらなる研究のための貴重なツールを提供します。

概要

尿道狭窄(US)は、最も古い泌尿器科疾患の1つであり、引き続き広く蔓延しています。最近のデータによると、男性10万人あたり229〜627人の米国人症例がいます¹。米国に苦しんでいる人は、下部尿路症状²、痛み³、性機能障害⁴など、さまざまな症状を経験します。尿道切開術、尿道形成術、拡張^術5など、いくつかの治療が利用可能です。しかし、これらの治療法は、出血、感染症、失禁などの問題によって複雑になることが多く、病気の負担の一因となり、さまざまな再発率を示します^6,7。したがって、最も効果的な治療アプローチを特定することは、研究者や臨床医を関与させる重要な課題であり続けています。

USは一般に、尿道粘膜および周囲の海^{綿状組織の}線維化および瘢痕化によって引き起こされる前尿道の狭窄として特徴付けられる8。その蔓延にもかかわらず、米国の根底にある原因とメカニズムは十分に理解されておらず、詳細な研究に適した動物モデルが不足しています。主に経尿道的手術による医原性損傷は、現在、米国の主要な原因であり、症例の 41% を占めています⁹。したがって、米国の研究にとって理想的な動物モデルは、一般的な臨床的損傷を正確に再現し、ヒトと密接なゲノムおよびプロテオミクスの類似性を示し、効率と安定性の両方を実証する必要があります。このようなモデルは、米国の病因に関するより深い調査と、より効果的な治療法の開発を大いに促進するでしょう。

一般的な臨床型の病原性プロセスとメカニズムを調査するために、ウサギ^10,11、イヌ¹²、ブタ^13,14などの大型動物を用いて、電気凝固、電気切除¹⁵、ブレオマイシン注射¹⁶などの技術を用いて、種々の動物モデルが開発されてきた.しかし、これらのモデルは、サンプルサイズの制限やヒトとの遺伝的な違いにより、しばしば課題に直面します。さらに、大型動物を使用することの費用対効果を考慮する必要があります。日常のケアには高額な費用がかかりますが、大型動物は感染のリスクも大きく、広範な術後ケアと多額の費用が必要です。 げっ歯類は、多くの臓器系で人間と生理学的および病理学的特性を共有していることは十分に文書化されています。最近の研究では、げっ歯類の動物とヒトの尿路細胞との間の相同性が示されている¹⁷。さらに、ラットの購入、住居、および術後ケアの費用は、大型動物の費用よりも大幅に低い¹⁸。したがって、米国のラットモデルが適切であると見なされます。しかし、ラットにおけるそのようなモデルの発達は十分に説明されていません。

以前の研究では、ブレードや針などの手術器具を使用して、ラットモデル¹⁹でUSを誘導しています。このアプローチは、尿道周囲血管を損傷し、重大な出血を引き起こすなどのリスクと関連しています。これらの外科的処置の主観的な性質は、機械的損傷の程度にばらつきをもたらす可能性があり、モデリングの定量的基準が欠けており、その後の治療研究における尿道修復結果の評価に影響を与える可能性があります。

これらの考慮事項を考慮すると、追加の米国ラットモデルを開発する必要があることは明らかです。ラットにおいて効率的で費用対効果が高く、安定した米国モデルを確立するために、私たちは高周波電動ナイフマシンを研究に採用しました。このモデルは、臨床試験に進む前に、米国のメカニズムと新しい治療アプローチの評価に関するさらなる調査を促進します。

プロトコル

この調査では、それぞれ体重400〜500 gの6か月齢の雄のSprague-Dawleyラット20匹を使用しました。すべての動物処置は、中山大学第五附属病院の動物施設管理および使用委員会のガイドラインに従って実施されました(承認番号:00349)。動物たちは、温度と照明条件が管理された施設に収容されました。尿道狭窄の基本的な特徴は、尿道内の瘢痕化の発生です。瘢痕形成の確立されたタイムライン (通常は損傷後 4 週間以内に発生する) に基づいて、術後 4 週間のマークで尿道に識別可能な瘢痕組織が存在することを実験エンドポイントとして指定しました。

1. 手術器具の準備

1. テフロンコーティングカテーテル(0.6 x 1 mm)、吸収性縫合糸(6-0)、縫合ハサミ、組織鉗子、針保持ペンチ、平滑鉗子、高周波電気手術ユニット(図1)、高周波電動ナイフのパネル、手術電極高周波電気手術ナイフ、肛門伝導ロッド( 材料の表を参照)。
2. 75%エタノールを含むアルコールワイプで手術部位を清掃します。
3. ユニポーラ電動切断モードで高周波電動ナイフを使用するための準備。
   1. 電源コードを使用して、高周波電動ナイフを接地された220V主電源に接続します。
   2. 滅菌された手動ナイフハンドルと導電ロッドをそれぞれのソケットに挿入します(図1C)。
      注意: 手術の安全性を維持するために、すべての電源ケーブルがしっかりと接続されていることを確認してください。

2.動物の準備

1. ペントバルビタールナトリウム(60 mg / kg)を注射器に引き込みます。.
2. 利き手でネズミの尻尾をつかみ、利き手でない手で耳と首の皮膚をつかんでしっかりと固定します。
3. ラットの下腹部を露出させ、75%エタノールに浸したコットンボールを使用してその領域を消毒します。
4. シリンジ針を下腹部の腹部正中線の横に約1〜2 mm挿入し、45°の角度で腹腔内に向けます。.
   注:針が腹膜を貫通すると、抵抗が失われます。
5. シリンジプランジャーを静かに引き戻して、シリンジに血液や体液がないことを確認します。
6. ペントバルビタールナトリウムをゆっくりと注入します。針を引き抜いて注射を完了し、75%エタノールに浸したコットンボールで再度部位を消毒します。
7. ラットの呼吸リズムを監視し、後足をつまんで反射神経を確認します。
   注:ラットの呼吸が安定していること、および手術を進める前に反射が見られないことを確認してください。
8. エリスロマイシン軟膏を絞り出し、綿棒を軟膏に浸します。施術中の角膜の乾燥を防ぐために、綿棒で両眼の角膜に軟膏を塗ります。.
9. 電気シェーバーを使用して、麻酔が確認された後、下腹部と会陰を剃ります。
10. 剃った部分の抜け毛を生理食塩水で湿らせたティッシュで拭き取ります。
11. ヨードフォアに浸したガーゼスポンジで2回拭いて消毒し、皮膚の炎症を最小限に抑えます。
12. 深く麻酔をかけたラットを、37°Cに設定された温熱パッドの上に仰臥位で置きます。手術中の無菌性を確保するには、医療用手袋を着用してください。

3. 尿道カテーテル法と傷害の手技

1. 導電性ロッドをラットの肛門に挿入して、高周波電動ナイフマシンの効果的な閉ループ回路を確立します(図2A)。
2. ラットの尿道にカテーテルを挿入して、手術の後処理ステップ中にポジショニングとサポートを提供します。
   1. 尿道カテーテルをパラフィンオイルで滑らかにします。
   2. 陰茎の周りの皮膚を絞って腹部から突き出すようにして、陰茎を露出させます。
   3. ラットの陰茎をヨードフォアに浸したガーゼスポンジで消毒します。
   4. 滑らかな鉗子で尿道開口部を静かに開き、潤滑されたカテーテルを尿道に挿入します。
   5. テフロンコーティングされたカテーテルを尿道収縮のリズムで尿道に慎重に挿入します。無理な挿入は避けてください(図2B)。
   6. 抵抗が発生した場合は、陰茎を腹側に向かってそっと引っ張って陰茎の曲げ角度を調整し、尿が流出するまでカテーテルを膀胱に進め続けます(図2C)。
   7. 陰茎が腹部に対して約45°の角度を形成していることを確認して、カテーテル挿入が成功したことを確認します(図2D)。
3. 高周波電動ナイフマシンの電源を入れ、高周波ナイフパネルのボタンをクリックしてユニポーラ混合切断モードを選択し、陰茎を層ごとに電気切除する次の手順で電力を4 Wに設定します。
4. 切開部をカテーテルに合わせます。電気手術ナイフのハンドルにある黄色のボタンを押し、尿道が露出するまで電動ナイフを使用して、陰茎の皮膚から尿道の外層までカテーテルのマーキングラインに沿って切開します(図3A、B)。
   注意: 電気凝固の青いボタンではなく、電気切除の黄色のボタンを押していることを確認してください。
5. カテーテルが見えるまで、電動ナイフで尿道を縦方向に0.5cm切開し続け、横方向の直径を0.1cmにします(図3C)。
6. 吸収性縫合糸(6-0)を使用して、連続縫合または中断縫合のいずれかで創傷と表在性皮膚を層ごとに縫合します(図3D、E)。
7. 尿道カテーテルを取り外し、陰茎の位置を変えます(図3F)。
8. 高周波電動ナイフの電源を切り、ラットの肛門から導電性ロッドを取り外します。
9. アルコール(75%エタノール)ワイプで手術材料を洗浄します。

4. 術後ケア

1. ラットを温めたパッド(37°C)に置き、麻酔からの回復を注意深く観察します。ラットの呼吸リズム、体温、意識レベルなど、体調には十分注意してください。
   注:完全な回復が観察されるまで、ラットをケージに戻さないでください。
2. ラットを清潔なケージに収容し、回復後の毎日の痛み管理のために、水筒にモルヒネを添加した水(0.4 mg / kg)を満たします。
3. 非ステロイド性抗炎症薬(カルプロフェン、0.5 mg / kg、皮下注射など)を投与して、ラットが術後の痛みから完全に回復します。.

5. 組織学的評価

1. 手術の4週間後、ラットの尻尾を持ち上げて排尿反射を誘発します。ラットを安楽死ボックスに入れ、CO₂ 伝送パイプバルブを開き、_CO2の過剰摂取でラットを人道的に安楽死させます。
2. ラットが動かず呼吸していないことを確認し、瞳孔が拡張していることを確認した後、バルブをオフにしてください。ネズミの体調を2分間観察し続け、安楽死が成功したことを確認します。
3. 安楽死ボックスからラットを取り出します。
4. 手術部位と手術材料は、75%エタノールに浸したワイプで洗浄します。
5. 腹部を解剖して膀胱の充満状態を観察し、尿道全体を採取します。
6. 尿道を採取した後、ラットを密封袋に入れ、実験室の技術者が処理するために4°Cの冷蔵庫に保管します。
7. 形態学的には、組織の色と滑らかさに焦点を当てて、米国の肉眼的病理を評価します。
8. 尿道組織をヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色し、創傷構造と尿路上皮細胞層を視覚化します。
   1. スライドをキシレンに浸して脱パラフィンします(2 x 5分)。
   2. スライドをエタノールで順番に再水和します(100%1 x 3分、95%1 x 3分、85%1 x 3分、75%1 x 3分)。
   3. スライドを脱イオン水で洗浄します(2分)。
   4. スライドをヘマトキシリンで染色します(10分)。
   5. スライドを脱イオン水で洗浄します(5分)。
   6. 分化溶液(40秒)でサンプルを分化します。
   7. スライドを脱イオン水で洗浄します(2 x 3分)。
   8. スライドをエオシンで染色します(2分)。
   9. スライドをエタノールで順番に再水和します(100%1 x 3秒、95%1 x 3秒、85%1 x 3秒、75%1 x 3秒)
   10. スライドを100%エタノールに浸し(1分)、キシレンでスライドを透明にします(2 x 1分)。
   11. 中性バルサムを加え、カバーガラスで密封します。
9. Massonのトリクローム染色を尿道組織に塗布して、コラーゲン繊維の構造を強調します。
   1. スライドをキシレンに浸して脱パラフィンします(2 x 5分)。
   2. スライドをエタノールで順番に再水和します(100%1 x 3分、95%1 x 3分、85%1 x 3分、75%1 x 3分)。
   3. スライドを脱イオン水で洗浄します(2分)。
   4. スライドをヴァイガートの鉄ヘマトキシリン溶液で染色します(5分)。
   5. スライドを脱イオン水で洗浄します(5分)。
   6. Biebrich Scarlet-Acid Fucshinでスライドを染色します(5分)。
   7. スライドを脱イオン水で洗浄します(2 x 3分)。
   8. スライドをホスホモリブデン酸溶液で染色します(5分)。
   9. スライドをアニリンブルー溶液に入れます(5分)。解決策を破棄します。
   10. スライドをすすぎ、アルコールで脱水し、キシレンで透明にします。
   11. 中性バルサムを加え、カバーガラスで密封します。
10. TGF-β抗体を用いて免疫蛍光染色を行い、尿路上皮細胞層を評価します。
    1. 適切な抗原賦活化バッファーを圧力鍋に加えます。圧力鍋をホットプレートに置き、フルパワーでオンにします。
    2. 沸騰したら、スライドを水道水から圧力鍋に移します。炊飯器に冷水を流し、スライドを10分間加熱します。
    3. 圧力鍋の電源を切り、スライドを取り外します。スライドを室温まで冷まします。
    4. スライドをPBS溶液で洗浄します。
    5. サンプルの余白を液体ブロッカーペンでマークします。
    6. スライドをPBSと0.3%Triton X-100に30分間浸します。
    7. スライドをPBSで穏やかに攪拌しながら洗浄します(2 x 5分)。
    8. 10% ヤギ血清をPBS中で室温(60分)でブロックします。
    9. ブロッキングバッファーを吸引し、一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。
    10. スライドを1x PBSで洗浄します(3 x 5分)。
    11. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光色素標識二次抗体とインキュベートします。
    12. スライドを1x PBSで洗浄します(3 x 3分)。
    13. スライドを取り付けて密封します。
11. スライドスキャナーの40倍対物レンズを使用して、染色されたスライドをデジタルスキャンします。
12. 画像を分析し、参照されたソフトウェア(Table of Materials)を使用して尿路上皮の厚さを測定します。
    1. ソフトウェアを起動します。
    2. [ローカルコンピュータ]をクリックして、染色されたスライド画像を選択します。
    3. 「 距離の測定」 をクリックして、尿路上皮の厚さを測定します。
    4. 尿路上皮の厚さに関するデータを記録します。

結果

この研究で概説されたプロトコルは、ラットの安定した尿道狭窄を確立することに成功し、高い再現性を示しました。手術の平均時間は20分で、手術中に技術的な問題は発生しませんでした。尿道標本は、処置の4週間後に無事に採取されました。

実験群では、ラットの膀胱は、膀胱が空であった対照群とは対照的に、過膨張の兆候を示しました(...

ディスカッション

米国は、経済的に大きな影響を与える重大な医療負担をもたらし、心理的および身体的健康の両方に悪影響を及ぼしています²⁰。米国を完全に治癒するだけでなく、その再発を効果的に予防する治療法が依然として必要です。

この研究では、ラットモデルを利用して、患者の尿道損傷を模倣するための簡単で再現性のある方法?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable sutures (6-0)	KERONG COMPANY	KR2230814
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
CaseViewer 2.4	3DHISTECH Ltd.
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-2
H&E Stain Kit	Abcam	ab150669
high-frequency electrosurgical unit	Beijing Taktvoll Technology Company	ES-100v
Masson staining kit	Merck	HT15
needle-holding pliers	RWD Life Science	S15001-11
Paraffin oil	NA	NA
smooth forceps	RWD Life Science	F13019-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
suture scissors	RWD Life Science	S15001-11
Teflon coated catheter (0.6 mm x 1 mm)	DGZF new materials company	NA
TGF Beta 1 Polyclonal antibody	Proteintech	21898-1-AP
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14