Lesión iatrogénica recapitulada: técnica de electroescisión para el modelado de la estenosis uretral en ratas

Resumen

En este estudio, presentamos un modelo novedoso, eficiente y estable de estenosis uretral en ratas creado a través de la electroescisión de la uretra de rata, que simula eficazmente la lesión iatrogénica observada en entornos clínicos.

Resumen

La estenosis uretral (US) es una afección clínica común en urología, caracterizada por una alta prevalencia y morbilidad en todas las edades. Los tratamientos actuales para la ecografía, como la dilatación uretral y la uretrotomía interna, no resuelven completamente la afección y se asocian con altas tasas de recurrencia y complicaciones.

Además, la patogenia de la ecografía no se conoce bien. Para explorar la patogenia de la ecografía y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, es crucial establecer un modelo estandarizado en ratas que refleje con precisión las manifestaciones clínicas. Este estudio describe un método sencillo y repetible para inducir US en ratas utilizando un cuchillo eléctrico de alta frecuencia. El método consiste en realizar una incisión longitudinal con el bisturí eléctrico ajustado a un modo de corte mixto unipolar a 4 W, lo que inflige un daño uretral significativo. El análisis histopatológico muestra engrosamiento del urotelio, infiltración inflamatoria y fibras de colágeno desorganizadas. Este modelo replica eficazmente la lesión iatrogénica a través de la electroescisión en la uretra de la rata. En resumen, este estudio establece con éxito un modelo nuevo, eficiente y estable de US en ratas que imita de cerca el escenario clínico, proporcionando una herramienta valiosa para futuras investigaciones sobre los mecanismos y tratamientos novedosos para la US.

Introducción

La estenosis uretral (US) es una de las afecciones urológicas más antiguas y sigue siendo ampliamente prevalente. Datos recientes sugieren que hay entre 229 y 627 casos de US por cada 100.000 hombres¹. Aquellos que sufren de US experimentan una variedad de síntomas que incluyen síntomas del tracto urinario inferior², dolor³ y disfunción sexual⁴. Existen varios tratamientos médicos, como la uretrotomía, la uretroplastia y la dilatación⁵. Sin embargo, estos tratamientos a menudo se complican por problemas como sangrado, infección e incontinencia, lo que contribuye a la carga de enfermedad y presenta tasas variables de recurrencia ^6,7. En consecuencia, la identificación de los enfoques terapéuticos más eficaces sigue siendo un reto crítico que involucra a investigadores y clínicos.

La ecografía se caracteriza generalmente por un estrechamiento de la uretra anterior causado por fibrosis y cicatrización de la mucosa uretral y del tejido esponjoso circundante⁸. A pesar de su prevalencia, las causas y los mecanismos subyacentes a la ecografía son poco conocidos, y hay una falta de modelos animales adecuados para un estudio en profundidad. La lesión iatrogénica, principalmente por cirugía transuretral, es actualmente la principal causa de US, representando el 41% de los casos⁹. Por lo tanto, un modelo animal ideal para la investigación en EE. UU. debe replicar con precisión las lesiones clínicas comunes, exhibir similitudes genómicas y proteómicas cercanas con los humanos y demostrar eficiencia y estabilidad. Un modelo de este tipo facilitaría en gran medida investigaciones más profundas sobre la patogénesis de la ecografía y el desarrollo de tratamientos más eficaces.

Para investigar el proceso patogénico y el mecanismo de los tipos clínicos comunes, se han desarrollado varios modelos animales utilizando animales grandes como conejos ^10,11, perros¹² y cerdos^13,14 empleando técnicas como la electrocoagulación, la electrorresección¹⁵ y las inyecciones de bleomicina¹⁶. Sin embargo, estos modelos a menudo enfrentan desafíos debido a las limitaciones del tamaño de la muestra y las diferencias genéticas con los humanos. Además, se debe considerar la rentabilidad del uso de animales grandes; A pesar de los altos costos asociados con el cuidado diario, los animales grandes también conllevan riesgos significativos de infección, lo que requiere cuidados postoperatorios extensos y gastos considerables. Está bien documentado que los roedores comparten características fisiológicas y patológicas con los humanos en muchos sistemas de órganos. Un estudio reciente ha demostrado homología entre las células del tracto urinario de animales roedores y humanos¹⁷. Además, los costos de compra, alojamiento y cuidados postoperatorios de las ratas son significativamente más bajos que los de los animales grandes¹⁸. En consecuencia, se considera adecuado un modelo de rata de los EE. UU.; Sin embargo, el desarrollo de tales modelos en ratas no ha sido descrito adecuadamente.

Estudios previos han utilizado herramientas quirúrgicas como cuchillas o agujas para inducir ecografía en modelos de ratas¹⁹. Este enfoque se ha asociado con riesgos como dañar los vasos sanguíneos periuretrales, lo que provoca una hemorragia significativa. La naturaleza subjetiva de estos procedimientos quirúrgicos también puede dar lugar a variabilidad en el grado de la lesión mecánica, careciendo de criterios cuantitativos para el modelado, lo que puede afectar la evaluación de los resultados de la reparación uretral en estudios terapéuticos posteriores.

Teniendo en cuenta estas consideraciones, existe una clara necesidad de desarrollar un modelo adicional de ratas en los Estados Unidos. Para establecer un modelo de US eficiente, rentable y estable en ratas, empleamos una máquina de cuchillas eléctrica de alta frecuencia en nuestra investigación. Este modelo facilitará nuevas investigaciones sobre los mecanismos de la ecografía y la evaluación de nuevos enfoques terapéuticos antes de proceder a los ensayos clínicos.

Protocolo

En esta investigación, se emplearon veinte ratas Sprague-Dawley macho de 6 meses de edad, cada una con un peso de 400 a 500 g. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Quinto Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen (Número de aprobación: 00349). Los animales fueron alojados en una instalación con condiciones controladas de temperatura e iluminación. Una característica fundamental de la estenosis uretral es el desarrollo de cicatrices dentro de la uretra. Con base en la línea de tiempo establecida para la formación de la cicatriz, que generalmente ocurre dentro de las 4 semanas posteriores a la lesión, designamos la presencia de tejido cicatricial discernible en la uretra a las 4 semanas postoperatorias como criterio de valoración experimental.

1. Preparación de instrumental quirúrgico

1. Prepare los siguientes materiales quirúrgicos: catéter recubierto de teflón (0,6 x 1 mm), suturas reabsorbibles (6-0), tijeras de sutura, pinzas de tejido, alicates de sujeción de agujas, pinzas lisas, unidad electroquirúrgica de alta frecuencia (Figura 1), incluido el panel del bisturí eléctrico de alta frecuencia, electrodo quirúrgico, bisturí electroquirúrgico de alta frecuencia y la varilla conductora anal (ver Tabla de materiales).
2. Limpie el área quirúrgica con toallitas con alcohol que contengan un 75% de etanol.
3. Preparación para el uso de una cuchilla eléctrica de alta frecuencia en modo de corte eléctrico unipolar.
   1. Conecte la cuchilla eléctrica de alta frecuencia a la fuente de alimentación principal de 220 V conectada a tierra mediante un cable de alimentación.
   2. Inserte el mango de la cuchilla esterilizada controlada a mano y la varilla conductora en sus respectivos zócalos (Figura 1C).
      NOTA: Asegúrese de que todos los cables de alimentación estén bien conectados para mantener la seguridad de la cirugía.

2. Preparación del animal

1. Extraer el pentobarbital sódico (60 mg/kg) en una jeringa.
2. Asegure a la rata agarrando su cola con la mano dominante y sosteniendo la piel de sus orejas y cuello con la mano no dominante para asegurarse de que esté firmemente fijada.
3. Exponga la parte inferior del abdomen de la rata y desinfecte el área con bolas de algodón empapadas en etanol al 75%.
4. Inserte la aguja de la jeringa aproximadamente 1-2 mm al lado de la línea media abdominal en la parte inferior del abdomen, dirigiéndola hacia la cavidad abdominal en un ángulo de 45°.
   NOTA: Sentirá una pérdida de resistencia cuando la aguja penetre en el peritoneo.
5. Tire suavemente del émbolo de la jeringa para asegurarse de que no haya sangre ni líquido en la jeringa.
6. Inyecte lentamente el pentobarbital sódico. Retire la aguja, completando la inyección, y vuelva a desinfectar el sitio con bolas de algodón empapadas en etanol al 75%.
7. Controla el ritmo respiratorio de la rata y pellizca su pata trasera para comprobar si tiene reflejos.
   NOTA: Confirme que la respiración de la rata es constante y que no muestra reflejos antes de proceder con la cirugía.
8. Exprima el ungüento de eritromicina y sumerja un hisopo de algodón en el ungüento. Aplique el ungüento con el hisopo de algodón en las córneas de ambos ojos para evitar que la córnea se seque durante el procedimiento.
9. Use una afeitadora eléctrica para afeitar la parte inferior del abdomen y el perineo después de que se confirme la anestesia.
10. Limpie el cabello suelto de la zona afeitada con un pañuelo humedecido con solución salina.
11. Desinfecte el área limpiándola dos veces con una esponja de gasa empapada en yodoforo para minimizar la irritación de la piel.
12. Coloque la rata profundamente anestesiada en una almohadilla térmica a 37 ° C en posición supina. Asegurar la esterilidad durante los procedimientos quirúrgicos mediante el uso de guantes médicos.

3. Cateterismo uretral y procedimiento de lesión

1. Inserte la varilla conductora en el ano de la rata para establecer un circuito cerrado efectivo para la máquina de cuchillas eléctrica de alta frecuencia (Figura 2A).
2. Cateterizar la uretra de la rata para ayudar en el posicionamiento y proporcionar apoyo durante los pasos posteriores al procesamiento de la cirugía.
   1. Lubrique el catéter urinario con aceite de parafina.
   2. Exponga el pene apretando la piel a su alrededor para que sobresalga del abdomen.
   3. Desinfecta el pene de la rata con una esponja de gasa empapada en yodoforo.
   4. Abra suavemente el orificio uretral con pinzas lisas e inserte el catéter lubricado en la uretra.
   5. Inserte con cuidado el catéter recubierto de teflón en la uretra con el ritmo de la contracción uretral; evite cualquier inserción forzada (Figura 2B).
   6. Si se encuentra resistencia, tire suavemente del pene hacia el lado ventral para ajustar el ángulo de flexión del pene y continúe avanzando el catéter hacia la vejiga hasta que la orina fluya (Figura 2C).
   7. Confirme el éxito del cateterismo asegurándose de que el pene forme un ángulo aproximado de 45° con el abdomen (Figura 2D).
3. Encienda la máquina de cuchillas eléctrica de alta frecuencia, haga clic en los botones del panel de cuchillas de alta frecuencia para seleccionar el modo de corte mixto unipolar y ajuste la potencia a 4 W para los siguientes pasos de electroextirpación del pene capa por capa.
4. Alinee la incisión con el catéter. Presione el botón amarillo en el mango del bisturí electroquirúrgico y haga una incisión a lo largo de la línea de marcado del catéter desde la piel del pene hasta la capa externa de la uretra con el bisturí eléctrico hasta que la uretra quede expuesta (Figura 3A, B).
   NOTA: Asegúrese de presionar el botón amarillo para la electroescisión, no el botón azul para la electrocoagulación.
5. Continuar realizando una incisión longitudinal de 0,5 cm en la uretra con el bisturí eléctrico, asegurando un diámetro transversal de 0,1 cm, hasta que el catéter sea visible (Figura 3C).
6. Suturar la herida y la piel superficial capa por capa utilizando suturas reabsorbibles (6-0) con puntos continuos o interrumpidos (Figura 3D,E).
7. Retire el catéter de la uretra y vuelva a colocar el pene (Figura 3F).
8. Apague el cuchillo eléctrico de alta frecuencia y retire la varilla conductora del ano de la rata.
9. Limpie los materiales quirúrgicos con toallitas con alcohol (etanol al 75%).

4. Cuidados postoperatorios

1. Coloque la rata sobre una almohadilla caliente (37 °C) y controle de cerca su recuperación de la anestesia. Presta mucha atención a la condición física de la rata, incluido el ritmo respiratorio, la temperatura corporal y el nivel de conciencia.
   NOTA: No devuelva la rata a su jaula hasta que se observe una recuperación completa.
2. Aloje a las ratas en una jaula limpia y llene la botella de agua con agua enriquecida con morfina (0,4 mg/kg) para el manejo diario del dolor después de la recuperación.
3. Administrar antiinflamatorios no esteroideos (como carprofeno, 0,5 mg/kg, inyección subcutánea) para la recuperación completa del dolor postoperatorio en las ratas.

5. Evaluación histológica

1. Cuatro semanas después de la cirugía, induzca el reflejo miccional levantando la cola de las ratas. Coloque la rata en una caja de eutanasia, abra la válvula de la tubería de transmisión de_CO2 y eutanasique humanamente a las ratas con una sobredosis de CO₂.
2. Cierre la válvula después de confirmar que la rata está inmóvil y no respira y observar que la pupila está dilatada. Continúe observando la condición física de la rata durante 2 minutos para confirmar que la eutanasia es exitosa.
3. Saca la rata de la caja de eutanasia.
4. Limpie el área quirúrgica y los materiales quirúrgicos con toallitas empapadas en etanol al 75%.
5. Diseccionar el abdomen para observar el estado de llenado de la vejiga y extraer toda la uretra.
6. Después de recolectar la uretra, coloque la rata en una bolsa sellada y guárdela en un refrigerador a 4 °C para que la procesen los técnicos de laboratorio.
7. Evaluar morfológicamente la ecografía en busca de patología macroscópica, centrándose en el color y la suavidad del tejido.
8. Tiñe el tejido de la uretra con hematoxilina y eosina (H&E) para visualizar la estructura de la herida y la capa de células uroteliales.
   1. Sumerja los portaobjetos en xileno para desparafinarlos (2 x 5 min).
   2. Rehidrate los portaobjetos en etanol en orden (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
   3. Lave los portaobjetos en agua desionizada (2 min).
   4. Teñir los portaobjetos con hematoxilina (10 min).
   5. Lave los portaobjetos en agua desionizada (5 min).
   6. Diferenciar las muestras con solución de diferenciación (40 s).
   7. Lave los portaobjetos en agua desionizada (2 x 3 min).
   8. Teñir los portaobjetos con eosina (2 min).
   9. Rehidratar los portaobjetos en etanol en un pedido (100% 1 x 3 s, 95% 1 x 3 s, 85% 1 x 3 s, 75% 1 x 3 s)
   10. Sumerja los portaobjetos en etanol al 100% (1 min) y transparente los portaobjetos con xileno (2 x 1 min).
   11. Agregue el bálsamo neutro y selle con el cubreobjetos.
9. Aplique la tinción tricrómica de Masson en el tejido de la uretra para resaltar la estructura de la fibra de colágeno.
   1. Sumerja los portaobjetos en xileno para desparafinarlos (2 x 5 min).
   2. Rehidrate los portaobjetos en etanol en orden (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
   3. Lave los portaobjetos en agua desionizada (2 min).
   4. Tiñe los portaobjetos con la solución de hematoxilina de hierro de Weigert (5 min).
   5. Lave los portaobjetos en agua desionizada (5 min).
   6. Tiñe los portaobjetos con Fucshin de ácido escarlata de Biebrich (5 min).
   7. Lave los portaobjetos en agua desionizada (2 x 3 min).
   8. Tiñir los portaobjetos con una solución de ácido fosfomolíbdico (5 min).
   9. Coloque los portaobjetos en la solución de azul de anilina (5 min). Deseche la solución.
   10. Enjuague los portaobjetos, deshidréguelos con alcohol y séjelos con xileno.
   11. Agregue el bálsamo neutro y selle con el cubreobjetos.
10. Realizar la tinción de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo TGF-β para evaluar la capa de células uroteliales.
    1. Agregue el tampón de recuperación de antígeno apropiado a la olla a presión. Coloque la olla a presión en la placa calefactora y enciéndala a máxima potencia.
    2. Una vez que hierva, transfiera los portaobjetos del agua del grifo a la olla a presión. Deje correr agua fría sobre la olla y caliente los portaobjetos durante 10 minutos.
    3. Apague la olla a presión y retire las correderas. Enfríe los portaobjetos a temperatura ambiente.
    4. Lave los portaobjetos con una solución de PBS.
    5. Marque los márgenes de las muestras con un rotulador de líquidos.
    6. Sumerja los portaobjetos en PBS más Triton X-100 al 0,3% durante 30 minutos.
    7. Lave los portaobjetos en PBS con agitación suave (2 x 5 min).
    8. Bloquear en suero de cabra al 10% en PBS a temperatura ambiente (60 min).
    9. Aspirar el tampón de bloqueo e incubar con el anticuerpo primario a 4 °C durante toda la noche.
    10. Lave los portaobjetos con 1x PBS (3 x 5 min).
    11. Incubar con anticuerpo secundario marcado con fluorocromo diluido en tampón de dilución de anticuerpos.
    12. Lave los portaobjetos con 1x PBS (3 x 3 min).
    13. Monte y selle las correderas.
11. Escanee digitalmente los portaobjetos manchados con un objetivo de 40x en un escáner de portaobjetos.
12. Analice las imágenes y mida el espesor del urotelio utilizando el software de referencia (Tabla de Materiales).
    1. Abra el software.
    2. Haga clic en Equipo local para seleccionar las imágenes de diapositivas manchadas.
    3. Haga clic en Medir distancia para medir el grosor del urotelio.
    4. Registre los datos sobre el espesor del urotelio.

Resultados

El protocolo descrito en este estudio estableció con éxito la estenosis uretral estable en ratas y demostró una alta reproducibilidad. La duración media de las operaciones fue de 20 minutos y no surgieron problemas técnicos durante los procedimientos. Las muestras uretrales se recolectaron con éxito 4 semanas después del procedimiento.

En el grupo experimental, las vejigas de las ratas mostraron signos de sobredistensión, en contraste con el grupo cont...

Discusión

Los EE.UU. suponen una importante carga sanitaria con un impacto económico sustancial, que afecta negativamente al bienestar psicológico y físico²⁰. Todavía existe la necesidad de un tratamiento que no solo cure completamente la ecografía, sino que también prevenga eficazmente su recurrencia.

En este estudio, utilizamos un modelo de rata para desarrollar un método sencillo y reproducible para imitar la lesión uretral en los paci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable sutures (6-0)	KERONG COMPANY	KR2230814
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
CaseViewer 2.4	3DHISTECH Ltd.
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-2
H&E Stain Kit	Abcam	ab150669
high-frequency electrosurgical unit	Beijing Taktvoll Technology Company	ES-100v
Masson staining kit	Merck	HT15
needle-holding pliers	RWD Life Science	S15001-11
Paraffin oil	NA	NA
smooth forceps	RWD Life Science	F13019-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
suture scissors	RWD Life Science	S15001-11
Teflon coated catheter (0.6 mm x 1 mm)	DGZF new materials company	NA
TGF Beta 1 Polyclonal antibody	Proteintech	21898-1-AP
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14