İyatrojenik Yaralanma Özetlendi: Sıçanlarda Üretra Darlığı Modellemesi için Elektroeksizyon Tekniği

Özet

Bu çalışmada, klinik ortamlarda gözlenen iyatrojenik hasarı etkili bir şekilde simüle eden, sıçan üretrasının elektroeksizyonu yoluyla oluşturulan üretra darlığının yeni, verimli ve stabil bir sıçan modelini sunuyoruz.

Özet

Üretra darlığı (US) ürolojide sık görülen, her yaşta yüksek prevalans ve morbidite ile karakterize bir klinik durumdur. Üretral dilatasyon ve internal üretrotomi gibi US için mevcut tedaviler durumu tam olarak çözmekte başarısız olmakta ve yüksek nüks ve komplikasyon oranları ile ilişkilidir.

Ek olarak, US'nin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır. US'nin patogenezini araştırmak ve yeni terapötik stratejiler geliştirmek için, klinik bulguları doğru bir şekilde yansıtan standart bir sıçan modeli oluşturmak çok önemlidir. Bu çalışma, yüksek frekanslı bir elektrikli bıçak kullanarak sıçanlarda US'yi indüklemek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntemi özetlemektedir. Yöntem, elektrikli bıçağın 4 W'ta tek kutuplu karışık kesme moduna ayarlanmış olmasıyla uzunlamasına bir kesi yapılmasını içerir ve bu da önemli üretral hasara neden olur. Histopatolojik analiz, ürotelyumun kalınlaşmasını, inflamatuar infiltrasyonu ve düzensiz kollajen liflerini gösterir. Bu model, sıçan üretrasında elektroeksizyon yoluyla iyatrojenik hasarı etkili bir şekilde çoğaltır. Özetle, bu çalışma, klinik senaryoyu yakından taklit eden yeni, verimli ve stabil bir US sıçan modelini başarılı bir şekilde oluşturmakta ve US için mekanizmalar ve yeni tedaviler hakkında daha fazla araştırma için değerli bir araç sağlamaktadır.

Giriş

Üretra darlığı (US) en eski ürolojik hastalıklar arasındadır ve yaygın olarak görülmeye devam etmektedir. Son veriler, 100.000 erkek başına 229 ila 627 ABD vakası olduğunu göstermektedir¹. US'den muzdarip olanlar, alt idrar yolu semptomları², ağrı³ ve cinsel işlev bozukluğu⁴ dahil olmak üzere bir dizi semptom yaşarlar. Üretrotomi, üretroplasti ve dilatasyon gibi çeşitli tıbbi tedaviler mevcuttur⁵. Bununla birlikte, bu tedaviler genellikle kanama, enfeksiyon ve idrar kaçırma gibi sorunlar nedeniyle karmaşıklaşır, hastalık yüküne katkıda bulunur ve değişen nüks oranları sergiler ^6,7. Sonuç olarak, en etkili terapötik yaklaşımları belirlemek, araştırmacıları ve klinisyenleri meşgul eden kritik bir zorluk olmaya devam etmektedir.

US genellikle fibrozis ve üretra mukozası ile çevresindeki spongiozum dokunun sikatrizasyonuna bağlı anterior üretranın daralması ile karakterize edilir⁸. Yaygınlığına rağmen, US'nin altında yatan nedenler ve mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır ve derinlemesine çalışma için uygun hayvan modelleri eksikliği vardır. Esas olarak transüretral cerrahiden kaynaklanan iyatrojenik yaralanma, şu anda US'nin önde gelen nedenidir ve vakaların %41'ini oluşturmaktadır⁹. Bu nedenle, ABD araştırmaları için ideal bir hayvan modeli, yaygın klinik yaralanmaları doğru bir şekilde çoğaltmalı, insanlara yakın genomik ve proteomik benzerlikler sergilemeli ve hem verimlilik hem de stabilite göstermelidir. Böyle bir model, US patogenezi ile ilgili daha derin araştırmaları ve daha etkili tedavilerin geliştirilmesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.

Yaygın klinik tiplerin patojenik sürecini ve mekanizmasını araştırmak için, elektrokoagülasyon, elektrorezeksiyon¹⁵ ve bleomisin enjeksiyonları¹⁶ gibi teknikler kullanılarak tavşan^10,11, köpekler¹² ve domuzlar^13,14 gibi büyük hayvanlar kullanılarak çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modeller genellikle örneklem boyutu sınırlamaları ve insanlardan genetik farklılıklar nedeniyle zorluklarla karşı karşıyadır. Ek olarak, büyük hayvanların kullanılmasının maliyet etkinliği de dikkate alınmalıdır; Günlük bakımla ilişkili yüksek maliyetlere rağmen, büyük hayvanlar aynı zamanda önemli enfeksiyon riskleri taşır ve bu da kapsamlı ameliyat sonrası bakım ve önemli masraflar gerektirir. Kemirgenlerin birçok organ sisteminde insanlarla fizyolojik ve patolojik özellikleri paylaştığı iyi belgelenmiştir. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, kemirgen hayvanların ve insanların idrar yolu hücreleri arasında homoloji olduğunu göstermiştir¹⁷. Ayrıca, sıçanların satın alınması, barındırılması ve ameliyat sonrası bakım maliyetleri, büyük hayvanlarınkinden önemli ölçüde daha düşüktür¹⁸. Sonuç olarak, ABD'nin bir sıçan modeli uygun görülmektedir; Bununla birlikte, sıçanlarda bu tür modellerin gelişimi yetersiz bir şekilde tanımlanmıştır.

Önceki çalışmalar, sıçan modellerinde US'yi indüklemek için bıçaklar veya iğneler gibi cerrahi aletler kullanmıştır¹⁹. Bu yaklaşım, periüretral kan damarlarına zarar verme ve önemli kanamaya yol açma gibi risklerle ilişkilendirilmiştir. Bu cerrahi prosedürlerin subjektif doğası, modelleme için kantitatif kriterlerden yoksun olan mekanik yaralanma derecesinde değişkenliğe neden olabilir ve bu da sonraki terapötik çalışmalarda üretral onarım sonuçlarının değerlendirilmesini etkileyebilir.

Bu hususlar göz önüne alındığında, ek bir ABD sıçan modeli geliştirmeye açık bir ihtiyaç vardır. Sıçanlarda verimli, uygun maliyetli ve istikrarlı bir ABD modeli oluşturmak için araştırmamızda yüksek frekanslı bir elektrikli bıçak makinesi kullandık. Bu model, klinik çalışmalara geçmeden önce US'nin mekanizmalarına ilişkin daha fazla araştırmayı ve yeni terapötik yaklaşımların değerlendirilmesini kolaylaştıracaktır.

Protokol

Bu araştırmada, her biri 400-500 g ağırlığında yirmi adet 6 aylık erkek Sprague-Dawley sıçanı kullanıldı. Tüm hayvan prosedürleri, Sun Yat-Sen Üniversitesi Beşinci Bağlı Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Onay numarası: 00349). Hayvanlar, kontrollü sıcaklık ve aydınlatma koşullarına sahip bir tesiste barındırıldı. Üretra darlığının temel bir özelliği, üretra içinde yara izinin gelişmesidir. Tipik olarak yaralanmadan sonraki 4 hafta içinde ortaya çıkan skar oluşumu için belirlenen zaman çizelgesine dayanarak, deneysel son nokta olarak 4 haftalık postoperatif işarette üretrada fark edilebilir skar dokusunun varlığını belirledik.

1. Cerrahi aletlerin hazırlanması

1. Aşağıdaki cerrahi malzemeleri hazırlayın: Teflon kaplı kateter (0,6 x 1 mm), emilebilir dikişler (6-0), dikiş makası, doku forsepsleri, iğne tutma pensesi, düz forseps, yüksek frekanslı elektrocerrahi ünitesi (Şekil 1), yüksek frekanslı elektrikli bıçak paneli, cerrahi elektrot yüksek frekanslı elektrocerrahi bıçağı ve anal iletken çubuk dahil (bkz.
2. Ameliyat bölgesini %75 etanol içeren alkollü mendillerle temizleyiniz.
3. Tek kutuplu elektrikli kesme modunda yüksek frekanslı bir elektrikli bıçak kullanmak için hazırlık.
   1. Yüksek frekanslı elektrikli bıçağı bir güç kablosu kullanarak topraklı 220 V ana güç kaynağına bağlayın.
   2. Sterilize edilmiş, elle kontrol edilen bıçak sapını ve iletken çubuğu ilgili yuvalarına takın (Şekil 1C).
      NOT: Ameliyatın güvenliğini sağlamak için tüm güç kablolarının güvenli bir şekilde bağlandığından emin olun.

2. Hayvanın hazırlanması

1. Sodyum pentobarbitali (60 mg / kg) bir şırıngaya çekin.
2. Sıkıca sabitlendiğinden emin olmak için baskın elinizle kuyruğunu kavrayarak ve baskın olmayan elinizle kulaklarının ve boynunun derisini tutarak fareyi sabitleyin.
3. Farenin alt karnını açığa çıkarın ve% 75 etanole batırılmış pamuk topları kullanarak alanı dezenfekte edin.
4. Şırınga iğnesini alt karın bölgesindeki karın orta hattının yaklaşık 1-2 mm yanına yerleştirin ve 45°'lik bir açıyla karın boşluğuna yönlendirin.
   NOT: İğne karın zarına girdiğinde direnç kaybı hissedeceksiniz.
5. Şırıngada kan veya sıvı olmadığından emin olmak için şırınga pistonunu yavaşça geri çekin.
6. Sodyum pentobarbitali yavaşça enjekte edin. İğneyi geri çekin, enjeksiyonu tamamlayın ve% 75 etanole batırılmış pamuk topları ile bölgeyi tekrar dezenfekte edin.
7. Sıçanın solunum ritmini izleyin ve refleksleri kontrol etmek için arka pençesini sıkıştırın.
   NOT: Ameliyata devam etmeden önce farenin solunumunun sabit olduğunu ve hiçbir refleks göstermediğini onaylayın.
8. Eritromisin merhemini sıkın ve merhemin içine pamuklu bir bez batırın. İşlem sırasında kornea kurumasını önlemek için merhemi pamuklu çubukla her iki gözün korneasına uygulayın.
9. Anestezi onaylandıktan sonra alt karın ve perine bölgesini tıraş etmek için elektrikli tıraş makinesi kullanın.
10. Traş edilen bölgedeki gevşek saçları tuzlu su ile nemlendirilmiş bir mendille silin.
11. Cilt tahrişini en aza indirmek için iyodofora batırılmış bir gazlı bezle iki kez silerek alanı dezenfekte edin.
12. Derin anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda 37 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığına yerleştirin. Cerrahi işlemler sırasında tıbbi eldiven giyerek steriliteyi sağlayın.

3. Üretral kateterizasyon ve yaralanma prosedürü

1. Yüksek frekanslı elektrikli bıçak makinesi için etkili bir kapalı döngü devresi oluşturmak için iletken çubuğu farenin anüsüne yerleştirin (Şekil 2A).
2. Ameliyatın işlem sonrası adımlarında konumlandırmaya yardımcı olmak ve destek sağlamak için farenin üretrasını kateterize edin.
   1. İdrar sondasını parafin yağı ile yağlayın.
   2. Penisi, karından dışarı çıkarmak için etrafındaki cildi sıkarak ortaya çıkarın.
   3. Sıçanın penisini iyodofora batırılmış bir gazlı bez süngerle dezenfekte edin.
   4. Üretral deliği düz forseps ile nazikçe açın ve yağlanmış kateteri üretraya yerleştirin.
   5. Teflon kaplı kateteri, üretral kasılma ritmi ile üretraya dikkatlice yerleştirin; herhangi bir zorla yerleştirmeden kaçının (Şekil 2B).
   6. Dirençle karşılaşılırsa, penisin bükülme açısını ayarlamak için penisi ventral tarafa doğru nazikçe çekin ve idrar dışarı akana kadar kateteri mesaneye doğru ilerletmeye devam edin (Şekil 2C).
   7. Penisin karın ile yaklaşık 45°'lik bir açı oluşturmasını sağlayarak başarılı kateterizasyonu onaylayın (Şekil 2D).
3. Yüksek frekanslı elektrikli bıçak makinesini açın, tek kutuplu karışık kesme modunu seçmek için yüksek frekanslı bıçak panelinin düğmelerine tıklayın ve penisi katman katman elektroeksize etmek için sonraki adımlar için gücü 4 W'a ayarlayın.
4. İnsizyonu kateter ile hizalayın. Elektrocerrahi bıçak sapındaki sarı düğmeye basın ve üretra açığa çıkana kadar elektrikli bıçağı kullanarak penis derisinden üretranın dış tabakasına kateter işaretleme çizgisi boyunca bir kesi yapın (Şekil 3A,B).
   NOT: Elektrokoagülasyon için mavi düğmeye değil, elektroeksizyon için sarı düğmeye bastığınızdan emin olun.
5. Elektrikli bıçakla üretrada 0,5 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapmaya devam edin, kateter görünene kadar 0,1 cm'lik enine bir çap sağlayın (Şekil 3C).
6. Yarayı ve yüzeyel cildi emilebilir dikişler (6-0) kullanarak sürekli veya kesintili dikişlerle katman katman dikin (Şekil 3D,E).
7. Üretra kateterini çıkarın ve penisi yeniden konumlandırın (Şekil 3F).
8. Yüksek frekanslı elektrikli bıçağı kapatın ve iletken çubuğu farenin anüsünden çıkarın.
9. Cerrahi malzemeleri alkol (%75 etanol) mendillerle temizleyiniz.

4. Ameliyat sonrası bakım

1. Fareyi ısıtılmış bir ped (37 ° C) üzerine yerleştirin ve anesteziden iyileşmesini yakından izleyin. Solunum ritmi, vücut ısısı ve bilinç seviyesi dahil olmak üzere farenin fiziksel durumuna dikkat edin.
   NOT: Tam iyileşme gözlenene kadar fareyi kafesine geri koymayın.
2. Fareleri temiz bir kafese koyun ve iyileşmeden sonra günlük ağrı yönetimi için su şişesini morfin çivili su (0.4 mg / kg) ile doldurun.
3. Sıçanların postoperatif ağrıdan tam olarak iyileşmesi için steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (Carprofen, 0.5 mg / kg, deri altı enjeksiyon gibi) uygulayın.

5. Histolojik değerlendirme

1. Ameliyattan dört hafta sonra, farelerin kuyruklarını kaldırarak işeme refleksini indükleyin. Fareyi bir ötenazi kutusuna yerleştirin, CO₂ iletim borusu valfini açın ve fareleri aşırı dozda CO₂ ile insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
2. Farenin hareketsiz olduğunu ve nefes almadığını doğruladıktan ve göz bebeğinin genişlediğini gözlemledikten sonra valfi kapatın. Ötenazinin başarılı olduğunu doğrulamak için farenin fiziksel durumunu 2 dakika boyunca gözlemlemeye devam edin.
3. Fareyi ötenazi kutusundan çıkarın.
4. Cerrahi alanı ve cerrahi malzemeleri %75 etanole batırılmış mendillerle temizleyin.
5. Mesane doldurma durumunu gözlemlemek için karnı diseke edin ve tüm üretrayı çıkarın.
6. Üretrayı topladıktan sonra, fareyi bir sızdırmazlık torbasına koyun ve laboratuvar teknisyenleri tarafından işlenmek üzere 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
7. Dokunun rengine ve pürüzsüzlüğüne odaklanarak ABD'yi brüt patoloji açısından morfolojik olarak değerlendirin.
8. Yara yapısını ve ürotelyal hücre tabakasını görselleştirmek için üretra dokusunu hematoksilen ve eozin (H & E) ile boyayın.
   1. Deparafinizasyon için slaytları ksilene batırın (2 x 5 dakika).
   2. Slaytları sırayla etanolde yeniden sulandırın (%100 1 x 3 dk, %95 1 x 3 dk, %85 1 x 3 dk, %75 1 x 3 dk).
   3. Slaytları deiyonize suda yıkayın (2 dakika).
   4. Slaytları hematoksilen ile boyayın (10 dakika).
   5. Slaytları deiyonize suda yıkayın (5 dakika).
   6. Numuneleri farklılaştırma çözeltisi (40 s) ile ayırt edin.
   7. Slaytları deiyonize suda yıkayın (2 x 3 dakika).
   8. Slaytları eozin ile boyayın (2 dakika).
   9. Slaytları bir sırayla etanol içinde rehidre edin (%100 1 x 3 sn, %95 1 x 3 sn, %85 1 x 3 sn, %75 1 x 3 sn)
   10. Slaytları %100 etanole (1 dakika) batırın ve slaytları ksilen (2 x 1 dakika) ile şeffaflaştırın.
   11. Nötr balsam ekleyin ve lamel ile kapatın.
9. Kollajen lif yapısını vurgulamak için Masson'un trikrom boyasını üretra dokusuna uygulayın.
   1. Deparafinizasyon için slaytları ksilene batırın (2 x 5 dakika).
   2. Slaytları sırayla etanolde yeniden sulandırın (%100 1 x 3 dk, %95 1 x 3 dk, %85 1 x 3 dk, %75 1 x 3 dk).
   3. Slaytları deiyonize suda yıkayın (2 dakika).
   4. Slaytları Weigert'in Demir Hematoksilen solüsyonunda (5 dakika) boyayın.
   5. Slaytları deiyonize suda yıkayın (5 dakika).
   6. Slaytları Biebrich Scarlet-Acid Fucshin (5 dakika) ile boyayın.
   7. Slaytları deiyonize suda yıkayın (2 x 3 dakika).
   8. Slaytları Fosfomolibdik Asit çözeltisi (5 dakika) ile boyayın.
   9. Slaytları Anilin Mavisi çözeltisine yerleştirin (5 dakika). Çözeltiyi atın.
   10. Slaytları durulayın, alkolle kurutun ve ksilen içinde temizleyin.
   11. Nötr balsam ekleyin ve lamel ile kapatın.
10. Ürotelyal hücre tabakasını değerlendirmek için bir TGF-β antikoru kullanarak immünofloresan boyama yapın.
    1. Düdüklü tencereye uygun antijen alma tamponunu ekleyin. Düdüklü tencereyi ocak gözünün üzerine yerleştirin ve tam güçte çalıştırın.
    2. Kaynadıktan sonra slaytları musluk suyundan düdüklü tencereye aktarın. Tencerenin üzerine soğuk su akıtın ve slaytları 10 dakika ısıtın.
    3. Düdüklü tencereyi kapatın ve kızakları çıkarın. Slaytları oda sıcaklığına soğutun.
    4. Slaytları PBS solüsyonu ile yıkayın.
    5. Numunelerin kenar boşluklarını sıvı engelleyici kalemle işaretleyin.
    6. Slaytları 30 dakika boyunca PBS artı %0,3 Triton X-100'e batırın.
    7. Slaytları PBS'de hafif çalkalayarak (2 x 5 dakika) yıkayın.
    8. Oda sıcaklığında (60 dakika) PBS'de% 10 keçi serumunu bloke edin.
    9. Bloke edici tamponu aspire edin ve gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor ile inkübe edin.
    10. Slaytları 1x PBS (3 x 5 dakika) ile yıkayın.
    11. Antikor seyreltme tamponunda seyreltilmiş florokrom işaretli ikincil antikor ile inkübe edin.
    12. Slaytları 1x PBS (3 x 3 dakika) ile yıkayın.
    13. Kızakları monte edin ve kapatın.
11. Bir slayt tarayıcıda 40x objektif kullanarak lekeli slaytları dijital olarak tarayın.
12. Görüntüleri analiz edin ve referans verilen yazılımı kullanarak ürotelyumun kalınlığını ölçün (Malzeme Tablosu).
    1. Yazılımı açın.
    2. Lekeli slayt görüntülerini seçmek için Yerel Bilgisayar'ı tıklatın.
    3. Ürotelyumun kalınlığını ölçmek için Mesafeyi Ölç'e tıklayın.
    4. Ürotelyum kalınlığı ile ilgili verileri kaydedin.

Sonuçlar

Bu çalışmada özetlenen protokol, sıçanlarda başarılı bir şekilde stabil üretral darlık sağladı ve yüksek tekrarlanabilirlik gösterdi. Ameliyatların ortalama süresi 20 dakika idi ve işlemler sırasında herhangi bir teknik sorun yaşanmadı. Üretral örnekler işlemden 4 hafta sonra başarılı bir şekilde toplandı.

Deney grubunda, sıçanların mesaneleri, mesanelerin boş olduğu kontrol grubunun aksine aşırı şişkinlik belirtileri g...

Tartışmalar

ABD, hem psikolojik hem de fiziksel refahı olumsuz yönde etkileyen, önemli bir ekonomik etkiye sahip önemli bir sağlık yükü oluşturmaktadır²⁰. Sadece US'yi tamamen iyileştirmekle kalmayıp aynı zamanda nüksünü etkili bir şekilde önleyen bir tedaviye hala ihtiyaç vardır.

Bu çalışmada, hastalarda üretral yaralanmayı taklit etmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirmek için bir sıçan modeli kullan...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable sutures (6-0)	KERONG COMPANY	KR2230814
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
CaseViewer 2.4	3DHISTECH Ltd.
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-2
H&E Stain Kit	Abcam	ab150669
high-frequency electrosurgical unit	Beijing Taktvoll Technology Company	ES-100v
Masson staining kit	Merck	HT15
needle-holding pliers	RWD Life Science	S15001-11
Paraffin oil	NA	NA
smooth forceps	RWD Life Science	F13019-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
suture scissors	RWD Life Science	S15001-11
Teflon coated catheter (0.6 mm x 1 mm)	DGZF new materials company	NA
TGF Beta 1 Polyclonal antibody	Proteintech	21898-1-AP
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14