Lesão iatrogênica recapitulada: técnica de eletroexcisão para modelagem de estenose uretral em ratos

Resumo

Neste estudo, apresentamos um modelo novo, eficiente e estável de estenose uretral em ratos criado por eletroexcisão da uretra de ratos, que simula efetivamente a lesão iatrogênica observada em ambientes clínicos.

Resumo

A estenose uretral (US) é uma condição clínica comum em urologia, caracterizada por alta prevalência e morbidade em todas as idades. Os tratamentos atuais para US, como dilatação uretral e uretrotomia interna, não resolvem completamente a condição e estão associados a altas taxas de recorrência e complicações.

Além disso, a patogênese da US não é bem compreendida. Para explorar a patogênese da US e desenvolver novas estratégias terapêuticas, é crucial estabelecer um modelo padronizado de ratos que reflita com precisão as manifestações clínicas. Este estudo descreve um método simples e repetível para induzir US em ratos usando uma faca elétrica de alta frequência. O método envolve fazer uma incisão longitudinal com a faca elétrica ajustada para um modo de corte misto unipolar a 4 W, que inflige danos uretrais significativos. A análise histopatológica mostra espessamento do urotélio, infiltração inflamatória e fibras colágenas desorganizadas. Este modelo replica efetivamente a lesão iatrogênica por meio de eletroexcisão na uretra de ratos. Em resumo, este estudo estabelece com sucesso um modelo de US em ratos novo, eficiente e estável que imita de perto o cenário clínico, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisas futuras sobre os mecanismos e novos tratamentos para US.

Introdução

A estenose uretral (US) está entre as condições urológicas mais antigas e continua a ser amplamente prevalente. Dados recentes sugerem que existem entre 229 e 627 casos de US por 100.000 homens¹. Aqueles que sofrem de US experimentam uma série de sintomas, incluindo sintomas do trato urinário inferior², dor³ e disfunção sexual⁴. Vários tratamentos médicos estão disponíveis, como uretrotomia, uretroplastia e dilatação⁵. No entanto, esses tratamentos são frequentemente complicados por questões como sangramento, infecção e incontinência, contribuindo para a carga da doença e exibindo taxas variáveis de recorrência ^6,7. Consequentemente, identificar as abordagens terapêuticas mais eficazes continua sendo um desafio crítico envolvendo pesquisadores e médicos.

A US é geralmente caracterizada como um estreitamento da uretra anterior causado por fibrose e cicatrização da mucosa uretral e do tecido esponjoso circundante⁸. Apesar de sua prevalência, as causas e mecanismos subjacentes à US são pouco compreendidos, e há uma falta de modelos animais adequados para um estudo aprofundado. A lesão iatrogênica, principalmente por cirurgia transuretral, é atualmente a principal causa de US, correspondendo a 41% dos^casos9. Portanto, um modelo animal ideal para pesquisa nos EUA deve replicar com precisão lesões clínicas comuns, exibir semelhanças genômicas e proteômicas próximas aos humanos e demonstrar eficiência e estabilidade. Tal modelo facilitaria muito investigações mais profundas sobre a patogênese da US e o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes.

Para investigar o processo patogênico e o mecanismo de tipos clínicos comuns, vários modelos animais foram desenvolvidos usando animais de grande porte, como coelhos^10,11, cães¹² e porcos^13,14 empregando técnicas como eletrocoagulação, eletrorressecção¹⁵ e injeções de bleomicina¹⁶. No entanto, esses modelos geralmente enfrentam desafios devido a limitações de tamanho de amostra e diferenças genéticas em relação aos humanos. Além disso, o custo-benefício do uso de animais de grande porte deve ser considerado; Apesar dos altos custos associados aos cuidados diários, os animais de grande porte também apresentam riscos significativos de infecção, necessitando de cuidados pós-operatórios extensivos e despesas consideráveis. Está bem documentado que os roedores compartilham características fisiológicas e patológicas com os humanos em muitos sistemas de órgãos. Um estudo recente mostrou homologia entre as células do trato urinário de animais roedores e humanos¹⁷. Além disso, os custos de compra, alojamento e cuidados pós-operatórios de ratos são significativamente menores do que os de animais de grande^{porte 18}. Consequentemente, um modelo de rato dos EUA é considerado adequado; no entanto, o desenvolvimento de tais modelos em ratos foi descrito de forma inadequada.

Estudos anteriores utilizaram ferramentas cirúrgicas, como lâminas ou agulhas, para induzir a US em modelos de ratos¹⁹. Essa abordagem tem sido associada a riscos como danos aos vasos sanguíneos periuretrais, levando a sangramento significativo. A natureza subjetiva desses procedimentos cirúrgicos também pode resultar em variabilidade na extensão da lesão mecânica, carecendo de critérios quantitativos para modelagem, o que pode afetar a avaliação dos resultados do reparo uretral em estudos terapêuticos subsequentes.

Dadas essas considerações, há uma clara necessidade de desenvolver um modelo adicional de rato dos EUA. Para estabelecer um modelo de US eficiente, econômico e estável em ratos, empregamos uma máquina de faca elétrica de alta frequência em nossa pesquisa. Este modelo facilitará novas investigações sobre os mecanismos da US e a avaliação de novas abordagens terapêuticas antes de prosseguir para os ensaios clínicos.

Protocolo

Nesta investigação, vinte ratos Sprague-Dawley machos de 6 meses de idade, cada um pesando 400-500 g, foram empregados. Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Quinto Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-Sen (número de aprovação: 00349). Os animais foram alojados em uma instalação com temperatura e condições de iluminação controladas. Uma característica fundamental da estenose uretral é o desenvolvimento de cicatrizes na uretra. Com base no cronograma estabelecido para a formação de cicatrizes, que normalmente ocorre dentro de 4 semanas após a lesão, designamos a presença de tecido cicatricial discernível na uretra na marca de 4 semanas de pós-operatório como o desfecho experimental.

1. Preparação de instrumentos cirúrgicos

1. Prepare os seguintes materiais cirúrgicos: cateter revestido de teflon (0,6 x 1 mm), suturas absorvíveis (6-0), tesouras de sutura, pinça de tecido, alicate de fixação de agulha, pinça lisa, unidade eletrocirúrgica de alta frequência (Figura 1), incluindo o painel do bisturi elétrico de alta frequência, eletrodo cirúrgico de alta frequência e a haste condutora anal (ver Tabela de Materiais).
2. Limpe a área cirúrgica com lenços umedecidos com álcool contendo etanol 75%.
3. Preparação para usar uma faca elétrica de alta frequência em um modo de corte elétrico unipolar.
   1. Conecte a faca elétrica de alta frequência à fonte de alimentação principal de 220 V aterrada usando um cabo de alimentação.
   2. Insira o cabo da faca esterilizado controlado manualmente e a haste condutora em seus respectivos soquetes (Figura 1C).
      NOTA: Certifique-se de que todos os cabos de alimentação estejam conectados firmemente para manter a segurança da cirurgia.

2. Preparação do animal

1. Retire o pentobarbital sódico (60 mg/kg) para uma seringa.
2. Prenda o rato segurando sua cauda com a mão dominante e segurando a pele de suas orelhas e pescoço com a mão não dominante para garantir que esteja firmemente fixado.
3. Exponha a parte inferior do abdômen do rato e desinfete a área com bolas de algodão embebidas em etanol a 75%.
4. Insira a agulha da seringa aproximadamente 1-2 mm ao lado da linha média abdominal na parte inferior do abdômen, direcionando-a para a cavidade abdominal em um ângulo de 45°.
   NOTA: Você sentirá uma perda de resistência quando a agulha penetrar no peritônio.
5. Puxe suavemente o êmbolo da seringa para trás para garantir que não haja sangue ou fluido na seringa.
6. Injete lentamente o pentobarbital de sódio. Retire a agulha, completando a injeção, e desinfete novamente o local com bolas de algodão embebidas em etanol a 75%.
7. Monitore o ritmo respiratório do rato e aperte sua pata traseira para verificar os reflexos.
   NOTA: Confirme se a respiração do rato está estável e se não mostra reflexos antes de prosseguir com a cirurgia.
8. Esprema a pomada de eritromicina e mergulhe um cotonete na pomada. Aplique a pomada com o cotonete nas córneas de ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea durante o procedimento.
9. Use um barbeador elétrico para depilar a parte inferior do abdômen e o períneo após a confirmação da anestesia.
10. Limpe os pelos soltos da área raspada com um lenço umedecido com solução salina.
11. Desinfete a área limpando-a duas vezes com uma esponja de gaze embebida em iodóforo para minimizar a irritação da pele.
12. Coloque o rato profundamente anestesiado em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 ° C em decúbito dorsal. Garanta a esterilidade durante os procedimentos cirúrgicos usando luvas médicas.

3. Cateterismo uretral e procedimento de lesão

1. Insira a haste condutora no ânus do rato para estabelecer um circuito fechado eficaz para a máquina de faca elétrica de alta frequência (Figura 2A).
2. Cateterize a uretra do rato para auxiliar no posicionamento e fornecer suporte durante as etapas de pós-processamento da cirurgia.
   1. Lubrifique o cateter urinário com óleo de parafina.
   2. Exponha o pênis apertando a pele ao redor dele para projetá-lo do abdômen.
   3. Desinfete o pênis do rato com uma esponja de gaze embebida em iodóforo.
   4. Abra suavemente o orifício uretral com uma pinça lisa e insira o cateter lubrificado na uretra.
   5. Insira cuidadosamente o cateter revestido de Teflon na uretra com o ritmo da contração uretral; evitar qualquer inserção forçada (Figura 2B).
   6. Se houver resistência, puxe suavemente o pênis em direção ao lado ventral para ajustar o ângulo de flexão do pênis e continue avançando o cateter na bexiga até que a urina flua para fora (Figura 2C).
   7. Confirme o cateterismo bem-sucedido, garantindo que o pênis forme um ângulo aproximado de 45° com o abdômen (Figura 2D).
3. Ligue a máquina de faca elétrica de alta frequência, clique nos botões do painel de facas de alta frequência para selecionar o modo de corte misto unipolar e defina a potência para 4 W para as etapas seguintes de eletroexcisão do pênis camada por camada.
4. Alinhe a incisão com o cateter. Pressione o botão amarelo no cabo da faca eletrocirúrgica e faça uma incisão ao longo da linha de marcação do cateter da pele peniana até a camada externa da uretra usando a faca elétrica até que a uretra esteja exposta (Figura 3A,B).
   NOTA: Certifique-se de pressionar o botão amarelo para eletroexcisão, não o botão azul para eletrocoagulação.
5. Continuar a fazer uma incisão longitudinal de 0,5 cm na uretra com o bisturi elétrico, garantindo um diâmetro transversal de 0,1 cm, até que o cateter fique visível (Figura 3C).
6. Suturar a ferida e a pele superficial camada por camada usando suturas absorvíveis (6-0) com pontos contínuos ou interrompidos (Figura 3D,E).
7. Remova o cateter de uretra e reposicione o pênis (Figura 3F).
8. Desligue a faca elétrica de alta frequência e remova a haste condutora do ânus do rato.
9. Limpe os materiais cirúrgicos com lenços umedecidos com álcool (etanol a 75%).

4. Cuidados pós-operatórios

1. Coloque o rato em uma almofada aquecida (37 ° C) e monitore de perto sua recuperação da anestesia. Preste muita atenção à condição física do rato, incluindo ritmo respiratório, temperatura corporal e nível de consciência.
   NOTA: Não devolva o rato à sua gaiola até que a recuperação total seja observada.
2. Aloje os ratos em uma gaiola limpa e encha a garrafa de água com água enriquecida com morfina (0,4 mg / kg) para o controle diário da dor após a recuperação.
3. Administre anti-inflamatórios não esteróides (como carprofeno, 0,5 mg / kg, injeção subcutânea) para a recuperação total dos ratos da dor pós-operatória.

5. Avaliação histológica

1. Quatro semanas após a cirurgia, induza o reflexo miccional levantando a cauda dos ratos. Coloque o rato em uma caixa de eutanásia, abra a válvula do tubo de transmissão de CO₂ e eutanasiará humanamente os ratos com uma overdose de CO₂.
2. Desligue a válvula depois de confirmar que o rato está imóvel e sem respirar e observar que a pupila está dilatada. Continue a observar a condição física do rato por 2 minutos para confirmar que a eutanásia foi bem-sucedida.
3. Remova o rato da caixa de eutanásia.
4. Limpe a área cirúrgica e os materiais cirúrgicos com lenços umedecidos em etanol a 75%.
5. Disseque o abdômen para observar o estado de enchimento da bexiga e colha toda a uretra.
6. Após a colheita da uretra, colocar o rato num saco de fecho e guardá-lo num frigorífico a 4 °C para processamento por técnicos de laboratório.
7. Avaliar morfologicamente o US para patologia macroscópica, com foco na cor e suavidade do tecido.
8. Pinte o tecido da uretra com hematoxilina e eosina (H&E) para visualizar a estrutura da ferida e a camada de células uroteliais.
   1. Mergulhe as lâminas em xileno para desparafinização (2 x 5 min).
   2. Reidrate as lâminas em etanol em ordem (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
   3. Lave as lâminas em água desionizada (2 min).
   4. Manchar as lâminas com hematoxilina (10 min).
   5. Lave as lâminas em água deionizada (5 min).
   6. Diferenciar as amostras com solução de diferenciação (40 s).
   7. Lave as lâminas em água deionizada (2 x 3 min).
   8. Pintar as lâminas com eosina (2 min).
   9. Reidrate as lâminas em etanol em uma ordem (100% 1 x 3 s, 95% 1 x 3 s, 85% 1 x 3 s, 75% 1 x 3 s)
   10. Mergulhe as lâminas em etanol 100% (1 min) e transparenteize as lâminas com xileno (2 x 1 min).
   11. Adicione bálsamo neutro e sele com a lamínula.
9. Aplique a coloração tricrômica de Masson no tecido da uretra para destacar a estrutura da fibra de colágeno.
   1. Mergulhe as lâminas em xileno para desparafinização (2 x 5 min).
   2. Reidrate as lâminas em etanol em ordem (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
   3. Lave as lâminas em água desionizada (2 min).
   4. Manchar as lâminas com solução de Hematoxilina de Ferro Weigert (5 min).
   5. Lave as lâminas em água deionizada (5 min).
   6. Pinte as lâminas em Fucshin de Ácido Escarlate Biebrich (5 min).
   7. Lave as lâminas em água deionizada (2 x 3 min).
   8. Manchar as lâminas com solução de ácido fosfomolíbdico (5 min).
   9. Coloque as lâminas em solução de Azul de Anilina (5 min). Descarte a solução.
   10. Enxágue as lâminas, desidrate com álcool e limpe em xileno.
   11. Adicione bálsamo neutro e sele com a lamínula.
10. Realize a coloração por imunofluorescência usando um anticorpo TGF-β para avaliar a camada de células uroteliais.
    1. Adicione o tampão de recuperação de antígeno apropriado à panela de pressão. Coloque a panela de pressão na placa de aquecimento e ligue-a na potência máxima.
    2. Depois de ferver, transfira as lâminas da água da torneira para a panela de pressão. Deixe correr água fria sobre o fogão e aqueça as lâminas por 10 min.
    3. Desligue a panela de pressão e remova as corrediças. Resfrie as lâminas à temperatura ambiente.
    4. Lave as lâminas com solução PBS.
    5. Marque as margens das amostras com caneta bloqueadora de líquidos.
    6. Mergulhe as lâminas em PBS mais 0,3% Triton X-100 por 30 min.
    7. Lave as lâminas em PBS com agitação suave (2 x 5 min).
    8. Bloquear em soro de cabra a 10% em PBS à temperatura ambiente (60 min).
    9. Aspirar tampão de bloqueio e incubar com anticorpo primário a 4 °C durante a noite.
    10. Lave as lâminas com 1x PBS (3 x 5 min).
    11. Incubar com anticorpo secundário marcado com fluorocromo diluído em tampão de diluição de anticorpos.
    12. Lave as lâminas com 1x PBS (3 x 3 min).
    13. Monte e sele as lâminas.
11. Digitalize digitalmente as lâminas coradas usando uma objetiva de 40x em um scanner de lâminas.
12. Analise as imagens e meça a espessura do urotélio usando o software referenciado (Tabela de Materiais).
    1. Abra o software.
    2. Clique em Computador local para selecionar as imagens de slides manchadas.
    3. Clique em Medir distância para medir a espessura do urotélio.
    4. Registre os dados sobre a espessura do urotélio.

Resultados

O protocolo descrito neste estudo estabeleceu com sucesso estenose uretral estável em ratos e demonstrou alta reprodutibilidade. A duração média das operações foi de 20 min, e nenhum problema técnico surgiu durante os procedimentos. As amostras uretrais foram colhidas com sucesso 4 semanas após o procedimento.

No grupo experimental, as bexigas dos ratos apresentaram sinais de hiperdistensão, em contraste com o grupo controle onde as bexigas estavam va...

Discussão

Os EUA representam um fardo significativo para a saúde com um impacto econômico substancial, afetando adversamente o bem-estar psicológico e físico²⁰. Ainda há necessidade de um tratamento que não apenas cure completamente a US, mas também previna efetivamente sua recorrência.

Neste estudo, utilizamos um modelo de rato para desenvolver um método simples e reprodutível para mimetizar a lesão uretral em pacientes, que foi segui...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable sutures (6-0)	KERONG COMPANY	KR2230814
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
CaseViewer 2.4	3DHISTECH Ltd.
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-2
H&E Stain Kit	Abcam	ab150669
high-frequency electrosurgical unit	Beijing Taktvoll Technology Company	ES-100v
Masson staining kit	Merck	HT15
needle-holding pliers	RWD Life Science	S15001-11
Paraffin oil	NA	NA
smooth forceps	RWD Life Science	F13019-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
suture scissors	RWD Life Science	S15001-11
Teflon coated catheter (0.6 mm x 1 mm)	DGZF new materials company	NA
TGF Beta 1 Polyclonal antibody	Proteintech	21898-1-AP
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14