A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة تحديد الخلايا البيروبوتية باستخدام قياس التدفق الخلوي بعد تلطيخ مزدوج بالأجسام المضادة ضد الجزء N-terminal من الدجاج GSDME (chGSDME-NT) ويوديد البروبيديوم (PI).

Abstract

Pyroptosis هو نوع التهابي من موت الخلايا المبرمج مدفوعا في الغالب بتكوين مسام غشاء البلازما بواسطة N-terminus المتولدة من بروتينات عائلة Gasdermin المشقوقة (GSDM). يعد فحص GSDM-NT المتصل بالغشاء بواسطة Western Blot هو الطريقة الأكثر استخداما لتقييم pyroptosis. ومع ذلك ، من الصعب التمييز بين الخلايا المصابة بالبيروبتوسيس والأشكال الأخرى لموت الخلايا باستخدام هذه الطريقة. في هذه الدراسة ، تم استخدام خلايا DF-1 المصابة بفيروس مرض الجراب المعدي (IBDV) كنموذج لتحديد نسبة الخلايا التي تخضع لداء البيروبتوسيس عن طريق قياس التدفق الخلوي ، باستخدام أجسام مضادة محددة ضد الجزء الطرفي N من الدجاج GSDME (chGSDME-NT) وتلطيخ يوديد البروبيديوم (PI). كانت الخلايا الإيجابية ل chGSDME-NT قابلة للاكتشاف بسهولة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل chGSDME-NT التي تحمل علامة Alexa Fluor 647. علاوة على ذلك ، كانت نسبة الخلايا الإيجابية المزدوجة chGSDME-NT / PI في الخلايا المصابة بفيروس IBDV (حوالي 33٪) أكبر بكثير من الضوابط المصابة بالوهمية (P < 0.001). تشير هذه النتائج إلى أن فحص chGSDME-NT المرتبط بالغشاء عن طريق قياس التدفق الخلوي هو نهج فعال لتحديد الخلايا البيروبوتية بين الخلايا التي تمر بموت الخلايا.

Introduction

Pyroptosis هو نوع التهابي من موت الخلايا المبرمج الذي يعتمد بشكل أساسي على تكوين مسام غشاء البلازما بواسطة Gasdermin (GSDM) D في الثدييات1،2،3. بسبب النقص الوراثي في GSDMD في الدجاج 4,5 ، لا تزال آلية pyroptosis في الدجاج بعيدة المنال. تتكون عائلة Gasdermin من بروتينات محفوظة ، بما في ذلك GSDMA و GSDMB و GSDMC و GSDMD و GSDME و DFNB59 3,6. أفادت الدراسات أن GSDME من أسماك وبط teleost مشقوق بواسطة caspase-1/3/7 أو caspase-3/7 للحث على موت الخلايا البيروبوتية

Protocol

يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير خلايا العينة

  1. زراعة خلايا DF-1 (الخلايا الليفية لجنين الدجاج الخالد) في ستة ألواح (5 × 105 خلايا لكل بئر) مع وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 38 درجة مئوية.
  2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، تخلص من وسط زراعة الخلايا المحتوي على المصل ، واغسل الخلايا ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم أضف 2 مل من وسط زراعة الخلايا الخالية من المصل إلى كل بئر.
  3. أضف محلول فيروس IBDV (الذي يحتوي على MOI المحسوب) إلى كل ب....

النتائج

يمكن اكتشاف chGSDME-NT على غشاء خلايا DF-1 المصابة بعدوى IBDV بسهولة عن طريق قياس التدفق الخلوي
واحدة من أهم ميزات الخلايا pyroptotic هي تشكيل مسام الغشاء بواسطة شظايا GSDM-NT الناتجة عن انقسام Gasdermin. لذلك ، يمكن نظريا اكتشاف الخلايا البيروبتونية عن طريق قياس التدفق الخلوي عن طريق<.......

Discussion

توضح هذه المقالة طريقة فعالة لفحص pyroptosis باستخدام قياس التدفق الخلوي ، والذي يتحقق من خلال تلطيخ مزدوج للخلايا المصابة باستخدام Alexa Fluor 647 المسمى بمكافحة chGSDME-NT McAb و PI. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج عبر أنواع مختلفة من الخلايا للتمييز بين داء البيروبتوسيس والأنواع الأخرى من موت الخلايا ، م?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ونود أن نشكر الدكتور جو ليو على مساعدته الكريمة. تم دعم هذه الدراسة بمنح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2022YFD1800300) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 32130105) ، والصندوق المخصص لنظام أبحاث تكنولوجيا الصناعة الزراعية الحديثة (No. CARS-40)، الصين.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)Corning Falcon352052
6 Well Cell Culture PlateCorning3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kitsThermo Fisher ScientificA20186
Anti-chGSDME-CT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0228
Anti-chGSDME-NT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0227
CellQuest softwareBD Biosciences
CO2 incubatorThermo Fisher Scientific3100
Cryogenic Freezing CentrifugeEppendorf5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco by Life TechnologiesC11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF0193-500ML
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCalibur
Flow Cytometry Staining BufferThermo Fisher Scientific00-4222-26
HemocytometerQiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)YX-JSB52
IBDV Lx strainIBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted MicroscopeChongqing Photoelectric Instrument CompanyXDS-1B
Normal Mouse IgGSanta Cruz Biotechnologysc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)M&C  Gene TechnologyCC017
Propidium Iodide(PI)Sigma-AldrichP4170
Trypsin-EDTA, 0.25%M&C  Gene TechnologyCC008
Vortex OscillatorMIULABMIX-28+

References

  1. He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
  2. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Ga....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

GSDM IBDV DF 1 ChGSDME NT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved