Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة تحديد الخلايا البيروبوتية باستخدام قياس التدفق الخلوي بعد تلطيخ مزدوج بالأجسام المضادة ضد الجزء N-terminal من الدجاج GSDME (chGSDME-NT) ويوديد البروبيديوم (PI).

Abstract

Pyroptosis هو نوع التهابي من موت الخلايا المبرمج مدفوعا في الغالب بتكوين مسام غشاء البلازما بواسطة N-terminus المتولدة من بروتينات عائلة Gasdermin المشقوقة (GSDM). يعد فحص GSDM-NT المتصل بالغشاء بواسطة Western Blot هو الطريقة الأكثر استخداما لتقييم pyroptosis. ومع ذلك ، من الصعب التمييز بين الخلايا المصابة بالبيروبتوسيس والأشكال الأخرى لموت الخلايا باستخدام هذه الطريقة. في هذه الدراسة ، تم استخدام خلايا DF-1 المصابة بفيروس مرض الجراب المعدي (IBDV) كنموذج لتحديد نسبة الخلايا التي تخضع لداء البيروبتوسيس عن طريق قياس التدفق الخلوي ، باستخدام أجسام مضادة محددة ضد الجزء الطرفي N من الدجاج GSDME (chGSDME-NT) وتلطيخ يوديد البروبيديوم (PI). كانت الخلايا الإيجابية ل chGSDME-NT قابلة للاكتشاف بسهولة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل chGSDME-NT التي تحمل علامة Alexa Fluor 647. علاوة على ذلك ، كانت نسبة الخلايا الإيجابية المزدوجة chGSDME-NT / PI في الخلايا المصابة بفيروس IBDV (حوالي 33٪) أكبر بكثير من الضوابط المصابة بالوهمية (P < 0.001). تشير هذه النتائج إلى أن فحص chGSDME-NT المرتبط بالغشاء عن طريق قياس التدفق الخلوي هو نهج فعال لتحديد الخلايا البيروبوتية بين الخلايا التي تمر بموت الخلايا.

Introduction

Pyroptosis هو نوع التهابي من موت الخلايا المبرمج الذي يعتمد بشكل أساسي على تكوين مسام غشاء البلازما بواسطة Gasdermin (GSDM) D في الثدييات1،2،3. بسبب النقص الوراثي في GSDMD في الدجاج 4,5 ، لا تزال آلية pyroptosis في الدجاج بعيدة المنال. تتكون عائلة Gasdermin من بروتينات محفوظة ، بما في ذلك GSDMA و GSDMB و GSDMC و GSDMD و GSDME و DFNB59 3,6. أفادت الدراسات أن GSDME من أسماك وبط teleost مشقوق بواسطة caspase-1/3/7 أو caspase-3/7 للحث على موت الخلايا البيروبوتية 7,8. ومع ذلك ، لا يزال يتعين توضيح دور داء البيروبتوسيس بوساطة GSDME في استجابة المضيف للعدوى المسببة للأمراض في الدجاج.

مرض الجراب المعدي (IBD) هو مرض دواجن حاد وشديد العدوى ومثبط للمناعة يسببه IBDV9. IBDV ، وهو فيروس RNA مزدوج المقطع ثنائي المقطع (ds) غير مغلف ، ينتمي إلى جنس Avibirnavirus في عائلة Birnaviridae10. أظهرت الدراسات السابقة التي أجراها آخرون ومختبرنا أن عدوى IBDV تحفز موت الخلايا في الخلايا المضيفة عبر مسارات مختلفة11،12،13،14. أظهرت النتائج السابقة أن عدوى IBDV تؤدي إلى إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ، وهو مؤشر على موت الخلايا المحللة 6,15 ، مما يشير إلى أن عدوى IBDV تحفز موت الخلايا المحللة في الخلايا المضيفة. علاوة على ذلك ، تظهر البيانات أن الخلايا المصابة بفيروس IBDV تظهر سمات مورفولوجية لموت الخلايا البيروبوتية ، بما في ذلك تورم الخلايا مع فقاعات كبيرة تهب من غشاء البلازما وتلطيخ يوديد البروبيديوم (PI) الإيجابي ، مما يشير إلى أن عدوى IBDV تحفز pyroptosis في الخلايا.

بالنظر إلى أن تكوين مسام الغشاء في الخلايا البيروبوتية بواسطة الجزء N-terminal من GSDM المشقوق (GSDM-NT) هو السمة المميزة ل pyroptosis ، من الناحية النظرية ، يمكن اكتشاف الخلايا البيروبوتية عن طريق قياس التدفق الخلوي عن طريق فحص GSDM-NT على غشاء الخلية باستخدام أجسام مضادة محددة. في الخلايا البيروبوتية للطيور ، تشكل الجزء N-terminal من الدجاج Gasdermin E (chGSDME-NT) مسام غشائية ، مما يسمح ليوديد البروبيديوم (PI) بالمرور عبر الحمض النووي وربطه. وبالتالي ، يمكن الكشف عن نسبة الخلايا البيروبوتية باستخدام قياس التدفق الخلوي ، وبالتالي التمييز بين pyroptosis والأشكال الأخرى لموت الخلايا ، مثل موت الخلايا المبرمج والنخر. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن طريقة فحص الخلايا pyroptotic عن طريق قياس التدفق الخلوي. في هذه الدراسة ، أصيبت خلايا DF-1 بفيروس IBDV ، وتم إجراء قياس التدفق الخلوي لفحص الخلايا البيروبتونية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (McAb) ضد جزء chGSDME-NT (المرتبط بالغشاء) وتلطيخ PI. والمثير للدهشة أن الخلايا البيروبوتية تم اكتشافها بشكل فعال عن طريق قياس التدفق الخلوي. علاوة على ذلك ، يمكن تحديد نسبة الخلايا البيروبوتية. توفر هذه النتائج وسيلة قوية وفعالة لتحديد pyroptosis.

توضح هذه المقالة طريقة لفحص pyroptosis في الخلايا المصابة ب IBDV عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام تلطيخ MCAB و PI المضاد ل chGSDME-NT. يمكن أيضا توسيع هذه الطريقة لتشمل الخلايا الأخرى المصابة بمسببات الأمراض وتطبيقها لفحص أنواع مختلفة من الخلايا المصابة بالبيروبتوسيس ، وتمييزها عن الأشكال الأخرى لموت الخلايا.

Protocol

يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير خلايا العينة

  1. زراعة خلايا DF-1 (الخلايا الليفية لجنين الدجاج الخالد) في ستة ألواح (5 × 105 خلايا لكل بئر) مع وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 38 درجة مئوية.
  2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، تخلص من وسط زراعة الخلايا المحتوي على المصل ، واغسل الخلايا ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم أضف 2 مل من وسط زراعة الخلايا الخالية من المصل إلى كل بئر.
  3. أضف محلول فيروس IBDV (الذي يحتوي على MOI المحسوب) إلى كل بئر ، وقم بإعداد عنصر تحكم وهمي مصاب عن طريق إضافة حجم DMEM مساو لحجم محلول الفيروس.
  4. بعد 1 ساعة من امتزاز الفيروس ، تخلص من وسط المزرعة ، واغسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات ، وأضف 2 مل من DMEM المكمل ب 2٪ FBS إلى كل بئر ، واستمر في زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة.
  5. بعد 24 ساعة من الإصابة بفيروس التهاب الأمعاء الالتهابي، يتم إجراء علاج التربسين (500 ميكرولتر لكل بئر) لمدة 1 دقيقة ثم تحييده بواسطة DMEM المكمل ب 10٪ FBS (2 مل لكل بئر). بعد ذلك ، يجب حصاد الخلايا لإعداد معلقات أحادية الخلية لقياس التدفق الخلوي.
  6. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 2-8 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
  7. أعد تعليق حبيبات الخلية في برنامج تلفزيوني وقم بتحريك الأنابيب برفق لمدة 3 ثوان.
  8. أجهزة الطرد المركزي للخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.6 (400 × جم لمدة 5 دقائق عند 2-8 درجة مئوية).
  9. كرر غسل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.7 والخطوة 1.8.
  10. إجراء عد الخلايا باستخدام مقياس الدم تحت المجهر. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من المخزن المؤقت لتلطيخ قياس التدفق الخلوي (بحيث يكون تركيز الخلية النهائي 1 × 107 خلايا / مل). دوامة بلطف التعليق.

2. تلطيخ الخلايا لقياس التدفق الخلوي

  1. أضف 100 ميكرولتر من المعلقات أحادية الخلية من الخطوة 1.10 إلى أنابيب البوليسترين ذات القاع المستدير سعة 5 مل (12 مم × 75 مم). قم بإعداد الخلايا الوهمية والمصابة بفيروس IBDV لتلطيخ الأجسام المضادة ل chGSDME-NT / CT ، واستخدم IgG العادي للفأر كعنصر تحكم في النمط المتماثل. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد تحكم فارغ وأنابيب ملونة مفردة بخلايا مصابة بفيروس التهاب الأمعاء.
  2. أضف 1 ميكروغرام من إما Alexa Fluor 647 المسمى بمكافحة chGSDME-NT McAb ، أو مضاد chGSDME-CT McAb ، أو IgG للماوس العادي (كعنصر تحكم في النمط المتماثل) إلى أنابيب التحكم المصابة ب IBDV و Mock-Control ، على التوالي. في وقت لاحق ، دوامة بلطف الأنابيب لمدة 3 ثوان.
  3. احتضان الخلايا الملطخة في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية أو على الثلج لمدة 30 دقيقة في الظلام. أنابيب دوامة بلطف كل 10 دقائق.
  4. اغسل الخلايا ب 1 مل من محلول تلطيخ قياس التدفق الخلوي عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 2-8 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
  5. كرر غسل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.4.
  6. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلطيخ قياس التدفق الخلوي.
  7. قم بتلطيخ خلايا المجموعة المصابة بفيروس IBDV والمجموعة المصابة بالوهمية ، بالإضافة إلى الأنابيب الملطخة المفردة PI ، مع 10 ميكروغرام / مل من PI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بإضافة 400 ميكرولتر من محلول تلطيخ قياس التدفق الخلوي لمقايسة قياس التدفق الخلوي.

3. إجراء فحص التدفق الخلوي

  1. قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي لتهيئة الجهاز وتشغيل البرنامج.
  2. ابدأ بتشغيل أنبوب التحكم الفارغ متبوعا بالأنابيب الملطخة المفردة لضبط معلمات الجهد والتعويض لمقياس التدفق الخلوي. استخدم قنوات التألق FL3 و FL4 ، التي تنبعث عند 635 نانومتر ، للكشف عن فلوروفورات PI و Alexa Fluor 647 ، على التوالي.
  3. بعد تكوين جميع المعلمات ، قم بتشغيل جميع العينات بالتتابع.

4. تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي

  1. قم بتحليل تلطيخ Alexa Fluor 647 لكل عينة في الرسم البياني لقناة FL4.
  2. لتقييم نسبة الخلايا الإيجابية المزدوجة في كل عينة ، استخدم مخطط النقطة المكون من أربعة أرباع FL3 / FL4.
  3. قم بتعيين عتبات موجبة بناء على عينات IgG / PI المزدوجة للتحكم في النمط المتماثل ، مما يضمن بقاء نسبة الخلايا الإيجابية المزدوجة أقل من 1٪. يسهل هذا النهج قياس نسبة الخلايا الإيجابية المزدوجة في جميع العينات.

النتائج

يمكن اكتشاف chGSDME-NT على غشاء خلايا DF-1 المصابة بعدوى IBDV بسهولة عن طريق قياس التدفق الخلوي
واحدة من أهم ميزات الخلايا pyroptotic هي تشكيل مسام الغشاء بواسطة شظايا GSDM-NT الناتجة عن انقسام Gasdermin. لذلك ، يمكن نظريا اكتشاف الخلايا البيروبتونية عن طريق قياس التدفق الخلوي عن طريق<...

Discussion

توضح هذه المقالة طريقة فعالة لفحص pyroptosis باستخدام قياس التدفق الخلوي ، والذي يتحقق من خلال تلطيخ مزدوج للخلايا المصابة باستخدام Alexa Fluor 647 المسمى بمكافحة chGSDME-NT McAb و PI. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج عبر أنواع مختلفة من الخلايا للتمييز بين داء البيروبتوسيس والأنواع الأخرى من موت الخلايا ، م?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ونود أن نشكر الدكتور جو ليو على مساعدته الكريمة. تم دعم هذه الدراسة بمنح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2022YFD1800300) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 32130105) ، والصندوق المخصص لنظام أبحاث تكنولوجيا الصناعة الزراعية الحديثة (No. CARS-40)، الصين.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)Corning Falcon352052
6 Well Cell Culture PlateCorning3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kitsThermo Fisher ScientificA20186
Anti-chGSDME-CT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0228
Anti-chGSDME-NT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0227
CellQuest softwareBD Biosciences
CO2 incubatorThermo Fisher Scientific3100
Cryogenic Freezing CentrifugeEppendorf5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco by Life TechnologiesC11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF0193-500ML
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCalibur
Flow Cytometry Staining BufferThermo Fisher Scientific00-4222-26
HemocytometerQiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)YX-JSB52
IBDV Lx strainIBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted MicroscopeChongqing Photoelectric Instrument CompanyXDS-1B
Normal Mouse IgGSanta Cruz Biotechnologysc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)M&C  Gene TechnologyCC017
Propidium Iodide(PI)Sigma-AldrichP4170
Trypsin-EDTA, 0.25%M&C  Gene TechnologyCC008
Vortex OscillatorMIULABMIX-28+

References

  1. He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
  2. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  3. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  4. Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9 (2022).
  5. De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
  6. Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
  7. Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
  8. Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526 (2022).
  9. Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
  10. Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
  11. Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
  12. Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724 (2020).
  13. Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
  14. Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
  15. Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
  16. Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
  17. Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

GSDM IBDV DF 1 ChGSDME NT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved