Examen de la pyroptose par cytométrie en flux

Résumé

Cet article décrit l’identification des cellules pyroptotiques à l’aide de la cytométrie en flux après double coloration avec des anticorps contre le fragment N-terminal de la GSDME de poulet (chGSDME-NT⁾ et l’iodure de propidium (PI).

Résumé

La pyroptose est un type inflammatoire de mort cellulaire programmée principalement due à la formation de pores de la membrane plasmique par l’extrémité N-terminale générée par les protéines de la famille des gasdermines clivées (GSDM). L’examen de la GSDM-NT attachée à la membrane par Western Blot est la méthode la plus couramment utilisée pour évaluer la pyroptose. Cependant, il est difficile de différencier les cellules atteintes de pyroptose des autres formes de mort cellulaire en utilisant cette méthode. Dans cette étude, des cellules DF-1 infectées par le virus de la bursite infectieuse (IBDV) ont été utilisées comme modèle pour quantifier la proportion de cellules subissant une pyroptose par cytométrie en flux, en utilisant des anticorps spécifiques contre le fragment N-terminal de la coloration GSDME de poulet (chGSDME-NT⁾ et l’iodure de propidium (PI). Les cellules positives pour chGSDME-NT étaient facilement détectables par cytométrie en flux à l’aide d’anticorps anti-chGSDME-NT marqués au Fluor 647. De plus, la proportion de cellules doublement positives chGSDME-NT^/PI dans les cellules infectées par l’IBDV (environ 33 %) était significativement plus élevée que chez les témoins infectés par un placebo (P < 0,001). Ces résultats indiquent que l’examen de la chGSDME-NT liée à la membrane par cytométrie en flux est une approche efficace pour déterminer les cellules pyroptotiques parmi les cellules en cours de mort cellulaire.

Introduction

La pyroptose est un type inflammatoire de mort cellulaire programmée qui dépend principalement de la formation de pores de la membrane plasmique par la gasdermine (GSDM) D chez les mammifères ^1,2,3. En raison de la déficience génétique de la GSDMD chez les poulets ^4,5, le mécanisme de la pyroptose chez les poulets reste insaisissable. La famille des gasdermines comprend des protéines conservées, notamment GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME et DFNB59 ^3,6. Des ét....

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des cellules d’échantillonnage

1. Cultivez des cellules DF-1 (fibroblastes d’embryon de poulet immortel) dans des plaques à six puits (5 x 10,⁵ cellules par puits) avec le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 38 °C.
2. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, jetez le milieu de culture cellulaire contenant du sérum, lavez les cellules trois fois avec une s....

Discussion

Cet article décrit une méthode efficace d’examen de la pyroptose à l’aide de la cytométrie en flux, obtenue par double coloration des cellules infectées avec Alexa Fluor 647, anti-chGSDME-NT, McAb et PI. Cette approche peut également être appliquée à divers types de cellules pour différencier la pyroptose d’autres types de mort cellulaire, tels que l’apoptose et la nécrose.

La pyroptose, un type inflammatoire de mort cellulaire programmée dépendant principalemen.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)	Corning Falcon	352052
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits	Thermo Fisher Scientific	A20186
Anti-chGSDME-CT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0228
Anti-chGSDME-NT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0227
CellQuest software	BD Biosciences
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	3100
Cryogenic Freezing Centrifuge	Eppendorf	5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0193-500ML
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Cytometry Staining Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-4222-26
Hemocytometer	Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)	YX-JSB52
IBDV Lx strain			IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted Microscope	Chongqing Photoelectric Instrument Company	XDS-1B
Normal Mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)	M&C  Gene Technology	CC017
Propidium Iodide(PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Trypsin-EDTA, 0.25%	M&C  Gene Technology	CC008
Vortex Oscillator	MIULAB	MIX-28+