Examen de la piroptosis por citometría de flujo

Resumen

En este artículo se describe la identificación de células piroptóticas mediante citometría de flujo tras tinción dual con anticuerpos contra el fragmento N-terminal de GSDME de pollo (chGSDME-NT⁾ y yoduro de propidio (PI).

Resumen

La piroptosis es un tipo inflamatorio de muerte celular programada impulsada predominantemente por la formación de poros de la membrana plasmática por el N-terminal generado a partir de las proteínas de la familia Gasdermin escindida (GSDM). El examen de GSDM-NT unido a la membrana mediante Western Blot es el método más utilizado para evaluar la piroptosis. Sin embargo, es difícil diferenciar las células con piroptosis de otras formas de muerte celular utilizando este método. En este estudio, se emplearon células DF-1 infectadas por el virus de la bursitis infecciosa (IBDV) como modelo para cuantificar la proporción de células sometidas a piroptosis por citometría de flujo, utilizando anticuerpos específicos contra el fragmento N-terminal de GSDME de pollo (chGSDME-NT⁾ y la tinción de yoduro de propidio (PI). Las células chGSDME-NT positivas fueron fácilmente detectables por citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-chGSDME-NT marcados con Alexa Fluor 647. Además, la proporción de células doble positivas chGSDME-NT/PI en las células infectadas por IBDV (alrededor del 33%) fue significativamente mayor que en los controles infectados simulados (P < 0,001). Estos hallazgos indican que el examen de chGSDME-NT unido a la membrana mediante citometría de flujo es un enfoque eficaz para determinar las células piroptóticas entre las células que experimentan muerte celular.

Introducción

La piroptosis es un tipo inflamatorio de muerte celular programada que depende principalmente de la formación de poros de la membrana plasmática por Gasdermin (GSDM) D en mamíferos ^1,2,3. Debido a la deficiencia genética de GSDMD en pollos ^4,5, el mecanismo de la piroptosis en pollos sigue siendo difícil de alcanzar. La familia Gasdermin comprende proteínas conservadas, incluyendo GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME y DFNB59 ^3,6. Los estudios han informado que l....

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de las células de muestra

1. Cultivo de células DF-1 (fibroblastos de embrión de pollo inmortal) en placas de seis pocillos (5 x 10⁵ células por pocillo) con el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% en una incubadora de CO₂ al 5% a 38 °C.
2. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, deseche el medio de cultivo celular que contiene suero, lave las células tres veces con solución salina tamponad....

Discusión

Este artículo describe un método eficaz para examinar la piroptosis mediante citometría de flujo, logrado mediante la tinción dual de células infectadas con McAb y PI anti-chGSDME-NT marcados con Alexa Fluor 647. Este enfoque también se puede aplicar en varios tipos de células para diferenciar la piroptosis de otros tipos de muerte celular, como la apoptosis y la necrosis.

La piroptosis, un tipo inflamatorio de muerte celular programada que depende principalmente de la formac.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)	Corning Falcon	352052
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits	Thermo Fisher Scientific	A20186
Anti-chGSDME-CT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0228
Anti-chGSDME-NT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0227
CellQuest software	BD Biosciences
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	3100
Cryogenic Freezing Centrifuge	Eppendorf	5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0193-500ML
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Cytometry Staining Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-4222-26
Hemocytometer	Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)	YX-JSB52
IBDV Lx strain			IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted Microscope	Chongqing Photoelectric Instrument Company	XDS-1B
Normal Mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)	M&C  Gene Technology	CC017
Propidium Iodide(PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Trypsin-EDTA, 0.25%	M&C  Gene Technology	CC008
Vortex Oscillator	MIULAB	MIX-28+