Exame de piroptose por citometria de fluxo

Resumo

Este artigo descreve a identificação de células piroptóticas usando citometria de fluxo após coloração dupla com anticorpos contra o fragmento N-terminal de GSDME de frango (chGSDME-NT⁾ e iodeto de propídio (PI).

Resumo

A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada predominantemente impulsionada pela formação de poros da membrana plasmática pelo terminal N gerado a partir das proteínas da família Gasdermin clivada (GSDM). O exame de GSDM-NT ligado à membrana por Western Blot é o método mais comumente usado para avaliar a piroptose. No entanto, é difícil diferenciar células com piroptose de outras formas de morte celular usando este método. Neste estudo, células DF-1 infectadas pelo Vírus da Doença Infecciosa da Bursa (IBDV) foram empregadas como modelo para quantificar a proporção de células submetidas à piroptose por citometria de fluxo, utilizando anticorpos específicos contra o fragmento N-terminal da coloração GSDME de galinha (chGSDME-NT⁾ e iodeto de propídio (PI). As células chGSDME-NT-positivas foram prontamente detectáveis por citometria de fluxo usando anticorpos anti-chGSDME-NT marcados com Alexa Fluor 647. Além disso, a proporção de células chGSDME-NT / PI duplamente positivas em células infectadas por IBDV (cerca de 33%) foi significativamente maior do que em controles infectados simulados (P < 0,001). Esses achados indicam que o exame de chGSDME-NT ligado à membrana por citometria de fluxo é uma abordagem eficaz para determinar células piroptóticas entre células submetidas à morte celular.

Introdução

A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada que depende principalmente da formação de poros da membrana plasmática pela Gasdermin (GSDM) D em mamíferos ^1,2,3. Devido à deficiência genética de GSDMD em galinhas ^4,5, o mecanismo de piroptose em galinhas permanece indefinido. A família Gasdermin compreende proteínas conservadas, incluindo GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 ^3,6. Estudos relataram que o GSDME de peixes teleósteos e patos é clivado por caspase-1/3/7 ou caspase-3/7 para induzir a morte celular piroptótica ^7,8. No entanto, o papel da piroptose mediada por GSDME na resposta do hospedeiro a infecções patogênicas em galinhas ainda precisa ser elucidado.

A doença infecciosa da bursa (DII) é uma doença avícola aguda, altamente contagiosa e imunossupressora causada pelo IBDV⁹. O IBDV, um vírus de RNA de fita dupla (ds) bissegmentado não envelopado, pertence ao gênero Avibirnavirus da família Birnaviridae¹⁰. Estudos anteriores de outros e de nosso laboratório mostraram que a infecção por IBDV induz a morte celular em células hospedeiras por diferentes vias 11,12,13,14. Achados anteriores demonstraram que a infecção por IBDV desencadeia a liberação de lactato desidrogenase (LDH), um indicador de morte celular lítica ^6,15, sugerindo que a infecção por IBDV induz a morte celular lítica em células hospedeiras. Além disso, os dados mostram que as células infectadas por IBDV exibem características morfológicas de morte celular piroptótica, incluindo inchaço celular com grandes bolhas soprando da membrana plasmática e coloração de iodeto de propídio (PI) positiva, sugerindo que a infecção por IBDV induz piroptose nas células.

Considerando que a formação de poros de membrana em células piroptóticas pelo fragmento N-terminal de GSDM clivado (GSDM-NT⁾ é uma marca registrada da piroptose, teoricamente, as células piroptóticas poderiam ser detectadas por citometria de fluxo examinando GSDM-NT na membrana celular usando anticorpos específicos. Em células piroptóticas aviárias, o fragmento N-terminal de galinha Gasdermin E (chGSDME-NT⁾ forma poros de membrana, permitindo que o iodeto de propídio (PI) passe e se ligue ao DNA. Assim, a proporção de células piroptóticas pode ser detectada por citometria de fluxo, distinguindo assim a piroptose de outras formas de morte celular, como apoptose e necrose. No entanto, o método de exame de células piroptóticas por citometria de fluxo não foi relatado. Neste estudo, as células DF-1 foram infectadas com IBDV, e a citometria de fluxo foi realizada para examinar células piroptóticas usando anticorpos monoclonais (McAb) contra o fragmento ^chGSDME-NT (ligado à membrana) e coloração PI. Surpreendentemente, as células piroptóticas foram efetivamente detectadas por citometria de fluxo. Além disso, a proporção de células piroptóticas pode ser quantificada. Essas descobertas fornecem um meio poderoso e eficaz para determinar a piroptose.

Este artigo descreve um método para examinar a piroptose em células infectadas por IBDV por citometria de fluxo usando coloração anti-chGSDME-NT McAb e PI. Este método também pode ser estendido a outras células infectadas por patógenos e aplicado para examinar vários tipos de células com piroptose, distinguindo-as de outras formas de morte celular.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de amostras de células

1. Cultura de células DF-1 (fibroblastos de embrião de galinha imortal) em placas de seis poços (5 x 10,⁵ células por poço) com Meio de Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em uma incubadora de 5% de CO₂ a 38 °C.
2. Quando as células atingirem 80% de confluência, descarte o meio de cultura celular contendo soro, lave as células três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, adicione 2 mL de meio de cultura celular sem soro a cada poço.
3. Adicione a solução de vírus IBDV (contendo MOI calculado) a cada poço e configure um controle infectado simulado adicionando o volume de DMEM igual ao da solução de vírus.
4. Após 1 h de adsorção do vírus, descarte o meio de cultura, lave as células com PBS três vezes, adicione 2 mL de DMEM suplementado com 2% de FBS em cada poço e continue as culturas celulares por 24 h.
5. 24 h após a infecção por IBDV, realizar tratamento com tripsina (500 μL por poço) por 1 min e posteriormente neutralizar por DMEM suplementado com 10% de FBS (2 mL por poço). Posteriormente, as células devem ser colhidas para preparar suspensões de célula única para citometria de fluxo.
6. Centrifugue as células a 400 x g durante 5 min a 2-8 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.
7. Ressuspenda o pellet celular em PBS e subtraia suavemente os tubos por 3 s.
8. Centrifugue as células conforme descrito na etapa 1.6 (400 x g por 5 min a 2-8 °C).
9. Repita a lavagem das células conforme descrito na etapa 1.7 e na etapa 1.8.
10. Realize a contagem de células usando um hemocitômetro sob um microscópio. Em seguida, ressuspenda as células em um volume apropriado de tampão de coloração por citometria de fluxo (de modo que a concentração final da célula seja de 1 x 10⁷ células / mL). Agite suavemente as suspensões.

2. Coloração celular para citometria de fluxo

1. Adicione 100 μL das suspensões unicelulares da etapa 1.10 em tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (12 mm × 75 mm). Prepare células infectadas com simulações e IBDV para coloração de anticorpos anti-chGSDME-NT^/CT e use IgG normal de camundongo como controle de isotipo. Enquanto isso, prepare o controle em branco e os tubos corados com células infectadas por IBDV.
2. Adicione 1 μg de Alexa Fluor 647 marcado com anti-chGSDME-NT McAb, anti-chGSDME-CT McAb ou IgG normal de camundongo (como controle de isotipo) a tubos infectados por IBDV e controle simulado, respectivamente. Em seguida, agite suavemente os tubos por 3 s.
3. Incube as células coradas a 2-8 °C ou no gelo por 30 min no escuro. Suavemente tubos de vórtice a cada 10 min.
4. Lave as células com 1 ml de tampão de coloração por citometria de fluxo por centrifugação a 400 x g durante 5 min a 2-8 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.
5. Repita a lavagem das células conforme descrito na etapa 2.4.
6. Ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo.
7. Corar as células do grupo infectado por IBDV e do grupo infectado simulado, bem como os tubos corados com IP simples, com 10 μg/mL de PI por 10 min à temperatura ambiente, seguido pela adição de 400 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo para o ensaio de citometria de fluxo.

3. Realização do ensaio de citometria de fluxo

1. Ligue o citômetro de fluxo para inicializar o instrumento e iniciar o software.
2. Comece executando o tubo de controle em branco seguido pelos tubos corados individuais para ajustar os parâmetros de tensão e compensação do citômetro de fluxo. Utilize os canais de fluorescência FL3 e FL4, que emitem a 635 nm, para detectar fluoróforos PI e Alexa Fluor 647, respectivamente.
3. Depois de configurar todos os parâmetros, execute todos os exemplos sequencialmente.

4. Análise dos dados de citometria de fluxo

1. Analise a coloração Alexa Fluor 647 de cada amostra no histograma do canal FL4.
2. Para avaliar a proporção de células duplamente positivas em cada amostra, utilize o gráfico de pontos de quatro quadrantes de FL3/FL4.
3. Defina limites positivos com base em amostras de coloração dupla IgG/PI de controle de isotipo, garantindo que a proporção de células duplamente positivas permaneça abaixo de 1%. Essa abordagem facilita a medição da proporção de células duplamente positivas em todas as amostras.

Resultados

chGSDME-NT na membrana de células DF-1 com infecção por IBDV pode ser prontamente detectado por citometria de fluxo
Uma das características mais importantes das células piroptóticas é a formação de poros de membrana por fragmentos de GSDM-NT gerados a partir da clivagem de Gasdermin. Portanto, as células piroptóticas poderiam teoricamente ser detectadas por citometria de fluxo por meio do exame de GSDM-NT em membranas celulares usando anticorpos específicos.<...

Discussão

Este artigo descreve um método eficaz para examinar a piroptose usando citometria de fluxo, obtida por meio da coloração dupla de células infectadas com Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT McAb e PI. Essa abordagem também pode ser aplicada em vários tipos de células para diferenciar a piroptose de outros tipos de morte celular, como apoptose e necrose.

A piroptose, um tipo inflamatório de morte celular programada dependente principalmente da formação de poros da membrana plasm...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)	Corning Falcon	352052
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits	Thermo Fisher Scientific	A20186
Anti-chGSDME-CT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0228
Anti-chGSDME-NT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0227
CellQuest software	BD Biosciences
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	3100
Cryogenic Freezing Centrifuge	Eppendorf	5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0193-500ML
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Cytometry Staining Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-4222-26
Hemocytometer	Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)	YX-JSB52
IBDV Lx strain			IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted Microscope	Chongqing Photoelectric Instrument Company	XDS-1B
Normal Mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)	M&C  Gene Technology	CC017
Propidium Iodide(PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Trypsin-EDTA, 0.25%	M&C  Gene Technology	CC008
Vortex Oscillator	MIULAB	MIX-28+