Esame della piroptosi mediante citometria a flusso

Riepilogo

Questo articolo descrive l'identificazione di cellule pirottiche mediante citometria a flusso dopo doppia colorazione con anticorpi contro il frammento N-terminale di GSDME di pollo (chGSDME-NT⁾ e lo ioduro di propidio (PI).

Abstract

La piroptosi è un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata guidata prevalentemente dalla formazione di pori della membrana plasmatica da parte dell'N-terminale generato dalle proteine della famiglia Gasdermin (GSDM). L'esame del GSDM-NT attaccato alla membrana mediante Western Blot è il metodo più comunemente usato per valutare la piroptosi. Tuttavia, è difficile differenziare le cellule con piroptosi da altre forme di morte cellulare utilizzando questo metodo. In questo studio, le cellule DF-1 infettate dal virus della malattia infettiva della borsa (IBDV) sono state impiegate come modello per quantificare la percentuale di cellule sottoposte a piroptosi mediante citometria a flusso, utilizzando anticorpi specifici contro il frammento N-terminale del GSDME di pollo (chGSDME-NT⁾ e la colorazione con ioduro di propidio (PI). Le cellule chGSDME-NT-positive erano facilmente rilevabili mediante citometria a flusso utilizzando gli anticorpi anti-chGSDME-NT marcati con Alexa Fluor 647. Inoltre, la percentuale di cellule double-positive chGSDME-NT^/PI nelle cellule infettate da IBDV (circa il 33%) era significativamente maggiore rispetto ai controlli con mock-infected (P < 0,001). Questi risultati indicano che l'esame del chGSDME-NT legato alla membrana mediante citometria a flusso è un approccio efficace per determinare le cellule piroptotiche tra le cellule in fase di morte cellulare.

Introduzione

La piroptosi è un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata che dipende principalmente dalla formazione dei pori della membrana plasmatica da parte di Gasdermin (GSDM) D nei mammiferi ^1,2,3. A causa del deficit genetico di GSDMD nei polli ^4,5, il meccanismo della piroptosi nei polli rimane sfuggente. La famiglia Gasdermin comprende proteine conservate, tra cui GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 ^3,6. Gli studi hanno riportato che il GSDME dei pe....

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione delle celle campione

1. Coltura di cellule DF-1 (fibroblasti di embrioni di pollo immortali) in piastre a sei pozzetti (5 x 10,⁵ cellule per pozzetto) con Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in un incubatore al 5% di CO₂ a 38 °C.
2. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, scartare il terreno di coltura cellulare contenente siero, lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamp....

Discussione

Questo articolo descrive un metodo efficace per esaminare la piroptosi utilizzando la citometria a flusso, ottenuta attraverso la doppia colorazione delle cellule infette con Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT MCAB e PI. Questo approccio può essere applicato anche a vari tipi di cellule per differenziare la piroptosi da altri tipi di morte cellulare, come l'apoptosi e la necrosi.

La piroptosi, un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata che si basa principalmente sulla formaz.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)	Corning Falcon	352052
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits	Thermo Fisher Scientific	A20186
Anti-chGSDME-CT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0228
Anti-chGSDME-NT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0227
CellQuest software	BD Biosciences
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	3100
Cryogenic Freezing Centrifuge	Eppendorf	5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0193-500ML
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Cytometry Staining Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-4222-26
Hemocytometer	Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)	YX-JSB52
IBDV Lx strain			IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted Microscope	Chongqing Photoelectric Instrument Company	XDS-1B
Normal Mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)	M&C  Gene Technology	CC017
Propidium Iodide(PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Trypsin-EDTA, 0.25%	M&C  Gene Technology	CC008
Vortex Oscillator	MIULAB	MIX-28+