Esame della piroptosi mediante citometria a flusso

Riepilogo

Questo articolo descrive l'identificazione di cellule pirottiche mediante citometria a flusso dopo doppia colorazione con anticorpi contro il frammento N-terminale di GSDME di pollo (chGSDME-NT⁾ e lo ioduro di propidio (PI).

Abstract

La piroptosi è un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata guidata prevalentemente dalla formazione di pori della membrana plasmatica da parte dell'N-terminale generato dalle proteine della famiglia Gasdermin (GSDM). L'esame del GSDM-NT attaccato alla membrana mediante Western Blot è il metodo più comunemente usato per valutare la piroptosi. Tuttavia, è difficile differenziare le cellule con piroptosi da altre forme di morte cellulare utilizzando questo metodo. In questo studio, le cellule DF-1 infettate dal virus della malattia infettiva della borsa (IBDV) sono state impiegate come modello per quantificare la percentuale di cellule sottoposte a piroptosi mediante citometria a flusso, utilizzando anticorpi specifici contro il frammento N-terminale del GSDME di pollo (chGSDME-NT⁾ e la colorazione con ioduro di propidio (PI). Le cellule chGSDME-NT-positive erano facilmente rilevabili mediante citometria a flusso utilizzando gli anticorpi anti-chGSDME-NT marcati con Alexa Fluor 647. Inoltre, la percentuale di cellule double-positive chGSDME-NT^/PI nelle cellule infettate da IBDV (circa il 33%) era significativamente maggiore rispetto ai controlli con mock-infected (P < 0,001). Questi risultati indicano che l'esame del chGSDME-NT legato alla membrana mediante citometria a flusso è un approccio efficace per determinare le cellule piroptotiche tra le cellule in fase di morte cellulare.

Introduzione

La piroptosi è un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata che dipende principalmente dalla formazione dei pori della membrana plasmatica da parte di Gasdermin (GSDM) D nei mammiferi ^1,2,3. A causa del deficit genetico di GSDMD nei polli ^4,5, il meccanismo della piroptosi nei polli rimane sfuggente. La famiglia Gasdermin comprende proteine conservate, tra cui GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 ^3,6. Gli studi hanno riportato che il GSDME dei pesci teleostei e delle anatre viene scisso dalla caspasi-1/3/7 o dalla caspasi-3/7 per indurre la morte cellulare piroptotica ^7,8. Tuttavia, il ruolo della piroptosi mediata da GSDME nella risposta dell'ospite alle infezioni patogene nei polli rimane da chiarire.

La malattia infettiva delle borse (IBD) è una malattia acuta, altamente contagiosa e immunosoppressiva del pollame causata da IBDV⁹. IBDV, un virus a RNA a doppio filamento (ds) bisegmentato senza involucro, appartiene al genere Avibirnavirus della famiglia Birnaviridae¹⁰. Precedenti studi condotti da altri e dal nostro laboratorio hanno dimostrato che l'infezione da IBDV induce la morte cellulare nelle cellule ospiti attraverso diversi percorsi 11,12,13,14. Risultati precedenti hanno dimostrato che l'infezione da IBDV innesca il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH), un indicatore di morte delle cellule litiche ^6,15, suggerendo che l'infezione da IBDV induce la morte delle cellule litiche nelle cellule ospiti. Inoltre, i dati mostrano che le cellule infettate da IBDV mostrano caratteristiche morfologiche di morte cellulare pirottotica, tra cui gonfiore cellulare con grandi bolle che soffiano dalla membrana plasmatica e colorazione positiva allo ioduro di propidio (PI), suggerendo che l'infezione da IBDV induce piroptosi nelle cellule.

Considerando che la formazione di pori di membrana nelle cellule pirottotiche da parte del frammento N-terminale di GSDM scisso (GSDM-NT⁾ è un segno distintivo della piroptosi, teoricamente, le cellule pirottotiche potrebbero essere rilevate mediante citometria a flusso esaminando GSDM-NT sulla membrana cellulare utilizzando anticorpi specifici. Nelle cellule pirottotiche aviarie, il frammento N-terminale del Gasdermin E di pollo (chGSDME-NT⁾ forma pori di membrana, consentendo allo ioduro di propidio (PI) di passare attraverso e legare il DNA. Pertanto, la proporzione di cellule pirottotiche può essere rilevata utilizzando la citometria a flusso, distinguendo così la piroptosi da altre forme di morte cellulare, come l'apoptosi e la necrosi. Tuttavia, il metodo per l'esame delle cellule pirottotiche mediante citometria a flusso non è stato riportato. In questo studio, le cellule DF-1 sono state infettate con IBDV ed è stata condotta una citometria a flusso per esaminare le cellule piroptotiche utilizzando anticorpi monoclonali (MCAB) contro il frammento chGSDME-NT (legato alla membrana) e la colorazione PI. Sorprendentemente, le cellule pirottotiche sono state efficacemente rilevate mediante citometria a flusso. Inoltre, è stato possibile quantificare la proporzione di celle pirottotiche. Questi risultati forniscono un mezzo potente ed efficace per determinare la piroptosi.

Questo articolo descrive un metodo per esaminare la piroptosi nelle cellule infette da IBDV mediante citometria a flusso utilizzando la colorazione anti-chGSDME-NT McAb e PI. Questo metodo può essere esteso anche ad altre cellule infettate da agenti patogeni e applicato per esaminare vari tipi di cellule con piroptosi, distinguendole da altre forme di morte cellulare.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione delle celle campione

1. Coltura di cellule DF-1 (fibroblasti di embrioni di pollo immortali) in piastre a sei pozzetti (5 x 10,⁵ cellule per pozzetto) con Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in un incubatore al 5% di CO₂ a 38 °C.
2. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, scartare il terreno di coltura cellulare contenente siero, lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e quindi aggiungere 2 mL di terreno di coltura cellulare privo di siero a ciascun pozzetto.
3. Aggiungere la soluzione del virus IBDV (contenente il MOI calcolato) a ciascun pozzetto e impostare un controllo dell'infezione simulata aggiungendo il volume di DMEM uguale a quello della soluzione del virus.
4. Dopo 1 ora di adsorbimento del virus, scartare il terreno di coltura, lavare le cellule con PBS tre volte, aggiungere 2 mL di DMEM integrato con FBS al 2% in ciascun pozzetto e continuare le colture cellulari per 24 ore.
5. 24 ore dopo l'infezione da IBDV, eseguire il trattamento con tripsina (500 μL per pozzetto) per 1 minuto e successivamente neutralizzare con DMEM integrato con FBS al 10% (2 mL per pozzetto). Successivamente, le cellule devono essere raccolte per preparare sospensioni a cellula singola per la citometria a flusso.
6. Centrifugare le celle a 400 x g per 5 minuti a 2-8 °C. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.
7. Risospendere il pellet di cella in PBS e agitare delicatamente i tubi per 3 s.
8. Centrifugare le celle come descritto al punto 1.6 (400 x g per 5 minuti a 2-8 °C).
9. Ripetere il lavaggio delle celle come descritto nei passaggi 1.7 e 1.8.
10. Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro al microscopio. Quindi, risospendere le cellule in un volume appropriato di tampone di colorazione per citometria a flusso (in modo che la concentrazione finale delle cellule sia 1 x 10⁷ cellule/mL). Agitare delicatamente le sospensioni.

2. Colorazione cellulare per citometria a flusso

1. Aggiungere 100 μl di sospensioni a cella singola dal passaggio 1.10 in provette di polistirene a fondo tondo da 5 mL (12 mm × 75 mm). Preparare cellule infettate da mock e IBDV per la colorazione anticorpale anti-chGSDME-NT^/CT e utilizzare le normali IgG di topo come controllo dell'isotipo. Nel frattempo, preparare provette di controllo in bianco e singole colorate con cellule infette da IBDV.
2. Aggiungere 1 μg di McAb anti-chGSDME-NT, MCAB anti-chGSDME-CT marcato con Alexa Fluor 647 o IgG di topo normale (come controllo dell'isotipo) rispettivamente alle provette infettate da IBDV e al mock-control. Successivamente, agitare delicatamente i tubi per 3 s.
3. Incubare le cellule colorate a 2-8 °C o su ghiaccio per 30 minuti al buio. Agitare delicatamente i tubi ogni 10 minuti.
4. Lavare le cellule con 1 mL di tampone di colorazione per citometria a flusso mediante centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 2-8 °C. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.
5. Ripetere il lavaggio delle celle come descritto al punto 2.4.
6. Risospendere il pellet in 100 μL di tampone di colorazione per citometria a flusso.
7. Colorare le cellule del gruppo infettato da IBDV e del gruppo infetto da simulazione, nonché le provette colorate singolarmente con PI, con 10 μg/mL di PI per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere 400 μL di tampone di colorazione per citometria a flusso per il test di citometria a flusso.

3. Esecuzione del test di citometria a flusso

1. Accendere il citometro a flusso per inizializzare lo strumento e avviare il software.
2. Iniziare con l'esecuzione del tubo di controllo vuoto, seguito dai singoli tubi colorati per regolare la tensione e i parametri di compensazione del citometro a flusso. Utilizza i canali di fluorescenza FL3 e FL4, che emettono a 635 nm, per rilevare rispettivamente i fluorofori PI e Alexa Fluor 647.
3. Dopo aver configurato tutti i parametri, eseguire tutti gli esempi in sequenza.

4. Analisi dei dati di citometria a flusso

1. Analizza la colorazione Alexa Fluor 647 di ciascun campione nell'istogramma del canale FL4.
2. Per valutare la proporzione di cellule doppie positive in ciascun campione, utilizzare il grafico a punti a quattro quadranti di FL3/FL4.
3. Impostare soglie positive in base a campioni di controllo isotipometrico IgG/PI a doppia colorazione, assicurando che la percentuale di cellule doppiamente positive rimanga inferiore all'1%. Questo approccio facilita la misurazione della proporzione di cellule doppie positive in tutti i campioni.

Risultati

chGSDME-NT sulla membrana delle cellule DF-1 con infezione da IBDV potrebbe essere facilmente rilevato mediante citometria a flusso
Una delle caratteristiche più importanti delle cellule pirottotiche è la formazione di pori di membrana da parte di frammenti di GSDM-NT generati dalla scissione di Gasdermin. Pertanto, le cellule piroptotiche potrebbero teoricamente essere rilevate mediante citometria a flusso esaminando GSDM-NT sulle membrane cellulari utilizzando antico...

Discussione

Questo articolo descrive un metodo efficace per esaminare la piroptosi utilizzando la citometria a flusso, ottenuta attraverso la doppia colorazione delle cellule infette con Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT MCAB e PI. Questo approccio può essere applicato anche a vari tipi di cellule per differenziare la piroptosi da altri tipi di morte cellulare, come l'apoptosi e la necrosi.

La piroptosi, un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata che si basa principalmente sulla formaz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)	Corning Falcon	352052
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits	Thermo Fisher Scientific	A20186
Anti-chGSDME-CT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0228
Anti-chGSDME-NT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0227
CellQuest software	BD Biosciences
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	3100
Cryogenic Freezing Centrifuge	Eppendorf	5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0193-500ML
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Cytometry Staining Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-4222-26
Hemocytometer	Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)	YX-JSB52
IBDV Lx strain			IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted Microscope	Chongqing Photoelectric Instrument Company	XDS-1B
Normal Mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)	M&C  Gene Technology	CC017
Propidium Iodide(PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Trypsin-EDTA, 0.25%	M&C  Gene Technology	CC008
Vortex Oscillator	MIULAB	MIX-28+