유세포분석(Flow Cytometry)에 의한 Pyroptosis의 검사

요약

이 논문에서는 닭 GSDME(^chGSDME-NT) 및 요오드화 프로피듐(PI)의 N 말단 단편에 대한 항체로 이중 염색 후 유세포 분석을 사용하여 발열 세포를 식별하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

Pyroptosis는 주로 GSDM(cleaved Gasdermin) 계열 단백질에서 생성된 N-말단에 의한 원형질막 공극의 형성에 의해 유발되는 염증성 유형의 프로그램된 세포 사멸입니다. 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의한 멤브레인 부착 GSDM-NT 검사는 발톱증을 평가하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나 이 방법을 사용하여 pyroptosis가 있는 세포를 다른 형태의 세포 사멸과 구별하는 것은 어렵습니다. 이 연구에서는 감염성 점액낭 질환 바이러스(IBDV)에 감염된 DF-1 세포를 모델로 사용하여 닭 GSDME(^chGSDME-NT)의 N-말단 단편에 대한 특이 항체 및 요오드화 프로피듐(PI) 염색에 대한 특이 항체를 활용하여 유세포 분석을 통해 pyroptosis를 겪는 세포의 비율을 정량화했습니다. chGSDME-NT 양성 세포는 Alexa Fluor 647 표지된 항-chGSDME-NT 항체를 사용하여 유세포 분석으로 쉽게 검출할 수 있었습니다. 또한, IBDV에 감염된 세포에서 chGSDME-NT^/PI 이중 양성 세포의 비율(약 33%)은 모의 감염 대조군(P < 0.001)보다 유의하게 높았습니다. 이러한 결과는 유세포 분석에 의한 막 결합 chGSDME-NT의 검사가 세포 사멸을 겪고 있는 세포 중에서 발열 세포를 결정하는 효과적인 접근법임을 나타냅니다.

서문

Pyroptosis는 주로 포유류 ^1,2,3에서 Gasdermin (GSDM) D에 의한 원형질막 기공의 형성에 의존하는 프로그램된 세포 사멸의 염증성 유형입니다. 닭 ^4,5에서 GSDMD의 유전적 결핍으로 인해 닭에서 pyroptosis의 메커니즘은 파악하기 어려운 상태로 남아 있습니다. Gasdermin 계열은 GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME 및 DFNB59 ^3,6을 포함한 보존 단백질로 구성됩니다. 연구에 따르면 teleost 물고기와 오리의 GSDME는 caspase-1/3/7 또는 caspase-3/7에 의해 절단되어 발열 세포 사멸을 유도합니다 ^7,8. 그러나 닭의 병원성 감염에 대한 숙주 반응에서 GSDME 매개 pyroptosis의 역할은 아직 밝혀지지 않았습니다.

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프로토콜

연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 시료 세포의 준비

1. 38°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)을 사용하여 6웰 플레이트(웰당 5 x 10,⁵개 세포)에서 DF-1(불멸의 닭 배아 섬유아세포) 세포를 배양합니다.
2. 세포가 80% 합류에 도달하면 혈청 함유 세포 배양 배지를 버리고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세 번 세척한 다음 각 웰에 무혈청 세포 배양 배지 2mL를 추가합니다.
3. IBDV 바이러스 용액(계산된 MOI 포함)을 각 웰에 추가하고, 바이러스 용액과 동일한 DMEM의 부피를 추가하여 모의 감염 대조군을 설정합니다.
4. 바이러스 흡착 1시간 후 배양 배지를 버리고 PBS로 세포를 세 번 세척한 다음 2% FBS가 보충된 DMEM 2mL를 각 웰에 추가하고 24시간 동안 세포 배양을 계속합니다.
5. IBDV 감염 후 24시간 동안 트립신 처리(웰당 500μL)를 1분 동안 수행한 후 10% FBS(웰당 2m....

토론

이 글에서는 Alexa Fluor 647 표지된 anti-chGSDME-NT McAb 및 PI로 감염된 세포를 이중 염색하여 얻은 유세포 분석을 사용하여 pyroptosis를 검사하는 효과적인 방법에 대해 설명합니다. 이 접근법은 또한 pyroptosis를 apoptosis 및 necrosis와 같은 다른 유형의 세포 사멸과 구별하기 위해 다양한 세포 유형에 적용될 수 있습니다.

포유류 ^1,2,3.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)	Corning Falcon	352052
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits	Thermo Fisher Scientific	A20186
Anti-chGSDME-CT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0228
Anti-chGSDME-NT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0227
CellQuest software	BD Biosciences
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	3100
Cryogenic Freezing Centrifuge	Eppendorf	5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0193-500ML
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Cytometry Staining Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-4222-26
Hemocytometer	Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)	YX-JSB52
IBDV Lx strain			IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted Microscope	Chongqing Photoelectric Instrument Company	XDS-1B
Normal Mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)	M&C  Gene Technology	CC017
Propidium Iodide(PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Trypsin-EDTA, 0.25%	M&C  Gene Technology	CC008
Vortex Oscillator	MIULAB	MIX-28+