フローサイトメトリーによるピロトーシスの検討

要約

この記事では、ニワトリGSDMEのN末端フラグメント(chGSDME-NT)およびヨウ化プロピジウム(PI)に対する抗体による二重染色後のフローサイトメトリーを使用したピロトーシス細胞の同定について説明します。

要約

ピロトーシスは、主に切断されたガスデルミン(GSDM)ファミリータンパク質から生成されるN末端による原形質膜細孔の形成によって引き起こされる炎症性のプログラム細胞死です。ウェスタンブロットによるメンブレン付着^GSDM-NTの検査は、ピロトーシスの評価に最も一般的に使用される方法です。しかし、この方法を用いてピロトーシスを有する細胞を他の形態の細胞死と鑑別することは困難です。本研究では、Infectious Bursal Disease Virus(IBDV)に感染したDF-1細胞をモデルとして、ニワトリGSDMEのN末端フラグメントに対する特異的抗体(chGSDME-NT)およびヨウ化プロピジウム(PI)染色を用いて、フローサイトメトリーによるピロトーシスを受ける細胞の割合を定量化しました。chGSDME-NT陽性細胞は、Alexa Fluor 647標識抗chGSDME-NT抗体を用いたフローサイトメトリーで容易に検出できました。さらに、IBDV感染細胞におけるchGSDME-NT^/PI二重陽性細胞の割合(約33%)は、模擬感染対照群よりも有意に高かった(P < 0.001)。これらの知見は、フローサイトメトリーによる膜結合chGSDME-NTの検討が、細胞死を経験した細胞のうちピロトーシス細胞を決定するための有効なアプローチであることを示しています。

概要

ピロトーシスは、主に哺乳類^のガスダーミン(GSDM)Dによる原形質膜細孔の形成に依存する炎症性のプログラム細胞死です^1,2,3。ニワトリ^のGSDMDの遺伝的欠損^4,5のために、ニワトリのピロトーシスのメカニズムはとらえどころのないままです。ガスデルミンファミリーは、GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、およびDFNB59 ^3,6などの保存されたタンパク質で構成されています。研究によると、魚類やアヒル由来のGSDMEは、カスパーゼ-1/3/7またはカスパーゼ-3/7によって切断され、ピロトーシス細胞死を誘導することが報告されています^7,8。しかし、ニワトリの病原性感染症に対する宿主応答におけるGSDME媒介性ピロトーシスの役割は、まだ解明されていません。

感染性滑液包疾患(IBD)は、^IB....

プロトコル

本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. サンプル細胞の調製

1. DF-1(不死身のニワトリ胚線維芽細胞)細胞を6ウェルプレート(ウェルあたり5 x 10⁵ 細胞)で培養し、ダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)を添加し、38°Cの5%_CO2 インキュベーターで培養します。
2. 細胞が80%のコンフルエントに達したら、血清含有細胞培養培地を廃棄し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、各ウェルに2 mLの無血清細胞培養培地を添加します。
3. IBDV ウイルス溶液(計算された MOI を含む)を各ウェルに追加し、ウイルス溶液と等しい量の DMEM を添加して模擬感染コントロールを設定します。
4. ウイルス吸着の1時間後、培地を廃棄し、PBSで細胞を3回洗浄し、各ウェルに2%FBSを添加したDMEMを2mL加え、細胞培養を24時間継続します。
5. IBDV 感染の 24 時間後に、トリプシン処理 (ウェルあたり 500 μL) を 1 分間行い、その後、10% FBS (ウェルあたり 2 mL) を添加した DMEM で中和します。その後、細胞を回収して、フローサイトメトリー用の単一細胞....

ディスカッション

この記事では、Alexa Fluor 647 標識抗 chGSDME-NT MCAB と PI による感染細胞の二重染色により、フローサイトメトリーを使用してピロトーシスを調べる効果的な方法について説明します。このアプローチは、ピロトーシスをアポトーシスや壊死などの他のタイプの細胞死と区別するために、さまざまな細胞タイプにも適用できます。

ピロトーシスは、哺乳類

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)	Corning Falcon	352052
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits	Thermo Fisher Scientific	A20186
Anti-chGSDME-CT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0228
Anti-chGSDME-NT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0227
CellQuest software	BD Biosciences
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	3100
Cryogenic Freezing Centrifuge	Eppendorf	5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0193-500ML
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Cytometry Staining Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-4222-26
Hemocytometer	Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)	YX-JSB52
IBDV Lx strain			IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted Microscope	Chongqing Photoelectric Instrument Company	XDS-1B
Normal Mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)	M&C  Gene Technology	CC017
Propidium Iodide(PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Trypsin-EDTA, 0.25%	M&C  Gene Technology	CC008
Vortex Oscillator	MIULAB	MIX-28+