A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
מאמר זה מתאר זיהוי של תאים פירופטוטיים באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד שבר N-terminal של עוף GSDME (chGSDME-NT) ופרופידיום יודיד (PI).
פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת המונע בעיקר על ידי היווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי N-terminus שנוצר מחלבונים ממשפחת Gasdermin (GSDM). בדיקת GSDM-NT המחוברת לקרום על ידי Western Blot היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת פירופטוזיס. עם זאת, קשה להבדיל תאים עם פירופטוזיס מצורות אחרות של מוות תאי באמצעות שיטה זו. במחקר זה, תאי DF-1 נגועים בנגיף מחלת בורסל זיהומית (IBDV) שימשו כמודל לכימות שיעור התאים שעברו פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים כנגד מקטע N-terminal של GSDME עוף (chGSDME-NT) וצביעת פרופידיום יודיד (PI). התאים החיוביים chGSDME-NT היו ניתנים לזיהוי בקלות על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות נוגדנים אנטי-chGSDME-NT של Alexa Fluor 647. יתר על כן, חלקם של תאים חיוביים כפולים chGSDME-NT/PI בתאים נגועים ב- IBDV (כ -33%) היה גדול משמעותית מאשר בביקורת נגועה מדומה (P < 0.001). ממצאים אלה מצביעים על כך שבחינה של chGSDME-NT הקשור לקרום על ידי ציטומטריית זרימה היא גישה יעילה לקביעת תאים פירופטוטיים בקרב תאים העוברים מוות תאי.
פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת התלוי בעיקר בהיווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי Gasdermin (GSDM) D ביונקים 1,2,3. בשל מחסור גנטי של GSDMD בתרנגולות 4,5, מנגנון הפירופטוזיס בתרנגולות נותר חמקמק. משפחת Gasdermin כוללת חלבונים משומרים, כולל GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME ו-DFNB59 3,6. מחקרים דיווחו כי GSDME מדגי טלאוסט וברווזים נבקע על ידי קספאז-1/3/7 או קספאז-3/7 כדי לגרום למוות של תאים פירופטוטיים 7,8
פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת תאי מדגם
chGSDME-NT על הממברנה של תאי DF-1 עם זיהום IBDV יכול להיות מזוהה בקלות על ידי ציטומטריית זרימה
אחד המאפיינים החשובים ביותר של תאים פירופטוטיים הוא היווצרות נקבוביות הממברנה על ידי שברי GSDM-NT שנוצרו ממחשוף גסדרמין. לכן, תאים פירופטוטיים יכולים באופן תיאורטי להיות מזוהים על יד?.......
מאמר זה מתאר שיטה יעילה לבדיקת פירופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה, המושגת באמצעות צביעה כפולה של תאים נגועים עם Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT McAb ו-PI. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על סוגי תאים שונים כדי להבדיל פירופטוזיס מסוגים אחרים של מוות תאי, כגון אפופטוזיס ונמק.
פירופטו?.......
למחברים אין מה לחשוף.
ברצוננו להודות לד"ר ג'ו ליו על עזרתו האדיבה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מס '2022YFD1800300), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '32130105), והקרן המיועדת למערכת מחקר טכנולוגית מודרנית של אגרו-תעשייה (מס '. CARS-40), סין.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
CellQuest software | BD Biosciences | ||
CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved