בדיקת פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה

Summary

מאמר זה מתאר זיהוי של תאים פירופטוטיים באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד שבר N-terminal של עוף GSDME (chGSDME-NT) ופרופידיום יודיד (PI).

Abstract

פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת המונע בעיקר על ידי היווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי N-terminus שנוצר מחלבונים ממשפחת Gasdermin (GSDM). בדיקת GSDM-NT המחוברת לקרום על ידי Western Blot היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת פירופטוזיס. עם זאת, קשה להבדיל תאים עם פירופטוזיס מצורות אחרות של מוות תאי באמצעות שיטה זו. במחקר זה, תאי DF-1 נגועים בנגיף מחלת בורסל זיהומית (IBDV) שימשו כמודל לכימות שיעור התאים שעברו פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים כנגד מקטע N-terminal של GSDME עוף (chGSDME-NT) וצביעת פרופידיום יודיד (PI). התאים החיוביים chGSDME-NT היו ניתנים לזיהוי בקלות על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות נוגדנים אנטי-chGSDME-NT של Alexa Fluor 647. יתר על כן, חלקם של תאים חיוביים כפולים chGSDME-NT/PI בתאים נגועים ב- IBDV (כ -33%) היה גדול משמעותית מאשר בביקורת נגועה מדומה (P < 0.001). ממצאים אלה מצביעים על כך שבחינה של chGSDME-NT הקשור לקרום על ידי ציטומטריית זרימה היא גישה יעילה לקביעת תאים פירופטוטיים בקרב תאים העוברים מוות תאי.

Introduction

פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת התלוי בעיקר בהיווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי Gasdermin (GSDM) D ביונקים ^1,2,3. בשל מחסור גנטי של GSDMD בתרנגולות ^4,5, מנגנון הפירופטוזיס בתרנגולות נותר חמקמק. משפחת Gasdermin כוללת חלבונים משומרים, כולל GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME ו-DFNB59 ^3,6. מחקרים דיווחו כי GSDME מדגי טלאוסט וברווזים נבקע על ידי קספאז-1/3/7 או קספאז-3/7 כדי לגרום למוות של תאים פירופטוטיים ^7,8

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תאי מדגם

1. תרבית DF-1 (פיברובלסטים של עוברי תרנגולות בני אלמוות) בצלחות של שש בארות (5 x 10,⁵ תאים לכל באר) עם מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) באינקובטור 5% CO₂ ב 38 ° C.
2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%, השליכו את מדיום תרבית התאים המכיל את הסרום, שטפו את התאים שלוש פעמים עם מלח חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן הוסיפו 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים ללא סרום לכל באר.
3. הוסף את פתרון וירוס IBDV (המכיל MOI מחושב) לכל באר, והגדר פקד נגוע דמה על ידי הוספת נפח DMEM שווה לזה של ....

תוצאות

chGSDME-NT על הממברנה של תאי DF-1 עם זיהום IBDV יכול להיות מזוהה בקלות על ידי ציטומטריית זרימה
אחד המאפיינים החשובים ביותר של תאים פירופטוטיים הוא היווצרות נקבוביות הממברנה על ידי שברי GSDM-NT שנוצרו ממחשוף גסדרמין. לכן, תאים פירופטוטיים יכולים באופן תיאורטי להיות מזוהים על יד?.......

Discussion

מאמר זה מתאר שיטה יעילה לבדיקת פירופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה, המושגת באמצעות צביעה כפולה של תאים נגועים עם Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT McAb ו-PI. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על סוגי תאים שונים כדי להבדיל פירופטוזיס מסוגים אחרים של מוות תאי, כגון אפופטוזיס ונמק.

פירופטו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)	Corning Falcon	352052
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits	Thermo Fisher Scientific	A20186
Anti-chGSDME-CT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0228
Anti-chGSDME-NT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0227
CellQuest software	BD Biosciences
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	3100
Cryogenic Freezing Centrifuge	Eppendorf	5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0193-500ML
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Cytometry Staining Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-4222-26
Hemocytometer	Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)	YX-JSB52
IBDV Lx strain			IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted Microscope	Chongqing Photoelectric Instrument Company	XDS-1B
Normal Mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)	M&C  Gene Technology	CC017
Propidium Iodide(PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Trypsin-EDTA, 0.25%	M&C  Gene Technology	CC008
Vortex Oscillator	MIULAB	MIX-28+