A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר זיהוי של תאים פירופטוטיים באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד שבר N-terminal של עוף GSDME (chGSDME-NT) ופרופידיום יודיד (PI).

Abstract

פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת המונע בעיקר על ידי היווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי N-terminus שנוצר מחלבונים ממשפחת Gasdermin (GSDM). בדיקת GSDM-NT המחוברת לקרום על ידי Western Blot היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת פירופטוזיס. עם זאת, קשה להבדיל תאים עם פירופטוזיס מצורות אחרות של מוות תאי באמצעות שיטה זו. במחקר זה, תאי DF-1 נגועים בנגיף מחלת בורסל זיהומית (IBDV) שימשו כמודל לכימות שיעור התאים שעברו פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים כנגד מקטע N-terminal של GSDME עוף (chGSDME-NT) וצביעת פרופידיום יודיד (PI). התאים החיוביים chGSDME-NT היו ניתנים לזיהוי בקלות על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות נוגדנים אנטי-chGSDME-NT של Alexa Fluor 647. יתר על כן, חלקם של תאים חיוביים כפולים chGSDME-NT/PI בתאים נגועים ב- IBDV (כ -33%) היה גדול משמעותית מאשר בביקורת נגועה מדומה (P < 0.001). ממצאים אלה מצביעים על כך שבחינה של chGSDME-NT הקשור לקרום על ידי ציטומטריית זרימה היא גישה יעילה לקביעת תאים פירופטוטיים בקרב תאים העוברים מוות תאי.

Introduction

פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת התלוי בעיקר בהיווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי Gasdermin (GSDM) D ביונקים 1,2,3. בשל מחסור גנטי של GSDMD בתרנגולות 4,5, מנגנון הפירופטוזיס בתרנגולות נותר חמקמק. משפחת Gasdermin כוללת חלבונים משומרים, כולל GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME ו-DFNB59 3,6. מחקרים דיווחו כי GSDME מדגי טלאוסט וברווזים נבקע על ידי קספאז-1/3/7 או קספאז-3/7 כדי לגרום למוות של תאים פירופטוטיים 7,8

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תאי מדגם

  1. תרבית DF-1 (פיברובלסטים של עוברי תרנגולות בני אלמוות) בצלחות של שש בארות (5 x 10,5 תאים לכל באר) עם מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) באינקובטור 5% CO2 ב 38 ° C.
  2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%, השליכו את מדיום תרבית התאים המכיל את הסרום, שטפו את התאים שלוש פעמים עם מלח חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן הוסיפו 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים ללא סרום לכל באר.
  3. הוסף את פתרון וירוס IBDV (המכיל MOI מחושב) לכל באר, והגדר פקד נגוע דמה על ידי הוספת נפח DMEM שווה לזה של ....

תוצאות

chGSDME-NT על הממברנה של תאי DF-1 עם זיהום IBDV יכול להיות מזוהה בקלות על ידי ציטומטריית זרימה
אחד המאפיינים החשובים ביותר של תאים פירופטוטיים הוא היווצרות נקבוביות הממברנה על ידי שברי GSDM-NT שנוצרו ממחשוף גסדרמין. לכן, תאים פירופטוטיים יכולים באופן תיאורטי להיות מזוהים על יד?.......

Discussion

מאמר זה מתאר שיטה יעילה לבדיקת פירופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה, המושגת באמצעות צביעה כפולה של תאים נגועים עם Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT McAb ו-PI. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על סוגי תאים שונים כדי להבדיל פירופטוזיס מסוגים אחרים של מוות תאי, כגון אפופטוזיס ונמק.

פירופטו?.......

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לד"ר ג'ו ליו על עזרתו האדיבה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מס '2022YFD1800300), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '32130105), והקרן המיועדת למערכת מחקר טכנולוגית מודרנית של אגרו-תעשייה (מס '. CARS-40), סין.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)Corning Falcon352052
6 Well Cell Culture PlateCorning3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kitsThermo Fisher ScientificA20186
Anti-chGSDME-CT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0228
Anti-chGSDME-NT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0227
CellQuest softwareBD Biosciences
CO2 incubatorThermo Fisher Scientific3100
Cryogenic Freezing CentrifugeEppendorf5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco by Life TechnologiesC11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF0193-500ML
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCalibur
Flow Cytometry Staining BufferThermo Fisher Scientific00-4222-26
HemocytometerQiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)YX-JSB52
IBDV Lx strainIBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted MicroscopeChongqing Photoelectric Instrument CompanyXDS-1B
Normal Mouse IgGSanta Cruz Biotechnologysc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)M&C  Gene TechnologyCC017
Propidium Iodide(PI)Sigma-AldrichP4170
Trypsin-EDTA, 0.25%M&C  Gene TechnologyCC008
Vortex OscillatorMIULABMIX-28+

References

  1. He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
  2. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Ga....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

GSDMIBDVDF 1ChGSDME NT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved