בדיקת פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה

Summary

מאמר זה מתאר זיהוי של תאים פירופטוטיים באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד שבר N-terminal של עוף GSDME (chGSDME-NT) ופרופידיום יודיד (PI).

Abstract

פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת המונע בעיקר על ידי היווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי N-terminus שנוצר מחלבונים ממשפחת Gasdermin (GSDM). בדיקת GSDM-NT המחוברת לקרום על ידי Western Blot היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת פירופטוזיס. עם זאת, קשה להבדיל תאים עם פירופטוזיס מצורות אחרות של מוות תאי באמצעות שיטה זו. במחקר זה, תאי DF-1 נגועים בנגיף מחלת בורסל זיהומית (IBDV) שימשו כמודל לכימות שיעור התאים שעברו פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים כנגד מקטע N-terminal של GSDME עוף (chGSDME-NT) וצביעת פרופידיום יודיד (PI). התאים החיוביים chGSDME-NT היו ניתנים לזיהוי בקלות על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות נוגדנים אנטי-chGSDME-NT של Alexa Fluor 647. יתר על כן, חלקם של תאים חיוביים כפולים chGSDME-NT/PI בתאים נגועים ב- IBDV (כ -33%) היה גדול משמעותית מאשר בביקורת נגועה מדומה (P < 0.001). ממצאים אלה מצביעים על כך שבחינה של chGSDME-NT הקשור לקרום על ידי ציטומטריית זרימה היא גישה יעילה לקביעת תאים פירופטוטיים בקרב תאים העוברים מוות תאי.

Introduction

פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת התלוי בעיקר בהיווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי Gasdermin (GSDM) D ביונקים ^1,2,3. בשל מחסור גנטי של GSDMD בתרנגולות ^4,5, מנגנון הפירופטוזיס בתרנגולות נותר חמקמק. משפחת Gasdermin כוללת חלבונים משומרים, כולל GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME ו-DFNB59 ^3,6. מחקרים דיווחו כי GSDME מדגי טלאוסט וברווזים נבקע על ידי קספאז-1/3/7 או קספאז-3/7 כדי לגרום למוות של תאים פירופטוטיים ^7,8. עם זאת, התפקיד של פירופטוזיס בתיווך GSDME בתגובת המארח לזיהומים פתוגניים בתרנגולות עדיין לא ברור.

מחלת בורסל זיהומית (IBD) היא מחלת עופות חריפה, מדבקת מאוד ומדכאת חיסון הנגרמת על ידי IBDV⁹. IBDV, נגיף RNA דו-גדילי דו-סגמנטי (ds) שאינו עטוף, שייך לסוג Avibirnavirus במשפחת Birnaviridae¹⁰. מחקרים קודמים שנערכו על ידי אחרים והמעבדה שלנו הראו כי זיהום IBDV גורם למוות תאי בתאים מארחים דרך מסלולים שונים 11,12,13,14. ממצאים קודמים הראו כי זיהום IBDV מעורר שחרור של לקטט דהידרוגנאז (LDH), אינדיקטור למוות של תאים ליטיים ^6,15, דבר המצביע על כך שזיהום IBDV גורם למוות של תאים ליטיים בתאים מארחים. יתר על כן, הנתונים מראים כי תאים נגועים ב- IBDV מפגינים מאפיינים מורפולוגיים של מוות תאי פירופטוטי, כולל נפיחות תאים עם בועות גדולות הנושבות מממברנת הפלזמה ופרופידיום יודיד (PI) - מכתים חיובי, דבר המצביע על כך שזיהום IBDV גורם לפירופטוזיס בתאים.

בהתחשב בכך שהיווצרות נקבוביות הממברנה בתאים פירופטוטיים על ידי מקטע N-terminal של GSDM שסוע (GSDM-NT⁾ היא סימן היכר של פירופטוזיס, תיאורטית, תאים פירופטוטיים יכולים להיות מזוהים על ידי ציטומטריית זרימה על ידי בחינת GSDM-NT על קרום התא באמצעות נוגדנים ספציפיים. בתאים פירופטוטיים של עופות, המקטע N-terminal של עוף Gasdermin E (chGSDME-NT) יוצר נקבוביות ממברנה, ומאפשר לפרופידיום יודיד (PI) לעבור דרך DNA ולקשור אותו. לפיכך, ניתן לזהות את חלקם של תאים פירופטוטיים באמצעות ציטומטריית זרימה, ובכך להבדיל פירופטוזיס מצורות אחרות של מוות תאי, כגון אפופטוזיס ונמק. עם זאת, השיטה לבדיקת תאים פירופטוטיים על ידי ציטומטריית זרימה לא דווחה. במחקר זה, תאי DF-1 היו נגועים ב- IBDV, וציטומטריית זרימה נערכה כדי לבחון תאים פירופטוטיים באמצעות נוגדנים חד שבטיים (McAb) כנגד מקטע chGSDME-NT (קשור לקרום) וצביעת PI. באופן מפתיע, תאים פירופטוטיים זוהו ביעילות על ידי ציטומטריית זרימה. יתר על כן, ניתן לכמת את חלקם של תאים פירופטוטיים. ממצאים אלה מספקים אמצעי רב עוצמה ויעיל לקביעת פירופטוזיס.

מאמר זה מתאר שיטה לבדיקת פירופטוזיס בתאים נגועים ב- IBDV על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות צביעת אנטי-chGSDME-NT, McAb ו- PI. שיטה זו יכולה להיות מורחבת גם לתאים נגועים אחרים בפתוגן וליישם כדי לבחון סוגי תאים שונים עם פירופטוזיס, להבדיל אותם מצורות אחרות של מוות תאי.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תאי מדגם

1. תרבית DF-1 (פיברובלסטים של עוברי תרנגולות בני אלמוות) בצלחות של שש בארות (5 x 10,⁵ תאים לכל באר) עם מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) באינקובטור 5% CO₂ ב 38 ° C.
2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%, השליכו את מדיום תרבית התאים המכיל את הסרום, שטפו את התאים שלוש פעמים עם מלח חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן הוסיפו 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים ללא סרום לכל באר.
3. הוסף את פתרון וירוס IBDV (המכיל MOI מחושב) לכל באר, והגדר פקד נגוע דמה על ידי הוספת נפח DMEM שווה לזה של תמיסת הווירוס.
4. לאחר שעה אחת של ספיחת וירוסים, להשליך את מדיום התרבית, לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים, להוסיף 2 מ"ל של DMEM בתוספת 2% FBS לכל באר, ולהמשיך תרביות תאים במשך 24 שעות.
5. 24 שעות לאחר זיהום IBDV, לבצע טיפול טריפסין (500 μL לכל באר) במשך 1 דקות ולאחר מכן לנטרל על ידי DMEM בתוספת 10% FBS (2 מ"ל לכל באר). לאחר מכן, יש לקצור את התאים כדי להכין תרחיפים חד-תאיים עבור ציטומטריית זרימה.
6. צנטריפוגה את התאים ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 2-8 ° C. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.
7. השהה מחדש את גלולת התא ב- PBS וסובב בעדינות את הצינורות במשך 3 שניות.
8. צנטריפוגה את התאים כמתואר בשלב 1.6 (400 x גרם במשך 5 דקות ב 2-8 ° C).
9. חזור על שטיפת התאים כמתואר בשלב 1.7 ושלב 1.8.
10. בצע ספירת תאים באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בנפח מתאים של מאגר צביעת ציטומטריה זרימה (כך שריכוז התא הסופי הוא 1 x 10⁷ תאים / מ"ל). מערבלים בעדינות את המתלים.

2. צביעת תאים לציטומטריית זרימה

1. הוסף 100 μL של מתלים חד-תאיים משלב 1.10 לתוך 5 מ"ל צינורות פוליסטירן עגולים למטה (12 מ"מ × 75 מ"מ). הכן תאים נגועים ב- IBDV ו- IBDV לצביעת נוגדנים נגד chGSDME-NT^/CT , והשתמש ב- IgG רגיל של עכבר כבקרת איזוטיפ. בינתיים, הכינו בקרה ריקה וצינוריות מוכתמות בודדות עם תאים נגועים ב- IBDV.
2. הוסף 1 מיקרוגרם של Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT McAb, anti-chGSDME-CT McAb או עכבר רגיל IgG (כבקרת איזוטיפ) לצינורות IBDV-נגועים ובקרת דמה, בהתאמה. לאחר מכן, מערבלים בעדינות את הצינורות במשך 3 שניות.
3. לדגור על התאים המוכתמים ב 2-8 ° C או על קרח במשך 30 דקות בחושך. מערבולות עדינות כל 10 דקות.
4. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של חיץ צביעת ציטומטריה זרימה על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 2-8 ° C. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.
5. חזור על שטיפת התאים כמתואר בשלב 2.4.
6. להשהות מחדש את הגלולה ב 100 μL של חיץ צביעת ציטומטריה זרימה.
7. הכתימו את התאים של הקבוצה הנגועה ב- IBDV והקבוצה הנגועה בדמה, כמו גם את הצינורות המוכתמים הבודדים של PI, עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של PI למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הוסיפו 400 מיקרוליטר של חיץ צביעת ציטומטריית זרימה עבור בדיקת ציטומטריית זרימה.

3. ביצוע בדיקת ציטומטריית זרימה

1. הפעל את ציטומטר הזרימה כדי לאתחל את המכשיר ולהפעיל את התוכנה.
2. התחל בהפעלת צינור הבקרה הריק ואחריו הצינורות המוכתמים הבודדים כדי להתאים את פרמטרי המתח והפיצוי של ציטומטר הזרימה. השתמש בתעלות פלואורסצנטיות FL3 ו-FL4, הפולטות ב-635 ננומטר, לזיהוי פלואורופורים PI ו-Alexa Fluor 647, בהתאמה.
3. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, הפעל את כל הדגימות ברצף.

4. ניתוח נתוני ציטומטריית זרימה

1. נתח את הצביעה של Alexa Fluor 647 של כל דגימה בהיסטוגרמה של ערוץ FL4.
2. כדי להעריך את חלקם של תאים חיוביים כפולים בכל דגימה, השתמש בתרשים הנקודות בן ארבעת הרבעים של FL3/FL4.
3. קבעו ערכי סף חיוביים בהתבסס על בקרת איזוטיפ של דגימות מוכתמות כפולות מסוג IgG/PI, וודאו ששיעור התאים החיוביים הכפולים יישאר מתחת ל-1%. גישה זו מאפשרת למדוד את חלקם של תאים חיוביים כפולים בכל הדגימות.

תוצאות

chGSDME-NT על הממברנה של תאי DF-1 עם זיהום IBDV יכול להיות מזוהה בקלות על ידי ציטומטריית זרימה
אחד המאפיינים החשובים ביותר של תאים פירופטוטיים הוא היווצרות נקבוביות הממברנה על ידי שברי GSDM-NT שנוצרו ממחשוף גסדרמין. לכן, תאים פירופטוטיים יכולים באופן תיאורטי להיות מזוהים על יד?...

Discussion

מאמר זה מתאר שיטה יעילה לבדיקת פירופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה, המושגת באמצעות צביעה כפולה של תאים נגועים עם Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT McAb ו-PI. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על סוגי תאים שונים כדי להבדיל פירופטוזיס מסוגים אחרים של מוות תאי, כגון אפופטוזיס ונמק.

פירופטו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)	Corning Falcon	352052
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits	Thermo Fisher Scientific	A20186
Anti-chGSDME-CT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0228
Anti-chGSDME-NT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0227
CellQuest software	BD Biosciences
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	3100
Cryogenic Freezing Centrifuge	Eppendorf	5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0193-500ML
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Cytometry Staining Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-4222-26
Hemocytometer	Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)	YX-JSB52
IBDV Lx strain			IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted Microscope	Chongqing Photoelectric Instrument Company	XDS-1B
Normal Mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)	M&C  Gene Technology	CC017
Propidium Iodide(PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Trypsin-EDTA, 0.25%	M&C  Gene Technology	CC008
Vortex Oscillator	MIULAB	MIX-28+