طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

Summary

تعمل ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) كحاجز حاسم بين المشيمية والشبكية ، مما يعزز صحة ووظيفة أنواع خلايا الشبكية ، مثل المستقبلات الضوئية. هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا وفعالا لعزل وزراعة الفئران البالغة RPE.

Abstract

الخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE) ضرورية للوظيفة المناسبة للشبكية. يشارك خلل RPE في التسبب في أمراض الشبكية المهمة ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والتهاب الشبكية الصباغي ، واعتلال الشبكية السكري. نقدم نهجا مبسطا لعزل RPE عن عيون البالغين الفئران. على عكس الأساليب المبلغ عنها سابقا ، يتيح هذا النهج عزل وزراعة RPE عالي النقاء من الفئران البالغة. لا تتطلب هذه الطريقة البسيطة والسريعة مهارة تقنية واسعة ويمكن تحقيقها باستخدام الأدوات والكواشف العلمية الأساسية. يتم عزل RPE الأولي من الفئران الخلفية C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 3 إلى 14 أسبوعا عن طريق استئصال العين متبوعا بإزالة الجزء الأمامي. يتم استخدام التربسين الأنزيمي والطرد المركزي لفصل وعزل RPE عن فنجان العين. في الختام ، يقدم هذا النهج بروتوكولا سريعا وفعالا لاستخدام RPE في دراسة وظيفة الشبكية ومرضها.

Introduction

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية الخلية متخصصة تبطن غشاء بروخ وتقع بين المستقبلات الضوئية والمشيمية¹. تلعب خلايا RPE دورا مهما في الوظيفة المناسبة للشبكية. تنقل خلايا RPE الجلوكوز وفيتامين أ إلى المستقبلات الضوئية ، وتعزز الرؤية عن طريق إعادة إيزوميرة الشبكية العابرة بالكامل إلى شبكية 11 رابطة الدول المستقلة وتحافظ على الأجزاء الخارجية من المستقبلات الضوئية من خلال البلعمة للأجزاء الخارجية المتساقطة ، وإزالة الماء من الفضاء تحت الشبكية ، وتشكيل الحاجز الدموي الشبكي الخارجي من خلال وجود تقاطعات ضيقة وإفراز عوامل النمو العصبية (مثل عامل الصباغ المشتق من الظهارة ، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي) التي تدعم المستقبلات الضوئية

Protocol

تمت الموافقة على استخدام الموضوعات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة كيس ويسترن ريزيرف.

1. إعداد الكواشف

1. قم بإعداد وسط عازل للغسيل عن طريق استكمال محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم ، بدون فينول أحمر بمحلول عازل HEPES 10 mM. احفظ المحلول على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
2. قم بإعداد وسط RPE عن طريق استكمال وسط النسر المعدل من Dulbecco ب 4.5 جم / لتر من الجلوكوز ، و 1.25x مكمل GlutaMAX (تركيز المخزون 100x أو 200 mM ؛ التركيز النهائي 2.5 mM L-glutamine) ، مع مصل بقري جنيني 10٪ ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 1x محلول أحماض أميني....

النتائج

تم استخدام البروتوكول الموصوف على الفئران الخلفية C57BL / 6. لا يبدو أن الجنس يغير القدرة على ثقافة RPE. تنتج الفئران التي تقل أعمارها عن 6 أسابيع صفائح RPE محدودة مقارنة بالفئران الأكبر سنا ، وقد تكون هناك حاجة إلى مزيد من العيون للوصول إلى الالتقاء الأمثل. بعد العزلة ، تستغرق خلايا RPE حوالي 3 أيام.......

Discussion

في هذه المقالة ، حددنا بروتوكولا مبسطا لعزل وثقافة ظهارة الصباغ الشبكي الفئران. عبرت خلايا RPE المعزولة من عيون الفئران البالغة عن علامة خاصة ب RPE ، RPE65 ، وعلامة تقاطع بين الخلايا ، ZO-1. بالإضافة إلى ذلك ، تطورت الخلايا المستزرعة إلى صفائح سداسية مصطبغة في الثقافة.

تم نشر عدة طر?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12