Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Özet

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Retina pigment epitel hücreleri (RPE), retinanın düzgün çalışması için kritik öneme sahiptir. RPE disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati gibi önemli retina hastalıklarının patogenezinde rol oynar. RPE'nin murin yetişkin gözlerinden izolasyonu için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunuyoruz. Daha önce bildirilen yöntemlerin aksine, bu yaklaşım yetişkin farelerden yüksek saflıkta RPE'nin izolasyonunu ve kültürünü mümkün kılar. Bu basit ve hızlı yöntem, kapsamlı teknik beceri gerektirmez ve temel bilimsel araçlar ve reaktiflerle elde edilebilir. Primer RPE, 3 ila 14 haftalık C57BL/6 arka plan farelerinden gözün enükleasyonu ve ardından ön segmentin çıkarılması ile izole edilir. Enzimatik tripsinizasyon ve santrifüjleme, RPE'yi vizör lastiğinden ayırmak ve izole etmek için kullanılır. Sonuç olarak, bu yaklaşım, retina fonksiyonu ve hastalığı çalışmasında RPE'nin kullanımı için hızlı ve etkili bir protokol sunmaktadır.

Giriş

Retina pigment epiteli (RPE), fotoreseptörler ve koroid¹ arasında bulunan Bruch zarını kaplayan özel bir hücre tek tabakasıdır. RPE hücreleri, retinanın düzgün çalışmasında kritik bir rol oynar. RPE hücreleri, glikoz ve A vitaminini fotoreseptörlere taşır, all-trans retinalin 11-cis retinal içine yeniden izomerizasyonu ile görüşü teşvik eder ve dökülen dış segmentlerin fagositozu yoluyla fotoreseptörün dış segmentlerini korur, subretinal boşluktan suyu uzaklaştırır, sıkı bağlantıların varlığı yoluyla dış kan-retina bariyerini oluşturur ve nörotropik büyüme faktörleri salgılar (Pigment Epitel Türetilmiş Faktör gibi, ve Temel Fibroblast Büyüme Faktörü) fotoreseptörleri destekleyen². RPE hücrelerinin disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati dahil olmak üzere çeşitli retinopatilerin patogenezinde rol oynar ^3,4,5. RPE hücrelerini kullanan in vitro çalışmalar, bu hastalıkların patogenezini daha iyi anlamamız için kritik öneme sahiptir. Primer RPE hücreleri bu çalışmalar için daha çok tercih edilir, çünkü RPE hücre hatları hazır bulunmakla birlikte, primer RPE hücrelerinin temel özelliklerinden yoksundur.

Primer RPE hücrelerinin kaynağı olarak çeşitli türler kullanılırken, fareler retinopatilerin patogenezini anlamaya yardımcı olmak için genetik modifikasyonları kullanma avantajına sahiptir. RPE hücrelerini kemirgenlerden izole etmek için daha önce tarif edilen protokoller ya yenidoğan hayvanların kullanılmasını gerektirir, uzundur, teknik beceri gerektirir ya da kültür 6,7,8,9,10,11,12 için uygun değildir. RPE hücrelerini, bu hücrelerin oldukça saf kültürlerini veren yetişkin farelerden izole etmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklıyoruz.

Protokol

Bu çalışmada hayvan deneklerin kullanımı, Case Western Reserve Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Reaktiflerin hazırlanması

1. Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS), kalsiyum içermez, magnezyum içermez, fenol kırmızısı içermez 10 mM HEPES tampon çözeltisi ile takviye ederek yıkama tamponu ortamı hazırlayın. Kullanana kadar çözeltiyi 4 ° C'de tutun.
2. Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unu 4.5 g/L glikoz, 1.25x GlutaMAX Takviyesi (stok konsantrasyonu 100x veya 200 mM; nihai konsantrasyon 2.5 mM L-glutamin), %10 fetal sığır serumu, %1 penisilin/streptomisin ve 1x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x) ile destekleyerek RPE ortamını hazırlayın. Kullanmadan önce, ortamı bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.

2. Fare gözü çıkarma

1. IACUC onaylı bir ötenazi yöntemi kullanarak, tercihen 3 ila 14 haftalık yaşları arasında değişen fareyi ötenazi yapın (20 g fare başına 0.1 mL'de bir Ketamin / ksilazin kokteyli kullanılarak anestezi altında servikal çıkık [87.5 mg / kg Ketamin ve 12.5 mg / kg Ksilazin] bu çalışmada kullanılan yöntemdi).
   NOT: Genç farelerden toplanan gözler, zamanla artan retina pigmenti epitel hücresi verimini kolaylaştıracak ve ardışık geçişler için kapasiteyi artıracaktır.
2. Fareyi, göz yukarı bakacak şekilde yan yatırın.
3. İşaret parmağını ve başparmağını sırasıyla gözün üstüne ve altına yerleştirin. Göz küresinin dışarı çıkmasını sağlamak için gözü çevreleyen kemik yapısına hafifçe baskı uygulayın.
4. Hafifçe açılmış makasın ucunu gözün altına sokun ve göz yuvasından ayrılana kadar bileği gözden 90° uzağa nazikçe döndürün.
   NOT: Gözü veya optik siniri kesmek için makası kapatmayın, çünkü bu, vizör lastiğinin diseksiyonunu daha zor hale getirecektir.
5. Buz üzerinde tutulan bir yıkama tamponu ortamına aktarmadan önce gözü hemen %70 etanole yerleştirin ve en fazla 5 saniye boyunca yuvarlayın.
6. Diseksiyon mikroskobu altında, her seferinde bir gözü yıkama tamponu ve ıslatılmış gazlı bez şeritleri ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.
7. Optik siniri cımbızla tutarak gözü stabilize edin. 3.00 mm 45° cerrahi bıçak veya 0.009" tıraş bıçağı kullanarak ora serrata seviyesinde nazikçe bir kesi yapın.
8. Vannas makası kullanarak, makası nazikçe kesiğe sokun ve ön segment ve vitreus çıkarılıp atılana kadar ora serrata'nın çevresini kesin.
9. RPE tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek, gergin forseps kullanarak retinayı vizör lastiğinden nazikçe soyun.
   NOT: Retinanın çıkarılmasını kolaylaştırmak için, bir transfer pipetini yıkama tamponu ortamıyla doldurun ve retinayı nazikçe kaldırmak için vizör lastiğinin kenarlarına dikkatlice uygulayın.
10. Son olarak, makas kullanarak optik siniri ve fazla bağ dokusunu vizör lastiğinden çıkarın. Vizör lastiğini delmemeye dikkat edin.

3. Birincil RPE'nin izolasyonu

1. Vizör lastiğini 1 mL %0.25 tripsin + %0.02 EDTA içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   NOT: Kültürlenebilir RPE'nin verimini artırmak için bir Tripsin-EDTA alikotuna iki vizör lastiği eklenebilir.
2. Mikrosantrifüj tüplerini 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna aktarın ve 10 dakika inkübe edin. Her 2 dakikada bir, tüpleri su banyosundan çıkarın ve tüpün altını tezgahın üzerine 40 kez sıkıca vurun.
3. 10 dakika sonra, bir P1000 veya 2 mL serolojik pipet kullanarak en fazla 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek vizör lastiğini mekanik olarak nazikçe bozun.
   NOT: Büyük sayfalar düzgün şekilde yapışmayacağı için RPE sayfalarının parçalanması çok önemlidir.
4. Ayrılmış RPE tabakalarını, ancak vizör lastiğini değil, 15 mL'lik konik bir tüpte 0.5 mL fetal sığır serumu (FBS) üzerine katmanlayarak tripsini hemen nötralize edin.
5. Ayrıca, 3 mL RPE ortamını FBS ve RPE tabakalarının katmanları üzerine damla damla katmanlayarak tripsini seyreltin.
6. RPE'yi 340 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
7. Süpernatanı atın ve hücreleri 24 oyuklu bir plaka (1.9 cm² / oyuk) veya 48 oyuklu bir plaka (0.75 cm² / oyuk) için uygun miktarda RPE ortamında yeniden süspanse edin.
   NOT: RPE, yapışmayı artırmak için hücre dışı matris proteinleri, özellikle laminin, kollajen IV veya fibronektin ile kaplanmış kuyucuk plakaları üzerine kaplanabilir¹¹. RPE ayrıca 1 mL RPE ortamında yeniden süspanse edilebilir ve saf RPE hücrelerini daha fazla izole etmek için %40'lık bir yoğunluk ayırma gradyanı üzerine katmanlanabilir. Ek olarak, plakayı 3-5 dakika boyunca 340 x g'da döndürmek hücre yapışmasını^{artırabilir 13}.
8. 37 ° C'de% 5 CO_2'de inkübe edin.

4. RPE'nin Kültürlenmesi

1. İzole RPE'yi en az 3 gün boyunca bozmayın. 72 saat sonra, eski ortamı yavaşça çıkarın ve yeni, önceden ısıtılmış ortamla değiştirin.
2. İlk 3 günden sonra her 48 saatte bir ortamı değiştirin.
3. Hücreler birleştiğinde,% 0.25 tripsin +% 0.02 EDTA kullanarak hücreleri geçirin ve% 2'ye düşürün
   NOT: Primer RPE'nin daha önce 5-7 geçişten sonra farklılaşmaya başladığı ve altıgen şeklini ve pigmentasyonunu kaybetmeye başlayacağı^{bildirilmiştir 14}.

Sonuçlar

Açıklanan protokol C57BL/6 arka plan farelerinde kullanılmıştır. Cinsiyet, RPE'yi kültürleme yeteneğini değiştirmiyor gibi görünmektedir. 6 haftadan küçük fareler, yaşlı farelere kıyasla sınırlı RPE tabakaları verir ve optimal birleşmeye ulaşmak için daha fazla göze ihtiyaç duyulabilir. İzolasyonu takiben, RPE hücrelerinin stabilize olması ve hücre kültürü plakasına bağlanması yaklaşık 3 gün sürer. İzolasyondan yaklaşık 24 saat sonra, anükleat gibi görünen yuvarlak, pigment...

Tartışmalar

Bu yazıda, murin retinal pigment epitelinin izolasyonu ve kültürü için basitleştirilmiş bir protokol özetledik. Yetişkin farelerin gözlerinden izole edilen RPE hücreleri, RPE'ye özgü bir belirteç olan RPE65 ve hücreler arası bir bağlantı belirteci olan ZO-1'i eksprese etti. Ek olarak, kültürlenmiş hücreler kültürde pigmentli, altıgen tabakalar halinde gelişti.

Kemirgenlerde RPE'nin izolasyonu için çeşitli yöntemler daha önce yayınlanmıştır

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12