成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

要約

網膜色素上皮(RPE)は、脈絡膜と網膜との間の重要な障壁として機能し、光受容体などの網膜細胞タイプの健康と機能を促進します。ここでは、成体マウスRPEを単離および培養するための簡単で効果的なプロトコルについて説明します。

要約

網膜色素上皮細胞(RPE)は、網膜の適切な機能にとって重要です。RPE機能障害は、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症などの重要な網膜疾患の病因に関与しています。マウスの成人の目からRPEを分離するための合理化されたアプローチを提示します。これまでに報告された方法とは対照的に、このアプローチにより、成体マウスからの高純度RPEの単離と培養が可能になります。このシンプルで迅速な方法は、広範な技術的スキルを必要とせず、基本的な科学ツールと試薬で達成できます。一次 RPE は、眼の摘出術とそれに続く前眼部の除去により、3 週齢から 14 週齢の C57BL/6 バックグラウンド マウスから単離されます。酵素によるトリプシン処理と遠心分離は、RPEをアイカップから解離して分離するために使用されます。結論として、このアプローチは、網膜機能と疾患の研究におけるRPEの利用のための迅速かつ効果的なプロトコルを提供します。

概要

網膜色素上皮(RPE)は、光受容体と^脈絡膜の間に位置するブルッフ膜の内側を覆う特殊な細胞単層です1。RPE細胞は、網膜の適切な機能に重要な役割を果たします。RPE細胞は、グルコースとビタミンAを光受容体に輸送し、全トランス網膜の11-cis網膜への再異性化によって視力を促進し、脱落した外側セグメントの食作用を通じて光受容体の外側セグメントを維持し、網膜下空間から水分を除去し、タイトジャンクションの存在を通じて外側の血液網膜バリアを形成し、神経向性成長因子(色素上皮由来因子など)を分泌します。 および基本的な線維芽細胞成長因子)は、光受容体^{をサポートします2}。RPE細胞の機能不全は、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症など、さまざまな網膜症の病因に関与しています^3,4,5。RPE細胞を用いたin vitro研究は、これらの疾患の病因の理解を深めるために重要です。RPE細胞株は容易に入手可能ですが、初代RPE細胞の主要な特性を欠いているため、これらの研究には初代RPE細胞が非常に好まれます。

初代RPE細胞の供給源として様々な種が利用されてきたのに対し、マウスには遺伝子改変を利用して網膜症の病因を解明できるという利点があります。げっ歯類からRPE細胞を単離するための前述のプロトコルは、新生児動物の使用を必要とするか、時間がかかるか、技術的なスキルを必要とするか、または培養に適していないかのいずれかである6,7,8,9,10,11,12。私たちは、これらの細胞の高純度培養物を生成する成体マウスからRPE細胞を単離するための簡単で迅速な方法を説明します。

プロトコル

この研究での動物被験者の使用は、ケースウェスタンリザーブ大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 試薬の調製

1. ハンク平衡塩溶液(HBSS)、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まない10 mM HEPES緩衝液を添加して、洗浄緩衝液を調製します。使用するまで溶液を4°Cに保ちます。
2. 4.5 g/L グルコース、1.25x GlutaMAX Supplement (ストック濃度 100x または 200 mM、最終濃度 2.5 mM L-グルタミン) を Dulbecco's Modified Eagle's Medium に 10% ウシ胎児血清、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1x MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) を添加して RPE 培地を調製します。使用する前に、メディアをウォーターバスで37°Cに予熱してください。

2.マウスの眼の抽出

1. IACUCが承認した安楽死の方法(マウスの20 gあたり0.1 mLのケタミン/キシラジンカクテルを使用した麻酔下での子宮頸部脱臼[87.5 mg / kgケタミンと12.5 mg / kgキシラジン]は、この研究で使用された方法でした)。
   注:若いマウスから採取した眼は、時間の経過とともに網膜色素上皮細胞の収量の増加を促進し、連続継代の能力を拡張します。
2. 目を上に向けて、マウスを横向きに平らに置きます。
3. 人差し指と親指をそれぞれ目の上と下に置きます。目の周りの骨構造にやさしく圧力をかけ、眼球の突出を誘導します。
4. 少し開いたはさみの先を目の下に挿入し、目がソケットから離れるまで手首を目から90°ゆっくりと回転させます。
   注:アイカップの解剖がより困難になるため、目や視神経を切るためにハサミを閉じないでください。
5. すぐに眼球を70%エタノールに5秒以内入れて転がしてから、氷上に保持した洗浄緩衝液に移します。
6. 解剖顕微鏡下で、一度に片方の目を、洗浄バッファーと浸したガーゼのストリップで満たされたペトリ皿に移します。
7. ピンセットで視神経を保持して目を安定させます。3.00 mm 45°の外科用ナイフまたは0.009インチのカミソリの刃を使用して、オラセラータのレベルで静かに切開を行います。
8. バンナスのハサミを使用して、ハサミを切開部にそっと挿入し、前部と硝子体が取り外して廃棄できるようになるまで、オラセラータの周囲を切り取ります。
9. つながれた鉗子を使用して、RPE層を乱さないように注意しながら、アイカップから網膜をそっと剥がします。
   注意: 網膜を取り外しやすくするには、トランスファーピペットに洗浄バッファー培地を入れ、アイカップの端に注意深く適用して、網膜を優しく持ち上げます。
10. 最後に、ハサミを使用して視神経と余分な結合組織をアイカップから取り除きます。アイカップに穴を開けないように注意してください。

3. プライマリ RPE の分離

1. アイカップを1 mLの0.25%トリプシン+ 0.02%EDTAを含む1.5 mLの微量遠心チューブに移します。.
   注:トリプシン-EDTAの1つのアリコートに2つのアイカップを追加して、培養可能なRPEの収量を増やすことができます。
2. 微量遠心チューブを37°Cに設定したウォーターバスに移し、10分間インキュベートします。2分ごとにチューブをウォーターバスから取り外し、チューブの底をカウンタートップに40回しっかりとたたきます。
3. 10分後、P1000または2 mLの血清ピペットを使用して、3回以下のピペッティングでアイカップを機械的に穏やかに破壊します。
   注:RPEシートの断片化は、大きなシートが適切に接着しないため、不可欠です。
4. アイカップではなく、切り離したRPEシートを15 mLの円錐管内の0.5 mLのウシ胎児血清(FBS)に重ねて、トリプシンをすぐに中和します。.
5. さらに、FBSおよびRPEシートの層に3mLのRPE培地を滴下してトリプシンを希釈します。
6. RPEを340 x g で3分間遠心分離します。
7. 上清を捨て、24ウェルプレート(1.9 cm²/ウェル)または48ウェルプレート(0.75 cm²/ウェル)のいずれかに適した量のRPE培地に細胞を再懸濁します。
   注:RPEは、細胞外マトリックスタンパク質、特にラミニン、コラーゲンIV、またはフィブロネクチンでコーティングされたウェルプレートに播種して、接着性を高めることができます¹¹。RPEは、1 mLのRPE培地に再懸濁し、40%密度の分離グラジエントに重ねて、純粋なRPE細胞をさらに単離することもできます。さらに、プレートを340 x g で3〜5分間回転させると、細胞接着が増加する^{可能性がある13}。
8. 37°C、5%CO₂でインキュベートします。

4. RPEの培養

1. 分離されたRPEを少なくとも3日間中断しないでください。72時間後、古いメディアをそっと取り出し、温めた新しいメディアと交換します。
2. 最初の3日後は48時間ごとに培地を交換してください。
3. 細胞がコンフルエントに達したら、0.25%トリプシン+ 0.02%EDTAを使用して細胞を継代し、RPE培地中のFBSを2%に減らします。
   注:一次RPEは、以前に報告されていたが、5〜7回の継代後に脱分化を開始し、それらの六角形の形状と色素沈着を失い始める¹⁴。

結果

記載されたプロトコルは、C57BL/6バックグラウンドマウスで使用されています。性別はRPEを培養する能力を変えるようには見えません。6週未満のマウスは、高齢のマウスと比較してRPEシートの収量が限られており、最適な合流点に到達するにはより多くの目が必要になる場合があります。単離後、RPE細胞が安定して細胞培養プレートに付着するまでに約3日かかります。単離の約24時間後、核?...

ディスカッション

この記事では、マウスの網膜色素上皮の単離と培養のための簡略化されたプロトコルを概説しました。成体マウスの眼から単離されたRPE細胞は、RPE特異的マーカーRPE65および細胞間接合マーカーZO-1を発現した。さらに、培養細胞は培養中に色素沈着した六角形のシートに成長しました。

げっ歯類におけるRPEの単離のためのいくつかの方法は、以前に発表されている

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12