成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

要約

網膜色素上皮(RPE)は、脈絡膜と網膜との間の重要な障壁として機能し、光受容体などの網膜細胞タイプの健康と機能を促進します。ここでは、成体マウスRPEを単離および培養するための簡単で効果的なプロトコルについて説明します。

要約

網膜色素上皮細胞(RPE)は、網膜の適切な機能にとって重要です。RPE機能障害は、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症などの重要な網膜疾患の病因に関与しています。マウスの成人の目からRPEを分離するための合理化されたアプローチを提示します。これまでに報告された方法とは対照的に、このアプローチにより、成体マウスからの高純度RPEの単離と培養が可能になります。このシンプルで迅速な方法は、広範な技術的スキルを必要とせず、基本的な科学ツールと試薬で達成できます。一次 RPE は、眼の摘出術とそれに続く前眼部の除去により、3 週齢から 14 週齢の C57BL/6 バックグラウンド マウスから単離されます。酵素によるトリプシン処理と遠心分離は、RPEをアイカップから解離して分離するために使用されます。結論として、このアプローチは、網膜機能と疾患の研究におけるRPEの利用のための迅速かつ効果的なプロトコルを提供します。

概要

網膜色素上皮(RPE)は、光受容体と^脈絡膜の間に位置するブルッフ膜の内側を覆う特殊な細胞単層です1。RPE細胞は、網膜の適切な機能に重要な役割を果たします。RPE細胞は、グルコースとビタミンAを光受容体に輸送し、全トランス網膜の11-cis網膜への再異性化によって視力を促進し、脱落した外側セグメントの食作用を通じて光受容体の外側セグメントを維持し、網膜下空間から水分を除去し、タイトジャンクションの存在を通じて外側の血液網膜バリアを形成し、神経向性成長因子(色素上皮由来因子など)を分泌します。 および基本的な線維芽細胞成長因子)は、光受容体^{をサポートします2}。RPE細胞の機能不全は、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症など、さまざまな網膜症の病因に関与しています^3,4,5。RPE細胞を用いたin vitro研究は、これらの疾患の病因の理解を深めるために重要です。RPE細胞株は容易に入手可能ですが、初代RPE細胞の主要な特性を欠いているため、これらの研究には初代RPE細胞が非常に好まれます。

初代RPE細胞の供給源として様々な種が利用されてきたのに対し、マウスには遺伝子改変を利用して網膜症....

プロトコル

この研究での動物被験者の使用は、ケースウェスタンリザーブ大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 試薬の調製

1. ハンク平衡塩溶液(HBSS)、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まない10 mM HEPES緩衝液を添加して、洗浄緩衝液を調製します。使用するまで溶液を4°Cに保ちます。
2. 4.5 g/L グルコース、1.25x GlutaMAX Supplement (ストック濃度 100x または 200 mM、最終濃度 2.5 mM L-グルタミン) を Dulbecco's Modified Eagle's Medium に 10% ウシ胎児血清、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1x MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) を添加して RPE 培地を調製します。使用する前に、メディアをウォーターバスで37°Cに予熱してください。

2.マウスの眼の抽出

1. IACUCが承認した安楽死の方法(マウスの20 gあたり0.1 mLのケタミン/キシラジンカクテルを使用した麻酔下での子宮頸部脱臼[87.5 mg / kgケタミンと12.5 mg / kgキシラジン]は、この研究で使用された方法で....

ディスカッション

この記事では、マウスの網膜色素上皮の単離と培養のための簡略化されたプロトコルを概説しました。成体マウスの眼から単離されたRPE細胞は、RPE特異的マーカーRPE65および細胞間接合マーカーZO-1を発現した。さらに、培養細胞は培養中に色素沈着した六角形のシートに成長しました。

げっ歯類におけるRPEの単離のためのいくつかの方法は、以前に発表されている

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12