Упрощенный метод выделения и культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки у взрослых мышей

Резюме

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) действует как важнейший барьер между сосудистой оболочкой и сетчаткой, способствуя здоровью и функции типов клеток сетчатки, таких как фоторецепторы. В данной работе мы описываем простой и эффективный протокол выделения и культивирования взрослых мышей RPE.

Аннотация

Пигментные эпителиальные клетки сетчатки (РПЭ) имеют решающее значение для правильного функционирования сетчатки. Дисфункция РПЭ участвует в патогенезе важных заболеваний сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация, пигментный ретинит и диабетическая ретинопатия. Мы представляем оптимизированный подход к выделению РПЭ из глаз взрослых мышей. В отличие от ранее описанных методов, этот подход позволяет выделить и культивировать высокочистый РПЭ от взрослых мышей. Этот простой и быстрый метод не требует обширных технических навыков и достижим с помощью основных научных инструментов и реактивов. Первичные РПЭ выделяют у фоновых мышей C57BL/6 в возрасте от 3 до 14 недель путем энуклеации глаза с последующим удалением переднего сегмента. Ферментативная трипсинизация и центрифугирование используются для диссоциации и изоляции РПЭ от наглазника. В заключение следует отметить, что этот подход предлагает быстрый и эффективный протокол использования РПЭ в изучении функции и заболеваний сетчатки.

Введение

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой специализированный клеточный монослой, выстилающий мембрану Бруха, расположенный между фоторецепторами и сосудистой оболочкой¹. Клетки РПЭ играют решающую роль в правильном функционировании сетчатки. Клетки РПЭ транспортируют глюкозу и витамин А к фоторецепторам, улучшают зрение путем повторной изомеризации полностью транс-ретиналь в 11-цис-сетчатку и поддерживают внешние сегменты фоторецептора посредством фагоцитоза отторгнутых наружных сегментов, удаляют воду из субретинального пространства, формируют внешний гематематический барьер за счет наличия плотных соединений и секретируют нейротропные факторы роста (такие как производный фактор пигментного эпителия). и основной фактор роста фибробластов), которые поддерживают фоторецепторы². Дисфункция клеток РПЭ участвует в патогенезе различных ретинопатий, включая возрастную макулярную дегенерацию, пигментный ретинит и диабетическую ретинопатию ^3,4,5. Исследования in vitro с использованием клеток РПЭ имеют решающее значение для улучшения нашего понимания патогенеза этих заболеваний. Первичные клетки РПЭ являются гораздо более предпочтительными для этих исследований, поскольку клеточные линии РПЭ, хотя и легкодоступны, не имеют ключевых характеристик первичных клеток РПЭ.

В то время как различные виды использовались в качестве источников первичных клеток РПЭ, у мышей есть преимущество использования генетических модификаций для понимания патогенеза ретинопатий. Ранее описанные протоколы выделения клеток РПЭ от грызунов либо требуют использования неонатальных животных, либо являются длительными, требуют технических навыков, либо не подходят для культивирования 6,7,8,9,10,11,12. Мы описываем простой и быстрый метод выделения клеток RPE от взрослых мышей, которые дают высокочистые культуры этих клеток.

протокол

Использование животных в этом исследовании было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Кейс Вестерн Резерв.

1. Приготовление реагентов

1. Приготовьте промывочную буферную среду, добавив сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS), не содержащий кальция, магния, фенолового красного, с 10 мМ буферным раствором HEPES. Держите раствор при температуре 4 °C до использования.
2. Приготовьте среду RPE, добавив модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle's Medium с 4,5 г/л глюкозы, 1,25x GlutaMAX Supplement (исходная концентрация 100x или 200 мМ; конечная концентрация 2,5 мМ L-глутамина), с 10% фетальной бычьей сывороткой, 1% пенициллином/стрептомицином и 1x раствором заменимых аминокислот MEM (100x). Перед использованием предварительно подогрейте среду до 37 °C на водяной бане.

2. Извлечение глаз мыши

1. Усыпите мышь, предпочтительно в возрасте от 3 до 14 недель, с использованием метода эвтаназии, одобренного IACUC (вывих шейки матки под анестезией с использованием коктейля кетамина/ксилазина в концентрации 0,1 мл на 20 г мышей [87,5 мг/кг кетамина и 12,5 мг/кг ксилазина]).
   Глаза, собранные у более молодых мышей, будут способствовать увеличению выхода пигментных эпителиальных клеток сетчатки с течением времени и расширят способность к последовательному пассажу.
2. Положите мышь на бок так, чтобы глаз был направлен вверх.
3. Поместите указательный и большой пальцы выше и ниже глаза соответственно. Осторожно надавите на костную структуру, окружающую глаз, чтобы вызвать выпячивание глазного яблока.
4. Вставьте кончик слегка приоткрытых ножниц под глаз и осторожно поверните запястье от глаза на 90°, пока глаз не отсоединится от глазницы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не закрывайте ножницы, чтобы разрезать глаз или зрительный нерв, так как это затруднит рассечение наглазника.
5. Немедленно поместите и обваляйте глаз в 70% этаноле не более чем на 5 секунд, прежде чем переложить его в промывочный буферный сред, хранящийся на льду.
6. Под препарирующим микроскопом перенесите по одному глазу в чашку Петри, заполненную буфером для промывки и полосками пропитанной марли.
7. Стабилизируйте глаз, удерживая зрительный нерв пинцетом. Аккуратно сделайте надрез на уровне ora serrata хирургическим ножом диаметром 3,00 мм 45° или лезвием бритвы 0,009 дюйма.
8. С помощью ножниц Vannas аккуратно введите ножницы в разрез и разрежьте по окружности ora пильчатой мышцы, пока передний сегмент и стекловидное тело не будут удалены и отброшены.
9. Аккуратно отклейте сетчатку от наглазника с помощью привязанных щипцов, стараясь не повредить слой RPE.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сетчатку было легче удалить, наполните трансферную пипетку промывочной буферной средой и осторожно приложите ее к краям наглазника, чтобы аккуратно приподнять сетчатку.
10. Наконец, удалите зрительный нерв и излишки соединительной ткани из наглазника с помощью ножниц. Будьте осторожны, чтобы не проколоть наглазник.

3. Изоляция первичного СИЗД

1. Перенесите наглазник в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл 0,25% трипсина + 0,02% ЭДТА.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Две наглазницы могут быть добавлены к одной аликвоте Trypsin-EDTA для увеличения выхода культивируемого RPE.
2. Поместите микроцентрифужные пробирки на водяную баню, установленную при температуре 37 °C, и инкубируйте в течение 10 минут. Каждые 2 минуты вынимайте трубки из водяной бани и 40 раз сильно постучите по дну трубки по столешнице.
3. Через 10 минут осторожно механически нарушьте работу наглазника с помощью серологической пипетки P1000 или 2 мл, делая пипетирование вверх и вниз не более 3 раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагментация листов СИЗД имеет важное значение, так как большие листы не будут прилипать должным образом.
4. Немедленно нейтрализуйте трипсин, нанеся слой отделенных листов РПЭ, но не наглазник, на 0,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) в конической пробирке объемом 15 мл.
5. Кроме того, разбавьте трипсин, нанеся 3 мл среды RPE по каплям на слои листов FBS и RPE.
6. Центрифугируйте РПЭ при 340 x g в течение 3 минут.
7. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в подходящем количестве среды RPE для 24-луночного планшета (1,9^см2/лунка) или 48-луночного планшета (0,75^см2/лунка).
   ПРИМЕЧАНИЕ: РПЭ можно наносить на лунные планшеты, покрытые белками внеклеточного матрикса, в частности ламинином, коллагеном IV или фибронектином, для повышения адгезии¹¹. RPE также может быть ресуспендирован в 1 мл среды RPE и нанесен слой на градиент разделения 40% плотности для дальнейшей изоляции чистых клеток RPE. Кроме того, вращение планшета при 340 x g в течение 3-5 минут может увеличить адгезию клеток¹³.
8. Инкубировать при 37 °C при 5%_CO2.

4. Культивирование СИЗОД

1. Не нарушайте работу изолированного СИЗД в течение как минимум 3 дней. Через 72 часа аккуратно удалите старую среду и замените ее свежей, предварительно подогретой средой.
2. Меняйте среду каждые 48 ч после первых 3 дней.
3. Как только клетки достигнут слияния, пропустите клетки с использованием 0,25% трипсина + 0,02% ЭДТА и уменьшите FBS в средах RPE до 2%.
   Примечание: Ранее сообщалось, что первичные РПЭ начинают дедифференцироваться после 5-7 пассажей и начинают терять свою гексагональную форму и^{пигментацию.}

Результаты

Описанный протокол был использован на фоновых мышах C57BL/6. Пол, по-видимому, не изменяет способность культивировать РПЭ. Мыши в возрасте до 6 недель дают ограниченное количество листов РПЭ по сравнению со старыми мышами, и для достижения оптимальной конфлюенции может потребоваться больш...

Обсуждение

В этой статье мы изложили упрощенный протокол выделения и бактериологического исследования пигментного эпителия сетчатки мыши. Клетки RPE, выделенные из глаз взрослых мышей, экспрессировали RPE-специфичный маркер RPE65 и маркер межклеточного соединения ZO-1. Кроме того, культивируемые клет?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12