Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Resumen

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Resumen

Las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) son fundamentales para el correcto funcionamiento de la retina. La disfunción del EPR está implicada en la patogénesis de importantes enfermedades de la retina, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinosis pigmentaria y la retinopatía diabética. Presentamos un enfoque simplificado para el aislamiento del EPR de los ojos de adultos murinos. A diferencia de los métodos informados anteriormente, este enfoque permite el aislamiento y el cultivo de EPR de alta pureza a partir de ratones adultos. Este método simple y rápido no requiere una gran habilidad técnica y se puede lograr con herramientas y reactivos científicos básicos. El EPR primario se aísla de ratones de fondo C57BL/6 de 3 a 14 semanas de edad mediante la enucleación del ojo seguida de la extirpación del segmento anterior. La tripsinización enzimática y la centrifugación se utilizan para disociar y aislar el EPR de la copa ocular. En conclusión, este enfoque ofrece un protocolo rápido y eficaz para la utilización del EPR en el estudio de la función y la enfermedad de la retina.

Introducción

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa celular especializada que recubre la membrana de Bruch ubicada entre los fotorreceptores y la coroides¹. Las células EPR desempeñan un papel fundamental en el correcto funcionamiento de la retina. Las células EPR transportan glucosa y vitamina A a los fotorreceptores, promueven la visión mediante la reisomerización de todo el retinal trans en retinal 11-cis y mantienen los segmentos externos del fotorreceptor a través de la fagocitosis de los segmentos externos desprendidos, eliminan el agua del espacio subretiniano, forman la barrera hematorretiniana externa a través de la presencia de....

Protocolo

El uso de sujetos animales en este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Case Western Reserve.

1. Preparación de reactivos

1. Prepare el medio tampón de lavado complementando la solución salina equilibrada de Hank (HBSS), sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol con 10 mM de solución tampón HEPES. Mantener la solución a 4 °C hasta su uso.
2. Prepare el medio RPE complementando el Medio de Águila Modificado de Dulbecco con 4,5 g/L de glucosa, 1,25x GlutaMAX Supplement (concentración de stock 100x o 200 mM; concentración final de 2,5 mM L-glutamin....

Discusión

En este artículo, hemos esbozado un protocolo simplificado para el aislamiento y cultivo del epitelio pigmentario de la retina murina. Las células EPR aisladas de los ojos de ratones adultos expresaron un marcador específico de EPR, RPE65, y un marcador de unión intercelular, ZO-1. Además, las células cultivadas se desarrollaron en láminas hexagonales pigmentadas durante el cultivo.

Anteriormente se han publicado varios métodos para el aislamiento de EPR en roedores

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12