Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Zusammenfassung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Zusammenfassung

Retinale Pigmentepithelzellen (RPE) sind entscheidend für die ordnungsgemäße Funktion der Netzhaut. Die RPE-Dysfunktion ist an der Pathogenese wichtiger Netzhauterkrankungen beteiligt, wie z. B. der altersbedingten Makuladegeneration, der Retinitis pigmentosa und der diabetischen Retinopathie. Wir stellen einen optimierten Ansatz für die Isolierung von RPE aus adulten Augen von Mäusen vor. Im Gegensatz zu bisher berichteten Methoden ermöglicht dieser Ansatz die Isolierung und Kultivierung von hochreinem RPE aus adulten Mäusen. Diese einfache und schnelle Methode erfordert keine umfangreichen technischen Fähigkeiten und ist mit grundlegenden wissenschaftlichen Werkzeugen und Reagenzien erreichbar. Primäre RPE werden aus C57BL/6-Hintergrundmäusen im Alter von 3 bis 14 Wochen durch Enukleation des Auges und anschließende Entfernung des vorderen Segments isoliert. Enzymatische Trypsinisierung und Zentrifugation werden verwendet, um das RPE aus der Augenmuschel zu dissoziieren und zu isolieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz ein schnelles und effektives Protokoll für die Verwendung von RPE bei der Untersuchung der Netzhautfunktion und -erkrankung bietet.

Einleitung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine spezialisierte Zellmonoschicht, die die Bruch-Membran auskleidet und sich zwischen den Photorezeptoren und der Aderhaut^{befindet 1}. RPE-Zellen spielen eine entscheidende Rolle für die ordnungsgemäße Funktion der Netzhaut. RPE-Zellen transportieren Glukose und Vitamin A zu den Photorezeptoren, fördern das Sehvermögen durch Re-Isomerisierung von all-trans-Retinal in 11-cis-Retinal und erhalten die äußeren Segmente des Photorezeptors durch Phagozytose der abgestoßenen äußeren Segmente, entfernen Wasser aus dem subretinalen Raum, bilden die äußere Blut-Netzhaut-Schranke durch das Vorhandensein von Tight Junctions und sezernieren neurotrope Wachstumsfaktoren (wie Pigment Epithelium Derived Factor, und Basic Fibroblast Growth Factor), die Photorezeptoren unterstützen². Die Dysfunktion von RPE-Zellen ist an der Pathogenese verschiedener Retinopathien beteiligt, einschließlich der altersbedingten Makuladegeneration, der Retinitis pigmentosa und der diabetischen Retinopathie ^3,4,5. In-vitro-Studien mit RPE-Zellen sind entscheidend, um die Pathogenese dieser Krankheiten besser zu verstehen. Primäre RPE-Zellen werden für diese Studien bevorzugt, da RPE-Zelllinien zwar leicht verfügbar sind, aber wichtige Eigenschaften von primären RPE-Zellen fehlen.

Während verschiedene Spezies als Quellen für primäre RPE-Zellen verwendet wurden, haben Mäuse den Vorteil, dass sie genetische Modifikationen verwenden, um die Pathogenese von Retinopathien zu verstehen. Zuvor beschriebene Protokolle zur Isolierung von RPE-Zellen aus Nagetieren erfordern entweder die Verwendung von neugeborenen Tieren, sind langwierig, erfordern technisches Geschick oder sind nicht für die Kultur^geeignet 6,7,8,9,10,11,12. Wir beschreiben eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von RPE-Zellen aus adulten Mäusen, die hochreine Kulturen dieser Zellen liefern.

Protokoll

Die Verwendung von Versuchspersonen in dieser Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Case Western Reserve University genehmigt.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Sie das Waschpuffermedium vor, indem Sie Hank's balanced salt solution (HBSS), kein Kalzium, kein Magnesium, kein Phenolrot, mit 10 mM HEPES-Pufferlösung ergänzen. Halten Sie die Lösung bis zur Verwendung bei 4 °C.
2. Bereiten Sie das RPE-Medium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle's Medium mit 4,5 g/l Glukose, 1,25x GlutaMAX Supplement (Stammkonzentration 100x oder 200 mM; Endkonzentration von 2,5 mM L-Glutamin), mit 10% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin und 1x MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ergänzen. Vor Gebrauch das Medium im Wasserbad auf 37 °C vorwärmen.

2. Extraktion von Mausaugen

1. Euthanasieren Sie die Maus, vorzugsweise im Alter von 3 bis 14 Wochen, mit einer von der IACUC zugelassenen Methode der Euthanasie (Gebärmutterhalsdislokation unter Narkose unter Narkose unter Verwendung eines Ketamin/Xylazin-Cocktails in einer Menge von 0,1 ml pro 20 g Maus [87,5 mg/kg Ketamin und 12,5 mg/kg Xylazin] war die in dieser Studie verwendete Methode).
   HINWEIS: Augen, die von jüngeren Mäusen entnommen wurden, ermöglichen eine erhöhte Ausbeute an retinalen Pigmentepithelzellen im Laufe der Zeit und erweitern die Kapazität für aufeinanderfolgende Passagen.
2. Legen Sie die Maus flach auf die Seite, wobei das Auge nach oben gerichtet ist.
3. Platzieren Sie den Zeigefinger und den Daumen über bzw. unter dem Auge. Üben Sie sanft Druck auf die Knochenstruktur aus, die das Auge umgibt, um einen Vorsprung des Augapfels zu induzieren.
4. Führen Sie die Spitze einer leicht geöffneten Schere unter das Auge ein und drehen Sie das Handgelenk vorsichtig um 90° vom Auge weg, bis sich das Auge von der Augenhöhle löst.
   HINWEIS: Schließen Sie die Schere nicht, um das Auge oder den Sehnerv zu schneiden, da dies das Präparieren der Augenmuschel erschwert.
5. Legen Sie das Auge sofort in 70%iges Ethanol und rollen Sie es nicht länger als 5 s, bevor Sie es in ein auf Eis aufbewahrtes Waschpuffermedium geben.
6. Übertragen Sie unter einem Präpariermikroskop jeweils ein Auge in eine Petrischale, die mit Waschpuffer und Streifen getränkter Gaze gefüllt ist.
7. Stabilisieren Sie das Auge, indem Sie den Sehnerv mit einer Pinzette festhalten. Machen Sie vorsichtig einen Schnitt auf Höhe der Ora serrata mit einem 3,00 mm 45° chirurgischen Messer oder einer 0,009" Rasierklinge.
8. Führen Sie die Schere mit einer Vannas-Schere vorsichtig in den Schnitt ein und schneiden Sie um den Umfang der Ora serrata herum, bis das vordere Augensegment und der Glaskörper entfernt und entsorgt werden können.
9. Ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig mit einer angebundenen Pinzette von der Augenmuschel ab und achten Sie darauf, die RPE-Schicht nicht zu stören.
   HINWEIS: Um die Netzhaut leichter entfernen zu können, füllen Sie eine Transferpipette mit Waschpuffermedium und tragen Sie es vorsichtig auf die Ränder der Augenmuschel auf, um die Netzhaut sanft anzuheben.
10. Entfernen Sie abschließend den Sehnerv und das überschüssige Bindegewebe mit einer Schere aus der Augenmuschel. Achte darauf, dass du die Augenmuschel nicht durchstichst.

3. Isolierung des primären RPE

1. Übertragen Sie die Augenmuschel in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml 0,25 % Trypsin + 0,02 % EDTA enthält.
   HINWEIS: Zu einem Aliquot von Trypsin-EDTA können zwei Augenmuscheln hinzugefügt werden, um die Ausbeute an kultivierbarem RPE zu erhöhen.
2. Die Mikrozentrifugenröhrchen in ein auf 37 °C eingestelltes Wasserbad geben und 10 Minuten lang inkubieren. Nehmen Sie alle 2 Minuten die Schläuche aus dem Wasserbad und klopfen Sie den Boden des Rohrs 40 Mal fest auf die Arbeitsplatte.
3. Nach 10 Minuten die Augenmuschel vorsichtig mechanisch mit einer P1000 oder einer serologischen 2-ml-Pipette aufbrechen, indem Sie nicht mehr als 3 Mal auf und ab pipettieren.
   HINWEIS: Die Fragmentierung der RPE-Bleche ist unerlässlich, da große Bleche nicht richtig haften.
4. Neutralisieren Sie das Trypsin sofort, indem Sie die abgelösten RPE-Blätter, aber nicht die Augenmuschel, auf 0,5 ml fötales Rinderserum (FBS) in einem konischen 15-ml-Röhrchen schichten.
5. Verdünnen Sie ferner das Trypsin, indem Sie 3 ml RPE-Medium tropfenweise auf die Schichten der FBS- und RPE-Folien schichten.
6. Zentrifugieren Sie das RPE bei 340 x g für 3 min.
7. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einer geeigneten Menge RPE-Medium für eine 24-Well-Platte (1,9 cm²/Well) oder eine 48-Well-Platte (0,75 cm²/Well).
   HINWEIS: RPE kann auf Well-Platten plattiert werden, die mit extrazellulären Matrixproteinen, insbesondere Laminin, Kollagen IV oder Fibronektin, beschichtet sind, um die Adhärenz zu erhöhen¹¹. RPE kann auch in 1 ml RPE-Medium resuspendiert und auf einen Trenngradienten mit 40 % Dichte geschichtet werden, um reine RPE-Zellen weiter zu isolieren. Darüber hinaus kann das Drehen der Platte bei 340 x g für 3-5 Minuten die Zelladhäsion erhöhen¹³.
8. Inkubieren bei 37 °C bei 5 % CO₂.

4. RPE kultivieren

1. Unterbrechen Sie das isolierte RPE mindestens 3 Tage lang nicht. Entfernen Sie nach 72 h vorsichtig das alte Medium und ersetzen Sie es durch frische, vorgewärmte Medien.
2. Wechseln Sie das Medium alle 48 h nach den ersten 3 Tagen.
3. Sobald die Zellen die Konfluenz erreicht haben, passieren Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin + 0,02 % EDTA und reduzieren Sie das FBS im RPE-Medium auf 2 %.
   HINWEIS: Es wurde bereits berichtet, dass primäre RPE nach 5-7 Passagen mit der Dedifferenzierung beginnen und beginnen, ihre hexagonale Form und Pigmentierung zu verlieren¹⁴.

Ergebnisse

Das beschriebene Protokoll wurde bei C57BL/6-Hintergrundmäusen verwendet. Das Geschlecht scheint die Fähigkeit, RPE zu kultivieren, nicht zu verändern. Mäuse unter 6 Wochen liefern im Vergleich zu älteren Mäusen nur begrenzte RPE-Blätter, und es sind möglicherweise mehr Augen erforderlich, um eine optimale Konfluenz zu erreichen. Nach der Isolierung brauchen RPE-Zellen etwa 3 Tage, um sich zu stabilisieren und an der Zellkulturplatte zu befestigen. Etwa 24 Stunden nach der Isolierung haben runde, pigmentierte Zel...

Diskussion

In diesem Artikel haben wir ein vereinfachtes Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von retinalem Pigmentepithel von Mäusen skizziert. RPE-Zellen, die aus den Augen adulter Mäuse isoliert wurden, exprimierten einen RPE-spezifischen Marker, RPE65, und einen interzellulären Verbindungsmarker, ZO-1. Zusätzlich entwickelten sich die kultivierten Zellen in Kultur zu pigmentierten, hexagonalen Blättern.

Mehrere Methoden zur Isolierung von RPE bei Nagetieren wurden bereits veröffentlic...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12