Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Zusammenfassung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Zusammenfassung

Retinale Pigmentepithelzellen (RPE) sind entscheidend für die ordnungsgemäße Funktion der Netzhaut. Die RPE-Dysfunktion ist an der Pathogenese wichtiger Netzhauterkrankungen beteiligt, wie z. B. der altersbedingten Makuladegeneration, der Retinitis pigmentosa und der diabetischen Retinopathie. Wir stellen einen optimierten Ansatz für die Isolierung von RPE aus adulten Augen von Mäusen vor. Im Gegensatz zu bisher berichteten Methoden ermöglicht dieser Ansatz die Isolierung und Kultivierung von hochreinem RPE aus adulten Mäusen. Diese einfache und schnelle Methode erfordert keine umfangreichen technischen Fähigkeiten und ist mit grundlegenden wissenschaftlichen Werkzeugen und Reagenzien erreichbar. Primäre RPE werden aus C57BL/6-Hintergrundmäusen im Alter von 3 bis 14 Wochen durch Enukleation des Auges und anschließende Entfernung des vorderen Segments isoliert. Enzymatische Trypsinisierung und Zentrifugation werden verwendet, um das RPE aus der Augenmuschel zu dissoziieren und zu isolieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz ein schnelles und effektives Protokoll für die Verwendung von RPE bei der Untersuchung der Netzhautfunktion und -erkrankung bietet.

Einleitung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine spezialisierte Zellmonoschicht, die die Bruch-Membran auskleidet und sich zwischen den Photorezeptoren und der Aderhaut^{befindet 1}. RPE-Zellen spielen eine entscheidende Rolle für die ordnungsgemäße Funktion der Netzhaut. RPE-Zellen transportieren Glukose und Vitamin A zu den Photorezeptoren, fördern das Sehvermögen durch Re-Isomerisierung von all-trans-Retinal in 11-cis-Retinal und erhalten die äußeren Segmente des Photorezeptors durch Phagozytose der abgestoßenen äußeren Segmente, entfernen Wasser aus dem subretinalen Raum, bilden die äußere Blut-Netzhaut-Schranke durch das Vorhandensein von Tight Jun....

Protokoll

Die Verwendung von Versuchspersonen in dieser Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Case Western Reserve University genehmigt.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Sie das Waschpuffermedium vor, indem Sie Hank's balanced salt solution (HBSS), kein Kalzium, kein Magnesium, kein Phenolrot, mit 10 mM HEPES-Pufferlösung ergänzen. Halten Sie die Lösung bis zur Verwendung bei 4 °C.
2. Bereiten Sie das RPE-Medium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle's Medium mit 4,5 g/l Glukose, 1,25x GlutaMAX Supplement (Stammkonzentration 100x oder 200 mM; Endkonzentration von 2,5 mM L-G....

Diskussion

In diesem Artikel haben wir ein vereinfachtes Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von retinalem Pigmentepithel von Mäusen skizziert. RPE-Zellen, die aus den Augen adulter Mäuse isoliert wurden, exprimierten einen RPE-spezifischen Marker, RPE65, und einen interzellulären Verbindungsmarker, ZO-1. Zusätzlich entwickelten sich die kultivierten Zellen in Kultur zu pigmentierten, hexagonalen Blättern.

Mehrere Methoden zur Isolierung von RPE bei Nagetieren wurden bereits veröffentlic.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12