A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

요약

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

초록

망막 색소 상피 세포(RPE)는 망막의 적절한 기능에 매우 중요합니다. RPE 기능 장애는 연령 관련 황반 변성, 색소 망막염 및 당뇨병성 망막병증과 같은 중요한 망막 질환의 발병 기전에 관여합니다. 쥐 성인 눈에서 RPE를 분리하기 위한 간소화된 접근 방식을 제시합니다. 이전에 보고된 방법과 달리, 이 접근법은 성체 마우스에서 고순도 RPE의 분리 및 배양을 가능하게 합니다. 이 간단하고 빠른 방법은 광범위한 기술이 필요하지 않으며 기본적인 과학 도구와 시약으로 달성할 수 있습니다. 1차 RPE는 3주에서 14주까지의 C57BL/6 배경 마우스에서 안구 적출 후 전방 분절 제거에 의해 분리됩니다. 효소 트립신화 및 원심분리는 아이컵에서 RPE를 해리하고 분리하는 데 사용됩니다. 결론적으로, 이 접근법은 망막 기능 및 질병 연구에서 RPE를 활용하기 위한 빠르고 효과적인 프로토콜을 제공합니다.

서문

망막 색소 상피(RPE)는 광수용체와 맥락막¹ 사이에 위치한 브루흐 막(Bruch's membrane)을 둘러싸고 있는 특수 세포 단층입니다. RPE 세포는 망막의 적절한 기능에 중요한 역할을 합니다. RPE 세포는 포도당과 비타민 A를 광수용체로 운반하고, all-trans retinal을 11-cis retinal로 재이성질화하여 시력을 촉진하고, 벗겨진 외부 분절의 phagocytosis를 통해 광수용체의 외부 분절을 유지하고, 망막하 공간에서 수분을 제거하고, 긴밀한 접합부의 존재를 통해 외부 혈액-망막 장벽을 형성하고, 신경 영양 성장 인자(예: Pigment Epithelium Derived Factor, 및 Basic Fibroblast Growth Factor)를 지원하여 광수용체를 지원한다². RPE 세포의 기능 장애는 연령 관련 황반 변성, 색소 망막염 및 당뇨병성 망막증을 포함한 다양한 망막병증의 발병에 관여합니다 ^3,4,5. RPE 세포를 사용한 체외 연구는 이러한 질병의 발병 기전에 대한 이해를 높이는 데 매우 중요합....

프로토콜

이 연구에서 동물 피험자의 사용은 Case Western Reserve University의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 시약 준비

1. 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드가 없는 Hank's Balanced Sal 용액(HBSS)에 10mM HEPES 완충 용액을 보충하여 세척 완충 매체를 준비합니다. 사용할 때까지 용액을 4°C에서 유지하십시오.
2. Dulbecco's Modified Eagle's Medium에 4.5g/L 포도당, 1.25x GlutaMAX 보충제(스톡 농도 100x 또는 200mM, 최종 농도 2.5mM L-글루타민), 소 태아 혈청 10%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, MEM 비필수 아미노산 용액 1개(100x)를 보충하여 RPE 배지를 준비합니다. 사용하기 전에 수조에서 미디어를 37°C로 사전 예열하십시오.

2. 쥐 눈 추출

1. 가급적이면 생후 3주에서 14주 사이의 마우스를 IACUC가 승인한 안락사 방법(이 연구에서는 마우스 20g당 0.1mL의 케타민/자일라진 칵테....

토론

이 기사에서는 쥐 망막 색소 상피의 분리 및 배양을 위한 간소화된 프로토콜을 간략하게 설명했습니다. 성체 마우스의 눈에서 분리한 RPE 세포는 RPE 특이적 마커인 RPE65와 세포간 접합 마커인 ZO-1을 발현했습니다. 또한, 배양된 세포는 배양에서 착색된 육각형 시트로 발달했습니다.

설치류에서 RPE를 분리하는 여러 가지^{방법이 이전에} 6,7,8,9,10,11,12로 발표되었?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12