A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

요약

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

초록

망막 색소 상피 세포(RPE)는 망막의 적절한 기능에 매우 중요합니다. RPE 기능 장애는 연령 관련 황반 변성, 색소 망막염 및 당뇨병성 망막병증과 같은 중요한 망막 질환의 발병 기전에 관여합니다. 쥐 성인 눈에서 RPE를 분리하기 위한 간소화된 접근 방식을 제시합니다. 이전에 보고된 방법과 달리, 이 접근법은 성체 마우스에서 고순도 RPE의 분리 및 배양을 가능하게 합니다. 이 간단하고 빠른 방법은 광범위한 기술이 필요하지 않으며 기본적인 과학 도구와 시약으로 달성할 수 있습니다. 1차 RPE는 3주에서 14주까지의 C57BL/6 배경 마우스에서 안구 적출 후 전방 분절 제거에 의해 분리됩니다. 효소 트립신화 및 원심분리는 아이컵에서 RPE를 해리하고 분리하는 데 사용됩니다. 결론적으로, 이 접근법은 망막 기능 및 질병 연구에서 RPE를 활용하기 위한 빠르고 효과적인 프로토콜을 제공합니다.

서문

망막 색소 상피(RPE)는 광수용체와 맥락막¹ 사이에 위치한 브루흐 막(Bruch's membrane)을 둘러싸고 있는 특수 세포 단층입니다. RPE 세포는 망막의 적절한 기능에 중요한 역할을 합니다. RPE 세포는 포도당과 비타민 A를 광수용체로 운반하고, all-trans retinal을 11-cis retinal로 재이성질화하여 시력을 촉진하고, 벗겨진 외부 분절의 phagocytosis를 통해 광수용체의 외부 분절을 유지하고, 망막하 공간에서 수분을 제거하고, 긴밀한 접합부의 존재를 통해 외부 혈액-망막 장벽을 형성하고, 신경 영양 성장 인자(예: Pigment Epithelium Derived Factor, 및 Basic Fibroblast Growth Factor)를 지원하여 광수용체를 지원한다². RPE 세포의 기능 장애는 연령 관련 황반 변성, 색소 망막염 및 당뇨병성 망막증을 포함한 다양한 망막병증의 발병에 관여합니다 ^3,4,5. RPE 세포를 사용한 체외 연구는 이러한 질병의 발병 기전에 대한 이해를 높이는 데 매우 중요합니다. RPE 세포주는 쉽게 구할 수 있지만 1차 RPE 세포의 주요 특성이 부족하기 때문에 이러한 연구에서 훨씬 선호됩니다.

다양한 종이 일차 RPE 세포의 공급원으로 활용되어 왔지만, 마우스는 유전자 변형을 사용하여 망막병증의 발병 기전을 이해하는 데 도움이 되는 장점이 있습니다. 설치류로부터 RPE 세포를 분리하기 위한 이전에 설명된 프로토콜은 신생아 동물의 사용을 필요로 하거나, 시간이 오래 걸리거나, 기술적 기술을 요구하거나, 배양에 적합하지 않다 6,7,8,9,10,11,12. 당사는 RPE 세포를 고순도 배양액을 생성하는 성체 마우스에서 RPE 세포를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

프로토콜

이 연구에서 동물 피험자의 사용은 Case Western Reserve University의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 시약 준비

1. 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드가 없는 Hank's Balanced Sal 용액(HBSS)에 10mM HEPES 완충 용액을 보충하여 세척 완충 매체를 준비합니다. 사용할 때까지 용액을 4°C에서 유지하십시오.
2. Dulbecco's Modified Eagle's Medium에 4.5g/L 포도당, 1.25x GlutaMAX 보충제(스톡 농도 100x 또는 200mM, 최종 농도 2.5mM L-글루타민), 소 태아 혈청 10%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, MEM 비필수 아미노산 용액 1개(100x)를 보충하여 RPE 배지를 준비합니다. 사용하기 전에 수조에서 미디어를 37°C로 사전 예열하십시오.

2. 쥐 눈 추출

1. 가급적이면 생후 3주에서 14주 사이의 마우스를 IACUC가 승인한 안락사 방법(이 연구에서는 마우스 20g당 0.1mL의 케타민/자일라진 칵테일[87.5mg/kg 케타민 및 12.5mg/kg 자일라진]을 사용한 마취 하에 자궁경부 탈구)을 사용하여 안락사시킵니다.
   참고: 어린 쥐에서 채취한 눈은 시간이 지남에 따라 망막 색소 상피 세포 수율을 증가시키고 연속적인 통과 능력을 확장합니다.
2. 눈을 위로 향하게 하여 마우스를 옆으로 평평하게 눕힙니다.
3. 검지와 엄지를 각각 눈 위와 아래에 놓습니다. 눈을 둘러싼 뼈 구조에 부드럽게 압력을 가하여 안구의 돌출을 유도합니다.
4. 약간 열린 가위의 끝을 눈 아래에 삽입하고 눈이 소켓에서 분리될 때까지 손목을 눈에서 90° 부드럽게 회전시킵니다.
   알림: 눈이나 시신경을 절단하기 위해 가위를 닫지 마십시오., 아이컵의 해부를 더 어렵게 만들 수 있습니다.
5. 즉시 눈을 70% 에탄올에 넣고 5초 이상 굴린 후 얼음 위에 보관된 세척 완충 매체로 옮깁니다.
6. 해부 현미경으로 한 번에 한쪽 눈을 세척 완충액과 적신 거즈 조각으로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다.
7. 핀셋으로 시신경을 잡아 눈을 안정시킵니다. 3.00mm 45° 수술용 칼 또는 0.009인치 면도날을 사용하여 오라 세라타 높이를 부드럽게 절개합니다.
8. Vannas 가위를 사용하여 절개 부위에 가위를 부드럽게 삽입하고 전방분절과 유리체를 제거하고 버릴 수 있을 때까지 ora serrata 둘레를 자릅니다.
9. RPE 층을 방해하지 않도록 주의하면서 끈으로 묶인 집게를 사용하여 아이컵에서 망막을 부드럽게 벗겨냅니다.
   참고: 망막을 더 쉽게 제거하려면 전사 피펫에 세척 버퍼 매체를 채우고 아이컵 가장자리에 조심스럽게 적용하여 망막을 부드럽게 들어 올립니다.
10. 마지막으로 가위를 사용하여 아이컵에서 시신경과 과도한 결합 조직을 제거합니다. 아이컵에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하십시오.

3. 기본 RPE 격리

1. 1mL의 0.25% 트립신 + 0.02% EDTA가 포함된 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 아이컵을 옮깁니다.
   참고: 배양 가능한 RPE의 수율을 높이기 위해 Trypsin-EDTA의 부분 표본 1개에 두 개의 아이컵을 추가할 수 있습니다.
2. 마이크로 원심분리기 튜브를 37°C로 설정된 수조로 옮기고 10분 동안 배양합니다. 2분마다 수조에서 튜브를 제거하고 튜브 바닥을 조리대에 40번 단단히 두드립니다.
3. 10분 후 P1000 또는 2mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 3회 이상 피펫팅하여 아이컵을 기계적으로 부드럽게 파괴합니다.
   알림: 큰 시트는 제대로 접착되지 않으므로 RPE 시트의 단편화가 필수적입니다.
4. 아이컵이 아닌 분리된 RPE 시트를 15mL 원뿔형 튜브에 담긴 0.5mL의 소 태아 혈청(FBS)에 겹쳐 트립신을 즉시 중화시킵니다.
5. 또한 3mL의 RPE 배지를 FBS 및 RPE 시트 층에 적하하여 트립신을 희석합니다.
6. RPE를 340 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.
7. 상층액을 버리고 24웰 플레이트(1.9cm²/웰) 또는 48웰 플레이트(0.75cm²/웰)에 적합한 양의 RPE 매체에 세포를 재현탁시킵니다.
   참고: RPE는 세포외 기질 단백질, 특히 라미닌, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴으로 코팅된 웰 플레이트에 도금하여 부착력을 높일 수 있습니다¹¹. 또한 RPE는 1mL의 RPE 배지에 재현탁하고 40% 밀도 분리 그래디언트에 적층하여 순수 RPE 세포를 추가로 분리할 수 있습니다. 또한, 플레이트를 340 x g 에서 3-5분 동안 회전시키면 세포 접착력이 증가할 수 있다¹³.
8. 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 배양합니다.

4. RPE 배양

1. 최소 3일 동안 격리된 RPE를 중단하지 마십시오. 72시간 후 기존 매체를 조심스럽게 제거하고 미리 데워진 새 매체로 교체합니다.
2. 처음 48일 후 3시간마다 매체를 교체하십시오.
3. 세포가 밀도에 도달하면 0.25% 트립신 + 0.02% EDTA를 사용하여 세포를 통과시키고 RPE 배지의 FBS를 2%로 줄입니다.
   참고: 일차 RPE는 이전에 5-7회 통과 후에 역분화를 시작하고 육각형 모양과 색소 침착을 잃기 시작하는 것으로 보고되었다¹⁴.

결과

설명된 프로토콜은 C57BL/6 배경 마우스에 사용되었습니다. 성별은 RPE를 배양하는 능력을 변화시키지 않는 것으로 보인다. 6주 미만의 마우스는 나이가 많은 마우스에 비해 제한된 RPE 시트를 생성하며 최적의 밀도에 도달하기 위해 더 많은 눈이 필요할 수 있습니다. 분리 후 RPE 세포가 안정화되어 세포 배양 플레이트에 부착되는 데 약 3일이 걸립니다. 분리 후 약 24시간이 지나면 무핵세포처럼 보이?...

토론

이 기사에서는 쥐 망막 색소 상피의 분리 및 배양을 위한 간소화된 프로토콜을 간략하게 설명했습니다. 성체 마우스의 눈에서 분리한 RPE 세포는 RPE 특이적 마커인 RPE65와 세포간 접합 마커인 ZO-1을 발현했습니다. 또한, 배양된 세포는 배양에서 착색된 육각형 시트로 발달했습니다.

설치류에서 RPE를 분리하는 여러 가지^{방법이 이전에} 6,7,8,9,10,11,12로 발표되었?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12