مراقبة تراكم الأدوية النانوية في نقائل سرطان الثدي في الفئران

Summary

هنا ، نصف بروتوكول التوصيل في الجسم الحي للجزيئات النانوية المغناطيسية لأكسيد الحديد التي تحمل قلات الحمض النووي الريبي إلى سرطان الثدي النقيلي في النماذج الحيوانية ، مما يوفر نهجا قابلا للتطبيق سريريا للإسكات العلاجي للأحماض النووية المسرطنة.

Abstract

سرطان الثدي النقيلي هو مرض مدمر مع خيارات علاجية محدودة للغاية ، مما يتطلب استراتيجيات علاجية جديدة. ثبت أن miRNAs المسرطنة مرتبطة بالإمكانيات النقيلية لسرطان الثدي وهي متورطة في هجرة الخلايا السرطانية والغزو والجدوى. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب توصيل جزيء الحمض النووي الريبي المثبط إلى الأنسجة ذات الاهتمام. للتغلب على هذا التحدي وتوصيل قليل النوكليوتيدات النشطة المضادة للمعنى للأورام ، استخدمنا جزيئات أكسيد الحديد المغناطيسي النانوية كمنصة توصيل. تستهدف هذه الجسيمات النانوية الأنسجة ذات نفاذية الأوعية الدموية المتزايدة ، مثل مواقع الالتهاب أو السرطان. يمكن مراقبة توصيل هذه الجسيمات النانوية في الجسم الحي عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) نظرا لخصائصها المغناطيسية. ستكون ترجمة هذا النهج العلاجي إلى العيادة أكثر سهولة بسبب توافقه مع طريقة التصوير ذات الصلة هذه. يمكن أيضا تصنيفها مع مراسلي التصوير الآخرين مثل الصبغة البصرية القريبة من الأشعة تحت الحمراء Cy5.5 للتصوير البصري المترابط والفحص المجهري الفلوري. هنا ، نوضح أن الجسيمات النانوية المصنفة ب Cy5.5 والمترافقة مع أوليغومرات علاجية تستهدف miRNA-10b المسرطنة (تسمى MN-anti-miR10b ، أو "الدواء النانوي") التي يتم إعطاؤها عن طريق الوريد تتراكم في المواقع النقيلية ، مما يفتح إمكانية التدخل العلاجي لسرطان الثدي النقيلي.

Introduction

على الرغم من العديد من التطورات في علاج سرطان الثدي ، لا تزال الخيارات السريرية للأمراض النقيلية محدودة. يتلقى المرضى عادة علاجات تستهدف الدوافع المحددة في الورم الأساسي ، مثل هرمون الاستروجين أو HER2 ، ولكن لا يتم الحفاظ على هذه الدوافع دائما في النقائل ، مما يجعل العلاج غير فعال¹. العلاجات الجهازية الأخرى ، مثل العلاج الكيميائي ، غير محددة ومعروفة بآثارها الجانبية. لتطوير خيارات فعالة لعلاج سرطان الثدي النقيلي ، من المهم مراعاة الدوافع البيولوجية التي تسمح للخلايا السرطانية بالانتشار واستعمار المواقع البعيدة. أحد هذه الدوافع هو miR-10b ، وهو ميكرو RNA مسرطن ، متورط في بقاء خلايا سرطان الثدي ، والغزو ، والهجرة ، والذي ثبت أنه كاف لمنح إمكانات نقيلية في خلايا سرطان الثدي غير النقيلية^2،3. الأهم من ذلك ، يتم التعبير عن miR-10b أيضا بمستويات أعلى في النقائل مقارنة بالأورام الأولية^{المتطابقة 4} ، مما يجعلها هدفا واعدا لعلاج النقائل الموجودة.

على الرغم من أن miRNAs مثل miR-10b لديها إمكانات كبيرة كأهداف علاجية للأمراض النقيلية ، إلا أن تصميم طرق قابلة للتطبيق علاجيا لإسكات miRNA يمثل تحديات فريدة. عادة ما يتم نقل قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى (ASOs) التي تربط تسلسل miRNA التكميلي الخاص بها إلى الخلايا في المختبر باستخدام الدهون ولكن لا يمكنها الوصول بسهولة إلى الخلايا السرطانية في الجسم الحي بسبب عدم الاستقرار المتأصل ، وخطر التدمير بواسطة النوكليازات ، وعمر نصف الدم القصير ، وعدم القدرة على دخول الخلايا بسبب تنافر الشحنة⁵. لمكافحة هذه التحديات ، قمنا بتطوير ناقل قابل للتطبيق سريريا للجزيئات الحيوية باستخدام الجسيمات النانوية لأكسيد الحديد المغناطيسي المطلي بالديكستران (MNP) ⁶. تسمح مجموعات الأمين على الجسيمات النانوية باقتران قليل النوكليوتيدات والأصباغ الفلورية (على سبيل المثال ، Cy5.5) ، واستهداف الشقوق. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح قلب أكسيد الحديد بالمراقبة في الجسم الحي لتسليم السيارة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). قمنا بتجميع الحمض النووي المقفل المضاد ل miR-10b ASO و Cy5.5 إلى MNP لإنشاء "دواء نانوي" يشار إليه باسم MN-anti-miR10b ، كما هو موضح في الشكل 1⁷.

في دراساتنا السابقة ، أظهرنا أن الدواء النانوي يتسبب بكفاءة في تقليل تنظيم miR-10b ويمنع هجرة وغزو خلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية في المختبر⁷. في نماذج الفئران لسرطان الثدي النقيلي ، منع التوصيل الوريدي للدواء النانوي تطور نقائل العقدة الليمفاوية أو ، إذا تم إعطاؤه بعد تكوين ورم خبيث في العقدة الليمفاوية ، أوقف نموها⁷. والجدير بالذكر أن الدواء النانوي يتراكم بسهولة في الأنسجة السرطانية. في حين أن الدواء النانوي لم يقضي على النقائل من تلقاء نفسه ، فقد أظهرنا في الدراسات اللاحقة أن العلاج المركب مع دوكسوروبيسين المساعد كان علاجيا في كل من نماذج الفئران التي تعاني من نقص المناعة والمناعية^3،8. كما شوهدت آثار تثبيط miR-10b بواسطة الدواء النانوي في سرطان الثدي القطط⁹.

لعلاج سرطان الثدي بشكل فعال ، من الضروري إثبات أن الدواء يتراكم في الأنسجة ذات الأهمية. هنا ، نقدم بروتوكولا لإثبات تراكم حامل الجسيمات النانوية المغناطيسية المستخدم لتوصيل ASOs العلاجية المضادة ل miR-10b إلى الأنسجة السرطانية باستخدام طرق متعددة في نماذج الفئران لسرطان الثدي النقيلي.

Protocol

وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة ولاية ميشيغان (IACUC) على جميع الإجراءات التي تنطوي على. ويرد في الجدول 1 ملخص لقيم الحسابات.

1. الخطوات الرئيسية لتخليق MN-anti-miR10b

ملاحظة: تم وصف تفاصيل تخليق MN-anti-miR10b سابقا^9،10،11.

1. تحضير قلب الجسيمات النانوية المغناطيسية (MN) بطريقة الترسيب المشترك.
2. ربط الجسيمات النانوية المحضرة وأميناتها باستخدام هيدروكسيد الصوديوم ، وإبي كلوروهيدرين ، وهيدروكسيد الأمونيوم.
3. اقتران إستر Cy5.5-NHS إلى MN من خلال الرابط المتقاطع غير المتجانس N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] -propionate (SPDP) للحصول على MN-Cy5.5 لتمكين التصوير الفلوري والفحص المجهري.
4. قم بتنشيط الحمض النووي المقفل المضاد ل miR-10b مع 3٪ تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP) واقتران مع MN-Cy5.5 لإنتاج MN-anti-miR10b.
5. قم بإجراء توصيف المترافق لتحديد محتوى الحديد (عن طريق فحص الحديد) ، وعدد جزيئات Cy5.5 لكل جسيم نانوي (عن طريق القياس الطيفي) وكمية LNA المترافق (عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز).

2. اكتساب الدراسة

1. حدد الدراسة مسبقا لتخطيط المجموعات التجريبية وعدد لكل مجموعة. إيواء ما يصل إلى 5 فئران لكل قفص. إذا تم استخدام أقفاص متعددة من 5 فئران أثناء العلاج ، فتأكد من وجود فئران تحكم وتجربة داخل كل قفص لإزالة القفص كمتغير مربك.
2. احصل على الفئران في عمر 6-7 أسابيع. السماح لمدة أسبوع واحد على الأقل من التأقلم مع ظروف السكن قبل تحريض أورام تقويم العظام.
   ملاحظة: الإجراءات التي تستخدم نموذج MDA-MB-231 (خط الخلايا المشتق من الإنسان) للورم الخبيث التلقائي لسرطان الثدي موصوفة أدناه. بالنسبة لهذا النموذج ، يشيع استخدام الفئران العارية الرياضية (Foxn1^nu / Foxn1^nu). يمكن استخدام سلالات الفئران الأخرى المتوافقة التي تعاني من نقص المناعة ، والإجراءات قابلة للتطبيق أيضا على نماذج الطعم الخيفي في الفئران ذات الكفاءة المناعية (على سبيل المثال ، خلايا سرطان الثدي 4T1 في الفئران BALB / c).

3. خلايا الثقافة

1. مكمل غذائي Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (وسط نمو كامل) لنمو خلايا MDA-MB-231 التي تعبر عن لوسيفيراز (على سبيل المثال ، MDA-MB-231-luc-D3H2LN). قم بزراعة الخلايا في ظروف معقمة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 95٪ رطوبة ، بشكل عام في قارورة T75. في حالة تجميدها ، قم بإذابة الخلايا ومرورها مرة واحدة على الأقل قبل زرع الورم. سجل رقم المرور على القارورة.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إذابة قارورة مجمدة مسبقا من 1 × 10⁶ خلايا وتمريرها مرتين قبل الاستخدام.
   1. للمرور ، ضع 0.25٪ تريبسين لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية على التربسين للخلايا عند التقاء <80٪. أضف 4 أضعاف حجم وسائط النمو الكاملة لتحييد التربسين.
   2. جهاز الطرد المركزي التعليق عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في أنبوب مخروطي الشكل. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسط النمو الكامل بعد صب المادة الطافية. اقتبس جزءا من الخلايا إلى قارورة جديدة وأضف وسط نمو كامل إضافي بناء على حجم القارورة الجديدة. قم بتحديث رقم المرور على القارورة الجديدة.
2. قم بإذابة خلايا جديدة بعد 10 مقاطع لتقليل الانجراف الجيني عبر الدراسات.

4. تحضير الخلايا لتحريض أورام تقويم العظام

1. ضع Matrigel المجمد (مستخلص مصفوفة الغشاء القاعدي) على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة قبل التحضير للسماح لمستخلص المصفوفة بالتسييل.
2. تحديد تركيز وحجم الخلايا اللازمة للدراسة. زرع الفئران مع 1 × 10⁶ خلايا لكل فأر في حجم 50 ميكرولتر ، يتكون من جزء واحد من PBS المبرد وجزء واحد من مستخلص المصفوفة.
3. حبيبات الخلايا التربسينية كما هو موضح في الخطوة 3.1.2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل على الأقل من PBS لغسل الخلايا ، ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS المبرد (مخزون الخلايا).
4. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. نظرا لأن الخلايا ستكون بتركيز عال ، فقم بتخفيف كمية صغيرة (على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر) حسب الحاجة ، مع تتبع عامل التخفيف حتى يمكن أخذ قياسات دقيقة.
5. قم بتخفيف العدد الإجمالي المطلوب من الخلايا إلى 40 × 10⁶ خلايا / مل ، ثم أضف حجما متساويا من مستخلص المصفوفة المبردة لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1 × 10⁶ خلايا لكل 50 ميكرولتر.
   ملاحظة: يتم تلخيص تركيزات الخلايا في الجدول 1.

5. تحريض أورام تقويم العظام

1. قم بتخدير الفأر باستخدام 2٪ من الأيزوفلوران ثم نقله إلى مخروط الأنف ، مع الحفاظ على المستوى الجراحي للتخدير باستخدام 0-3٪ من الأيزوفلوران على وسادة التدفئة. تأكد من المستوى الجراحي للتخدير من خلال عدم وجود رد فعل القرنية و / أو استجابة قرصة إصبع القدم. احمي من جفاف القرنية عن طريق وضع مرهم للعيون على العينين.
2. نظف الجلد بالقرب من موقع الحقن بمنديل كحولي بنسبة 70٪ واترك بضع ثوان حتى يجف الكحول. حث في الغدة الثديية #4 للحد من خطر تداخل إشارات التصوير التلألؤ الحيوي بين الورم الأولي والمواقع الأكثر شيوعا للورم الخبيث (الرئة والعقدة الليمفاوية الإبطية).
   ملاحظة: تم وصف ترقيم الغدة الثديية سابقا¹². باختصار ، سيكون للفأر في وضع ضعيف مع توجيه الرأس لأعلى غدد من 1 إلى 5 على الجانب الأيمن من الحاقن (يسار الفأر) بدءا من الأقرب إلى الرأس (عنق الرحم - الغدة 1) وتنزل إلى الأكثر ذيلية (الأربية - الغدة 5). يتم توجيه الغدد من 6 إلى 10 بشكل مشابه على الجانب الآخر من.
3. قم بسحب مخزون الخلية لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلايا. اسحب 50 ميكرولتر من معلق الخلية الباردة في حقنة الأنسولين بإبرة 29 جم وحقن الخلايا على الفور. احتفظ بالمحقنة على الثلج إذا لم تكن قادرة على الحقن على الفور.
   ملاحظة: Pipet لأعلى ولأسفل بين كل سحب من الخلايا لمنع الخلايا من الاستقرار.
4. أدخل الشطبة مباشرة أسفل حلمة الغدة الثديية المرغوبة بالتوازي مع جسم الفأر في هذا الموقع وحقن الخلايا بمعدل ثابت وبطيء. اترك الإبرة داخل الجلد لمدة 5 ثوان على الأقل بعد الانتهاء من الحقن للسماح ل Matrigel بالتصلب ومنع التسرب.
5. انقل الماوس إلى قفص نظيف على وسادة تسخين للتعافي والإشراف عليه حتى يصبح متنقلا بالكامل وقادرا على الحفاظ على الهبوط القصي. لا تترك الماوس دون رقابة. أعد الفأر إلى قفصه مع الفئران الأخرى فقط بعد أن يتعافى.

6. مراقبة نمو الورم وتطور ورم خبيث من خلال التصوير الحيوي (BLI)

ملاحظة: نظرا لأن خلايا MDA-MB-231 المستخدمة هنا تعبر عن لوسيفيراز ، فإن حقن ركيزة اللوسيفيرين في الفئران سينتج إشارة بصرية تم اكتشافها بواسطة الماسح الضوئي لنظام التصوير. في هذا النموذج ، يمكن توقع النقائل في غضون 5-7 أسابيع بعد تحريض الورم. يوصى بتصوير الفئران 1-3x في الأسبوع ، اعتمادا على أهمية تحديد اللحظة الدقيقة التي يتم فيها تصور النقائل.

1. تخدير الفئران باستخدام 2٪ أيزوفلوران لتقليل خطر إصابة الفأر عند إعطاء لوسيفيرين. احمي من جفاف القرنية عن طريق وضع مرهم للعيون على العينين.
2. حقن 150 ملغم/كغ من وزن الجسم من لوسيفيرين داخل الصفاق في كل فأر وأعد الفئران إلى قفصها على وسادة الاحترار للسماح للفئران بإيقاظ واستقلاب اللوسيفيرين. الإشراف على الفئران وعدم تركها دون رقابة حتى تكون متنقلة بالكامل وقادرة على الحفاظ على الاستلقاء القصي.
   ملاحظة: يتم تلخيص القيم المستخدمة لحسابات الجرعات في الجدول 1.
3. قم بتصوير الفئران باستخدام الماسح الضوئي لنظام التصوير بدءا من حوالي 10 دقائق بعد الحقن باللوسيفيرين ، وإعادة تخدير الفئران عند الحاجة للسماح بالوقت للنقل إلى IVIS.
   1. صور ما يصل إلى 5 فئران معا في وضع ضعيف ، مع الحرص على ضمان تضمين أجسامهم بالكامل في علامات دليل مجال الرؤية وتوجيهها بشكل مستقيم قدر الإمكان. استخدم شريطا شفافا لتأمين أذرعهم لتصور أفضل للغدد الليمفاوية الإبطية. إذا قمت بتصوير عدة فئران في وقت واحد ، فاستخدم فواصل متعددة لفصل الفئران لمنع الإشارات من الإشعاع على الفئران الأخرى. إذا لم تكن الفواصل متوفرة ، فاستخدم شرائط من الورق الممتص للضوء في مكانها (على سبيل المثال ، البطاقات السميكة والسوداء).
      ملاحظة: تختلف معدلات استقلاب اللوسيفيرين باختلاف نماذج الفئران وخطوط الخلايا ، وقد لا ينتج عن الحصول على الصور الذي يبدأ بعد 10 دقائق من الحقن أقوى إشارة. ويوصى بإجراء عمليات اقتناء في نقاط زمنية مختلفة في بداية دراسة جديدة لتحديد توقيت شدة الإشارة القصوى.
   2. قم بإعداد برنامج نظام التصوير للحصول على الصور باستخدام الإعدادات التالية ل BLI: التعريض الضوئي = تلقائي ، التجميع = متوسط ، FStop = 1 ، الإثارة = الكتلة ، الانبعاث = الفتح ، مجال الرؤية = D ، الارتفاع = 1.50.
   3. بشكل عام ، ستنتج إشارات الورم الأولية إشارة قوية نسبيا بسبب موقعها السطحي باستخدام الإعداد التعرض = تلقائي. في حالة مراقبة النقائل ، استخدم شريطا كهربائيا أسود لتغطية الورم الأساسي بعناية واضبط التعرض يدويا = 300 ثانية (أو أكثر) للحصول على إشارات باهتة إذا كانت موجودة.
      ملاحظة: في هذا النموذج ، تعتبر إشارة منفصلة عن الورم الأولي مرئية خلال جلسات تصوير متعددة عندما يتم تعيين العتبة السفلية على 5 × 10³ إشراقا مؤشرا على ورم خبيث.

7. استئصال الأورام الأولية

ملاحظة: استئصال الأورام الأولية مهم للدراسات الطولية (على سبيل المثال ، العلاجية) في النقائل. خلاف ذلك ، قد تستسلم الفئران للمراضة المرتبطة بنمو الورم الأولي غير المقيد. ضع في اعتبارك حجم الورم الأولي (خطر فقدان الدم عند الاستئصال) والتقرح (خطر الإصابة بالعدوى) عند تحديد وقت الاستئصال.

1. إذا كنت تفكر في عدم وجود إشارة BLI لاختبار استئصال الورم الأولي الناجح ، فقم بإجراء تصوير ما قبل العملية كما هو موضح في القسم 6 وتأكد من عدم وجود إشارة بعد الجراحة. تأكد من الاستئصال الناجح في غضون 1-2 أيام القادمة باستخدام اللوسيفيرين الذي تم تناوله حديثا.
   ملاحظة: لا ينصح بإعادة إعطاء اللوسيفيرين على الفور لتجنب الإجهاد غير الضروري للحيوان. يجب أن يكون اللوسيفيرين المحقون قبل استئصال الورم الأولي كافيا للكشف عن الإشارة إذا لم يكتمل الاستئصال.
2. قم بتخدير الفأر باستخدام 2٪ من الأيزوفلوران ثم نقله إلى مخروط الأنف ، مع الحفاظ على المستوى الجراحي للتخدير باستخدام 0-3٪ إيزوفلوران على وسادة التدفئة. تأكيد المستوى الجراحي للتخدير من خلال عدم وجود رد فعل القرنية و / أو استجابة قرصة إصبع القدم.
3. يحمي من جفاف القرنية عن طريق وضع مرهم للعيون على العينين
4. حقن 5 ملغم / كجم كيتوبروفين تحت الجلد كمسكن للإجراء.
   ملاحظة: يتم تلخيص القيم المستخدمة لحسابات الجرعات في الجدول 1.
5. جهز المنطقة الجراحية عن طريق التناوب بين 70٪ كحول وبيتادين 3x. اترك مقشر البيتادين النهائي يجف قبل المتابعة.
6. استخدم مقصا جراحيا معقما لفتح الجلد فوق الورم الأساسي عموديا (الذيلية-الذيلية). في حالة الجلد المتقرح ، ابدأ في الفتح على جانب التقرح لتجنب ترك الورم الأساسي وراءه ولإزالة الجلد المتقرح تماما.
7. استمر في استخدام المقص والملقط لتشريح النسيج الضام حول الورم المغلف بعناية لإزالة الكتلة تماما من الجلد ، وكذلك أنسجة الجسم الأساسية حيث قد ينمو أي ورم متبقي.
8. في حالة وجوده ، تحكم في النزيف عن طريق الضغط باستخدام قضيب قطني.
9. أغلق الفتحة الجراحية بخياطة فيكريل 5-0.
   ملاحظة: قد تؤدي الخياطة المتقطعة إلى تحسين سالكية الجرح لأن الفئران عرضة لإزعاج موقع الجراحة.
10. اسمح للحيوان بالتعافي في قفص نظيف على وسادة تدفئة حتى يصبح متنقلا بالكامل. ضع الطعام المبلل في قاع قفص المنزل عند إعادة إلى القفص.
11. حقن 5 ملغ/كغ كيتوبروفين تحت الجلد مرة واحدة يوميا لمدة يومين على الأقل بعد الجراحة. تحقق من صحة الجرح في هذه الأوقات.

8. تسليم الأدوية النانوية

1. وزن الفئران لأن جرعة الدواء النانوي تعتمد على وزن الجسم.
2. قم بتخدير الفأر باستخدام 2٪ من الأيزوفلوران ثم نقله إلى مخروط الأنف ، مع الحفاظ على المستوى الجراحي للتخدير باستخدام 0-3٪ إيزوفلوران على وسادة التدفئة. تأكيد المستوى الجراحي للتخدير من خلال عدم وجود رد فعل القرنية و / أو استجابة قرصة إصبع القدم.
   ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن إعطاء الدواء النانوي لفأر مستيقظ مقيد. ستكون جميع الخطوات اللاحقة هي نفسها.
3. تحضير حقنة الأنسولين بإبرة 29 جم مع 10 مجم من دواء الحديد النانوي / كجم من وزن جسم الفأر.
4. اغمر ذيل في ماء دافئ (30-35 درجة مئوية) لمدة 30 ثانية لتوسيع عروق الذيل.
5. امسح الماء الزائد من الذيل ونظف موقع الحقن بمنديل كحولي بنسبة 70٪.
6. أدخل شطبة الإبرة في وريد الذيل الجانبي في منتصف الطريق تقريبا أسفل الذيل واسحب المكبس للخلف قليلا لتأكيد وضعه مع الفلاش باك للدم في الإبرة. إذا لزم الأمر ، حرك الإبرة قليلا للأمام أو إلى عمق أكثر سطحية لتحقيق وضع ناجح.
7. عند الإدخال الناجح ، قم بحقن الدواء النانوي بمعدل بطيء يبلغ حوالي 5-10 ثوان لحقن 40 ميكرولتر. تأكد من نجاح الحقن من خلال عدم تجمع المحلول تحت جلد الذيل بالقرب من موقع الحقن وعن طريق سواد الوريد (من محلول الجسيمات النانوية الداكنة).
   ملاحظة: يتم تلخيص القيم المستخدمة لحسابات الجرعات في الجدول 1. قد تنصمام تركيبات الجسيمات النانوية المتكتلة في الرئة. إذا لوحظت ضائقة تنفسية بعد فترة وجيزة من الحقن ، فقم بإجراء ضغطات على الصدر برفق على الماوس. يؤدي العمل الفوري دائما إلى التعافي الناجح للحيوان من هذه المشكلة المحتملة.
8. اضغط على موقع الحقن بالشاش وقم بإزالة الإبرة ، مع الحفاظ على الضغط لمدة 30 ثانية تقريبا حتى يتوقف النزيف.
9. اسمح للحيوان بالتعافي في قفص نظيف على وسادة تدفئة حتى يصبح متنقلا بالكامل.

9. جمع النقائل للتحليل

1. صور الفئران بواسطة BLI كما هو موضح في القسم 6.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، يعتبر 5 × 10³ إشراق مؤشرا على ورم خبيث ويلاحظ بشكل عام في 5-7 أسابيع. من المتوقع حدوث تباين طفيف في وقت ورم خبيث عبر الفئران.
2. مباشرة بعد التصوير ، قم بالتضحية بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم تحت الأيزوفلوران الثقيل (5٪). قبل التشريح ، تأكد من الوفاة بسبب عدم وجود منعكس القرنية و / أو استجابة قرصة إصبع القدم.
3. اجمع النقائل بعناية. توجد نقائل العقدة الليمفاوية على شكل كتلة متضخمة ومغلفة. سيتم توزيع نقائل الرئة بشكل عام في جميع أنحاء حمة الرئة. ومن ثم ، اجمع الرئة بأكملها.
4. ضع الأنسجة المجمعة في طبق بتري وقم بتصويرها باستخدام نظام التصوير لتأكيد التلألؤ البيولوجي (مما يشير إلى وجود خلايا سرطانية تعبر عن لوسيفيراز) والتألق (يشير إلى تراكم الأدوية النانوية). استخدم نفس إعدادات اكتساب BLI كما هو موضح في الخطوة 6.3.2. إعدادات اكتساب FLI هي التعرض = تلقائي ، Binning = متوسط ، FStop = 1 ، الإثارة = 675 والانبعاث = 720 (البرنامج الافتراضي لصبغة Cy5.5) ، مستوى المصباح = مرتفع ، مجال الرؤية = D ، الارتفاع 1.50. قم بتصوير جثة الفأر لتحديد ما إذا كان هناك نسيج سرطاني متبقي يستحق جمعه.
5. شطف الأنسجة السرطانية في PBS.
6. لجمع الأنسجة للفحص المجهري أو qRT-PCR ، قم بتضمينها في OCT وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمعالجة.
7. لجمع الأنسجة من أجل التحليل الطيفي للانبعاث البصري للبلازما المقترن بالحث (ICP-OES) ، قم بتفريغ مقياس باستخدام أنبوب فارغ سعة 1.7 مل ، وضع الأنسجة في الأنبوب ، وسجل وزنها. قم بتجميد المناديل وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمعالجة.

10. التحقق من صحة توصيل الأدوية النانوية عن طريق المجهر الفلوري

1. قم بالتبريد بالعينات المجمدة الطازجة المضمنة في OCT على شرائح الفحص المجهري بسمك 10 ميكرومتر. اضبط درجات حرارة الغرفة وحامل العينة وفقا لنوع الأنسجة. الإعدادات بين -20 درجة مئوية و -15 درجة مئوية مناسبة لكل من أنسجة الرئة والليمفاوية.
2. ثبت أقسام المناديل على الشرائح عن طريق غمر الأقسام أو الشرائح بأكملها في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لمدة 15 دقيقة. اشطفها بعناية باستخدام PBS.
3. قم بتركيب أغطية على الشرائح. استخدم وسيطا يحتوي على 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لتصور بنية الأنسجة.
4. استخدم مجهر مضان لفحص أقسام Cy5.5 (إثارة 683 نانومتر / انبعاث 703 نانومتر) ، مما يشير إلى توصيل الأدوية النانوية. تأكد من أن الإشارة ليست في الخلفية باستخدام عينة تحكم سلبية (نسيج من غير محقون).

11. التحقق من صحة توصيل الأدوية النانوية عن طريق التحليل الطيفي للانبعاث البصري للبلازما المقترن بالحث (ICP-OES)

1. انقل العينات المخزنة عند -80 درجة مئوية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل واحتضانها في فرن مع إزالة الغطاء عند 37 درجة مئوية حتى يجف.
   ملاحظة: استغرقت هذه العملية 24 ساعة لعينات ورم خبيث MDA-MB-231 ولكنها قد تستغرق عدة أيام اعتمادا على حجم العينة ومحتواها الرطوبي.
2. سجل الوزن الجاف باستخدام الميزان.
3. أضف 2 مل من 70٪ تتبع HNO₃ إلى الوعاء وهضم العينة بالميكروويف. المعلمات المستخدمة في هذه الدراسة هي كما يلي: الطاقة = 1030 - 1800 واط ، وقت المنحدر = 20:00 - 25:00 ، وقت الانتظار = 15:00 ، درجة الحرارة = 200 درجة مئوية ، التبريد = 30 دقيقة.
   تنبيه: توخي الحذر عند العمل مع حمض النيتريك لأنه والأبخرة المتولدة عند تسخينه شديدة التآكل. يجب أن يكتمل العمل في مكان جيد التهوية مع معدات الحماية الشخصية الكاملة ، مثل معطف المختبر والنظارات الواقية / واقي الوجه والقفازات المتوافقة مع العمل الحمضي. تقلل الأحجام الصغيرة والتبريد المطول المستخدم هنا من المخاطر إلى حد ما ، ولكن يجب توخي الحذر دائما.
4. نقل العينات المهضومة إلى أنابيب مخروطية خالية من المعادن. ثم انقل 300 ميكرولتر إلى أنبوب جديد. خفف إلى 10 مل باستخدام 9.7 مل من الماء عالي النقاء ، مما ينتج عنه تركيز HNO₃ بنسبة 3٪ (حجم / حجم).
5. قم بإعداد معايير الحديد الفردية بتركيزات 1000 و 100 و 10 و 1 و 0.1 و 0 ميكروغرام من الحديد / مل في 3٪ HNO₃ (v / v) وماء عالي النقاء. تحضير معيار داخلي فردي للعنصر Y بتركيز 1 ميكروغرام / مل في 3٪ HNO₃ (حجم / حجم) في ماء عالي النقاء.
6. تحليل العينات باستخدام برنامج المقارنات الدولية - OES. لكل من الوضعين المحوري والشعاعي ، حدد خطوط البث التالية لتحليل محتوى الحديد. الحديد (234.350 نانومتر) ، الحديد (238.204 نانومتر) ، الحديد (259.940 نانومتر) ، و Y (371.029 نانومتر) المستخدمة للتوحيد القياسي الداخلي.
7. تطبيع النتائج لكمية العينة المستخدمة في المدخلات لحساب ميكروغرام من الحديد / غرام من الأنسجة.

النتائج

في دراساتنا العلاجية السابقة في الجسم الحي ، عالجنا الفئران بجرعة واحدة من الأدوية النانوية (10 مجم من عقار الحديد النانوي / كجم من وزن جسم الفأر) أسبوعيا لعدة أسابيع^3،7،8. في هذا العرض ، سعينا إلى تحديد ما إذا كان يمكن...

Discussion

الجسيمات النانوية لديها إمكانات كبيرة لعلاج السرطان. هنا ، أظهرنا أن حامل MNP المترافق Cy5.5 يمكن أن يصل إلى الأنسجة السرطانية لتوصيل قليل النوكليوتيدات العلاجية في نموذج الفئران لسرطان الثدي النقيلي. توفر القدرة على إدارة الدواء النانوي بشكل منهجي مع الاستمرار في تحقيق ت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 5800 ICP-OES	Agilent	5800 ICP-OES	For ICP-OES
Ammonium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	458680025	For nanodrug synthesis
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	For tumor resection
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	For tumor resection
Crile Hemostats - Straight	F.S.T.	13004-14	For tumor resection
Cy5.5-NHS ester	Abcam	ab146455	For nanodrug synthesis
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	For cell culture of MDA-MB-231
Eclipse 50i Clinical Microscope	Nikon	50i-B	For imaging of cryosections
Epichlorohydrin	Thermo Fisher Scientific Inc	117780250	For nanodrug synthesis
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	For tumor resection and metastasis dissection
Fe standard	Inorganic Ventures	CGFE1-500ML	For ICP-OES
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	For cell culture of MDA-MB-231
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	For tumor resection and metastasis dissection
Flask (T-75)	Corning	430641U	For cell culture of MDA-MB-231
HNO3 nitric acid (70%, trace metal grade)	Fisher Chemical	A509P212	For ICP-OES
Insulin syringe 1 CC 29 G x 1/2"	Becton, Dickinson	324704	For tumor implant
Isoflurane	Covetrus	11695067772	For mouse anesthetization
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	For mouse anesthetization
Isopropyl alcohol (70%) wipe	Cardinal	MW-APL	For tumor resection
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	For bioluminescence imaging
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	For bioluminescence imaging
Ketofen (ketoprofen)	Zoetis	10004031	For tumor resection
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
MARS 6 microwave digestion system	CEM	MARS 6	For ICP-OES
Matrigel, growth factor-reduced	Corning	354230	For tumor implant of MDA-MB-231
MDA-MB-231-luc-D3H2LN	PerkinElmer/Revvity	119369	For mouse model of spontaneous metastasis
Metal-free polypropylene 15 mL conical tubes	Labcon	31343450019	For ICP-OES
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	DOT Scientific	RN1700-GMT	For metastasis sample collection
N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP)	Thermo Fisher Scientific Inc	21857	For nanodrug synthesis
PBS	Gibco	14190-144	For cell culture and tumor implant of MDA-MB-231
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture of MDA-MB-231
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	For tumor resection
Sodium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	3728-70	For nanodrug synthesis
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	For metastasis sample collection
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	For metastasis sample collection
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific Inc	T2556	For nanodrug synthesis
Trypsin, 0.25%	Gibco	25200-056	For cell culture of MDA-MB-231
Vicryl PLUS (Antibacterial) violet 27" RB-1 taper	Ethicon	VCP303H	For tumor resection