Murin Meme Kanseri Metastazlarında Nanoilaç Birikiminin İzlenmesi

Özet

Burada, onkojenik nükleik asitlerin terapötik susturulması için klinik olarak uygulanabilir bir yaklaşım sağlayarak, RNA oligomerlerini taşıyan manyetik demir oksit nanopartiküllerinin hayvan modellerinde metastatik meme kanserine in vivo olarak verilmesi için protokolü açıklıyoruz.

Özet

Metastatik meme kanseri, çok sınırlı tedavi seçenekleri olan ve yeni terapötik stratejiler gerektiren yıkıcı bir hastalıktır. Onkojenik miRNA'ların meme kanserinin metastatik potansiyeli ile ilişkili olduğu gösterilmiştir ve tümör hücresi göçü, invazyonu ve canlılığı ile ilişkilidir. Bununla birlikte, inhibitör bir RNA molekülünü ilgilenilen dokuya iletmek zor olabilir. Bu zorluğun üstesinden gelmek ve tümörlere aktif antisens oligonükleotidler sağlamak için, bir dağıtım platformu olarak manyetik demir oksit nanopartikülleri kullandık. Bu nanopartiküller, iltihaplanma veya kanser bölgeleri gibi vasküler geçirgenliği artmış dokuları hedefler. Bu nanopartiküllerin iletimi, manyetik özellikleri nedeniyle manyetik rezonans görüntüleme (MRI) ile in vivo olarak izlenebilir. Bu terapötik yaklaşımın kliniğe tercümesi, bu ilgili görüntüleme modalitesi ile uyumluluğu nedeniyle daha erişilebilir olacaktır. Ayrıca, bağıntılı optik görüntüleme ve floresan mikroskobu için Cy5.5 yakın kızılötesi optik boya gibi diğer görüntüleme raportörleri ile de etiketlenebilirler. Burada, Cy5.5 ile etiketlenmiş ve intravenöz olarak uygulanan onkojenik miRNA-10b'yi (MN-anti-miR10b veya "nano ilaç" olarak adlandırılır) hedefleyen terapötik oligomerlere konjuge edilmiş nanopartiküllerin metastatik bölgelerde biriktiğini ve metastatik meme kanserinin terapötik müdahalesi için bir olasılık açtığını gösteriyoruz.

Giriş

Meme kanserinin tedavisindeki birçok ilerlemeye rağmen, metastatik hastalık için klinik seçenekler sınırlı kalmaktadır. Hastalar genellikle östrojen veya HER2 gibi primer tümörde tanımlanan sürücülere karşı hedeflenen tedaviler alırlar, ancak bu sürücüler metastazlarda her zaman korunmaz ve bu da tedaviyi etkisiz hale getirir¹. Kemoterapi gibi diğer sistemik tedaviler spesifik değildir ve yan etkileri ile bilinir. Metastatik meme kanserinin tedavisi için etkili seçenekler geliştirmek için, kanser hücrelerinin uzak bölgelere yayılmasına ve kolonize olmasına izin veren biyolojik itici güçleri göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu itici güçlerden biri, meme kanseri hücresi canlılığı, istilası ve göçünde rol oynayan onkojenik bir mikroRNA olan miR-10b'dir ve aksi takdirde metastatik olmayan meme kanseri hücrelerinde metastatik potansiyel sağlamak için yeterli olduğu gösterilmiştir ^2,3. Daha da önemlisi, miR-10b, eşleşen primer tümörlere 4 kıyasla metastazlarda daha yüksek seviyelerde eksprese edilir^ve bu da onu mevcut metastazların tedavisi için umut verici bir hedef haline getirir.

miR-10b gibi miRNA'lar metastatik hastalık için terapötik hedefler olarak büyük potansiyele sahip olsa da, miRNA susturma için terapötik olarak uygulanabilir yöntemlerin tasarımı benzersiz zorluklar sunar. Tamamlayıcı miRNA dizilerini bağlayan antisens oligonükleotidler (ASO'lar) genellikle lipofeksiyon kullanılarak in vitro hücrelere aktarılır, ancak doğal kararsızlık, nükleazlar tarafından tahrip olma riski, kısa kan yarılanma ömrü ve yük-yük itmesi nedeniyle hücrelere girememe nedeniyle in vivo olarak tümör hücrelerine kolayca ulaşamaz⁵. Bu zorluklarla mücadele etmek için, dekstran kaplı manyetik demir oksit nanopartikülleri (MNP^{) 6} kullanarak biyomoleküller için klinik olarak uygulanabilir bir taşıyıcı geliştirdik. Nanopartikül üzerindeki amin grupları, oligonükleotidlerin, floresan boyaların (örneğin, Cy5.5) konjugasyonuna ve hedefleme kısımlarına izin verir. Ek olarak, demir oksit çekirdek, manyetik rezonans görüntüleme (MRI) kullanılarak araç teslimatının in vivo olarak izlenmesine olanak tanır. Şekil 1^7'de gösterilen MN-anti-miR10b olarak adlandırılan bir "nano ilaç" oluşturmak için anti-miR-10b kilitli nükleik asit ASO ve Cy5.5'i MNP'ye konjuge ettik.

Önceki çalışmalarımızda, nano ilacın miR-10b'nin aşağı regülasyonuna etkili bir şekilde neden olduğunu ve in vitro^7'de üçlü negatif meme kanseri hücrelerinin göçünü ve istilasını inhibe ettiğini gösterdik. Metastatik meme kanserinin murin modellerinde, nano ilacın intravenöz olarak verilmesi lenf nodu metastazlarının gelişmesini engelledi veya lenf nodu metastazı oluşumundan sonra uygulanırsa büyümelerini durdurdu⁷. Özellikle, nano ilacın kanser dokularında kolayca biriktiği gözlendi. Nano ilaç metastazları kendi başına yok etmese de, sonraki çalışmalarda, adjuvan doksorubisin ile kombinasyon tedavisinin hem immün sistemi baskılanmış hem de immün yetmezliği olan fare modellerinde iyileştirici olduğunu gösterdik ^3,8. Nano ilaç tarafından miR-10b inhibisyonunun etkileri, kedi meme karsinomunda^{da görülmüştür 9}.

Meme kanserini etkili bir şekilde tedavi etmek için, ilacın ilgili dokularda biriktiğini göstermek zorunludur. Burada, metastatik meme kanserinin murin modellerinde çoklu modaliteler kullanarak terapötik anti-miR-10b ASO'ları kanser dokularına vermek için kullanılan manyetik nanopartikül taşıyıcının birikimini göstermek için bir protokol sunuyoruz.

Protokol

Michigan Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC), hayvan deneklerle ilgili tüm prosedürleri onaylamıştır. Hesaplama değerleri Tablo 1'de özetlenmiştir.

1. MN-anti-miR10b sentezinin temel adımları

NOT: MN-anti-miR10b sentezinin detayları daha önce ^9,10,11'de açıklanmıştır.

1. Manyetik nanoparçacık (MN) çekirdeğini birlikte çökeltme yöntemiyle hazırlayın.
2. Sodyum hidroksit, epiklorohidrin ve amonyum hidroksit kullanarak hazırlanan nanopartikülleri çapraz bağlayın ve aminat edin.
3. Floresan görüntüleme ve mikroskopi sağlamak için MN-Cy5.5'i elde etmek için heterobifonksiyonel çapraz bağlayıcı N-süksinimidil 3- [2-piridilditio] -propiyonat (SPDP) yoluyla bir Cy5.5-NHS esterini MN'ye konjugasyon.
4. Anti-miR-10b kilitli nükleik asidi %3 tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) ile aktive edin ve MN-anti-miR10b'yi elde etmek için MN-Cy5.5 ile konjuge edin.
5. Demir içeriğini (demir tahlili ile), nanopartikül başına Cy5.5 moleküllerinin sayısını (spektrofotometri ile) ve konjuge LNA miktarını (agaroz jel elektroforezi ile) belirlemek için konjugatın karakterizasyonunu gerçekleştirin.

2. Çalışma hayvanları edinin

1. Deney gruplarını ve grup başına düşen hayvan sayısını planlamak için çalışmayı önceden ana hatlarıyla belirtin. Kafes başına 5 adede kadar fare barındırın. Tedavi sırasında 5 fareden oluşan birden fazla kafes kullanılıyorsa, karıştırıcı bir değişken olarak kafesi çıkarmak için her kafesin içinde kontrol ve deney farelerinin bulunduğundan emin olun.
2. 6-7 haftalıkken fareler edinin. Ortotopik tümörlerin indüksiyonundan önce barınma koşullarına en az 1 hafta alışmaya izin verin.
   NOT: Spontan meme kanseri metastazı için MDA-MB-231 (insan kaynaklı hücre hattı) modelini kullanan prosedürler aşağıda açıklanmıştır. Bu model için yaygın olarak atimik çıplak fareler (Foxn1^nu/Foxn1^nu) kullanılır. Diğer uyumlu immün sistemi baskılanmış fare suşları kullanılabilir ve prosedürler ayrıca immünokompetan farelerdeki allogreft modellerine de uygulanabilir (ör., BALB / c farelerinde 4T1 meme kanseri hücreleri).

3. Kültür hücreleri

1. Lusiferaz eksprese eden MDA-MB-231 hücrelerini büyütmek için Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin (tam büyüme ortamı) ile destekleyin (ör., MDA-MB-231-luc-D3H2LN). Hücreleri aseptik koşullar altında, %5 CO₂ ve %95 nem ile 37 °C'de, genellikle bir T75 şişesinde büyütün. Dondurulursa, hücreleri çözün ve tümör implantasyonundan en az bir kez geçin. Geçiş numarasını şişeye kaydedin.
   NOT: Bu çalışmada, daha önce donmuş 1 × 10⁶ hücreli bir şişe, kullanımdan önce iki kez çözüldü ve geçirildi.
   1. Geçiş için,% <80'lik bir birleşmede hücreleri tripsinize etmek için 37 ° C'de 3 dakika boyunca% 0.25 tripsin uygulayın. Tripsini nötralize etmek için 4 kat hacimde tam büyüme ortamı ekleyin.
   2. Süspansiyonu konik bir tüpte 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşalttıktan sonra hücre peletini 5 mL tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Hücrelerin bir kısmını yeni bir şişeye alın ve yeni şişe hacmine bağlı olarak ek tam büyüme ortamı ekleyin. Yeni şişedeki geçiş numarasını güncelleyin.
2. Çalışmalarda genetik sürüklenmeyi en aza indirmek için 10 geçişten sonra yeni hücreleri çözün.

4. Ortotopik tümörlerin indüksiyonu için hücrelerin hazırlanması

1. Matris ekstraktının sıvılaşmasını sağlamak için donmuş Matrigel'i (bazal membran matris özütü) hazırlamadan önce 24 saat boyunca 4 °C'de yerleştirin.
2. Çalışma için gerekli olan hücre konsantrasyonunu ve hacmini belirleyin. Fareleri, 1 kısım soğutulmuş PBS ve 1 kısım matris ekstraktından oluşan 50 μL'lik bir hacimde fare başına 1 × 10⁶ hücre ile implante edin.
3. Tripsinlenmiş hücreleri adım 3.1.2'de açıklandığı gibi peletleyin. Hücreleri yıkamak için hücre peletini en az 10 mL PBS'de yeniden süspanse edin, ardından 5 dakika boyunca 200 × g'da bir kez daha santrifüjleyin. Peleti 500 μL soğutulmuş PBS'de (hücre stoğu) yeniden süspanse edin.
4. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücreler yüksek konsantrasyonda olacağından, doğru ölçümler alınana kadar seyreltme faktörünü takip ederek gerektiği gibi küçük bir alikot (örneğin 10 μL) seyreltin.
5. Gerekli toplam hücre sayısını 40 × 10⁶ hücre / mL'ye seyreltin, ardından 50 μL'de 1 × 10⁶ hücrelik bir nihai konsantrasyon elde etmek için eşit hacimde soğutulmuş matris özütü ekleyin. İmplantasyondan önce ekstraktın katılaşmasını önlemek için buz üzerinde tutun.
   NOT: Hücre konsantrasyonları Tablo 1'de özetlenmiştir.

5. Ortotopik tümörlerin indüksiyonu

1. Bir fareyi% 2 izofluran kullanarak uyuşturun ve daha sonra bir ısıtma yastığı üzerinde% 0-3 izofluran kullanarak, anestezi cerrahi düzlemini koruyarak bir burun konisine aktarın. Kornea refleksi ve / veya ayak parmağı sıkışma tepkisi eksikliği ile cerrahi anestezi düzlemini onaylayın. Gözlere oftalmik merhem uygulayarak kornea kurumasına karşı koruyun.
2. Enjeksiyon bölgesinin yakınındaki cildi %70 alkollü mendille temizleyin ve alkolün kuruması için birkaç saniye bekleyin. Primer tümör ile en yaygın metastaz bölgeleri (akciğer ve aksiller lenf nodu) arasındaki biyolüminesans görüntüleme sinyallerinin üst üste binme riskini azaltmak için meme bezi # 4'ü indükleyin.
   NOT: Meme bezi numaralandırması daha önce^{tanımlanmıştır 12}. Kısaca, sırtüstü pozisyonda ve başı yukarı dönük bir fare, enjektörün sağ tarafında (farenin solunda) başa en yakın olandan başlayarak (servikal - bez 1) en kaudal olana (kasık - bez 5) inen 1'den 5'e kadar olan bezlere sahip olacaktır. 6 ila 10 arasındaki bezler, hayvanın karşı tarafında benzer şekilde yönlendirilir.
3. Hücreleri yeniden süspanse etmek için hücre stoğunu yukarı ve aşağı pipetleyin. Buz gibi soğuk hücre süspansiyonunun 50 μL'sini 29 G'lik bir iğne ile bir insülin şırıngasına çekin ve hücreleri hemen enjekte edin. Hemen enjekte edemiyorsanız şırıngayı buz üzerinde tutun.
   NOT: Hücrelerin çökmesini önlemek için her hücre çizimi arasında yukarı ve aşağı pipetleyin.
4. Eğimi, istenen meme bezinin meme ucunun hemen altına, o konumdaki farenin gövdesine paralel olarak yerleştirin ve hücreleri sabit, yavaş bir hızda enjekte edin. Matrigel'in katılaşmasını sağlamak ve sızıntıyı önlemek için enjeksiyonun tamamlanmasından sonra iğneyi en az 5 saniye cilt içinde bırakın.
5. Fareyi iyileşme için bir ısıtma pedi üzerindeki temiz bir kafese taşıyın ve tamamen yürüyene ve sternal yaslanmayı koruyabilene kadar denetleyin. Fareyi gözetimsiz bırakmayın. Fareyi ancak iyileştikten sonra diğer farelerle birlikte kafesine geri koyun.

6. Biyolüminesans görüntüleme (BLI) ile tümör büyümesinin ve metastaz gelişiminin izlenmesi

NOT: Burada kullanılan MDA-MB-231 hücreleri lusiferazı eksprese ettiğinden, lusiferin substratının farelere enjeksiyonu, görüntüleme sistemi tarayıcısı tarafından algılanan bir optik sinyal üretecektir. Bu modelde, tümör indüksiyonundan 5-7 hafta sonra metastaz beklenebilir. Metastazların görüntülendiği anın tam olarak belirlenmesinin önemine bağlı olarak, farelerin haftada 1-3 kez görüntülenmesi önerilir.

1. Lusiferin uygularken farenin yaralanma riskini en aza indirmek için% 2 izofluran kullanarak fareleri uyuşturun. Gözlere oftalmik merhem uygulayarak kornea kurumasına karşı koruyun.
2. Her fareye intraperitoneal olarak 150 mg / kg vücut ağırlığı lusiferin enjekte edin ve farelerin lusiferini uyandırmasına ve metabolize etmesine izin vermek için fareleri bir ısıtma pedi üzerinde kafeslerine geri koyun. Tamamen ayaktan olana ve sternal yaslanmayı koruyabilene kadar fareleri denetleyin ve gözetimsiz bırakmayın.
   NOT: Dozaj hesaplamaları için kullanılan değerler Tablo 1'de özetlenmiştir.
3. Lusiferin ile enjeksiyondan yaklaşık 10 dakika sonra başlayarak görüntüleme sistemi tarayıcısını kullanarak fareleri görüntüleyin ve gerektiğinde IVIS'e transfer için zaman tanımak için fareleri yeniden uyuşturun.
   1. En fazla 5 fareyi sırtüstü pozisyonda, tüm vücutlarının görüş alanı kılavuzu işaretlerine dahil edildiğinden ve mümkün olduğunca düz yönlendirildiğinden emin olarak görüntüleyin. Aksiller lenf düğümlerinin daha iyi görüntülenmesi için kollarını sabitlemek için şeffaf bant kullanın. Aynı anda birkaç fareyi görüntülüyorsanız, sinyallerin diğer farelere yayılmasını önlemek için fareleri ayırmak için manifold bölücüler kullanın. Bölücüler mevcut değilse, yerlerine ışık emici kağıt şeritleri kullanın (örn. kalın, siyah kart stoğu).
      NOT: Lusiferin metabolizması oranları fare ve hücre hattı modellerine göre değişir ve enjeksiyondan 10 dakika sonra başlayan görüntü alımı en güçlü sinyali vermeyebilir. Yeni bir çalışmanın başlangıcında, en yüksek sinyal yoğunluğunun zamanlamasını belirlemek için farklı zaman noktalarında edinimlerin yapılması önerilir.
   2. Görüntüleme sistemi yazılımını BLI için aşağıdaki ayarlarla görüntü alımı için hazırlayın: Pozlama = Otomatik, Gruplama = Orta, FStop = 1, Uyarma = Blok, Emisyon = Açık, FOV = D, Yükseklik = 1,50.
   3. Genel olarak, primer tümör sinyalleri, Pozlama = Otomatik ayarını kullanarak yüzeysel konumları nedeniyle nispeten güçlü bir sinyal üretecektir. Metastazları izliyorsanız, birincil tümörü dikkatlice örtmek için siyah elektrik bandı kullanın ve varsa zayıf sinyaller almak için Pozlama = 300 s (veya daha fazla) olarak manuel olarak ayarlayın.
      NOT: Bu modelde, alt eşik 5 × 10³ parlaklık olarak ayarlandığında, birden fazla görüntüleme seansında görülebilen primer tümörden ayrı bir sinyal metastaz göstergesi olarak kabul edilir.

7. Primer tümörlerin rezeksiyonu

NOT: Primer tümörlerin rezeksiyonu, metastazlarda uzunlamasına (örn., terapötik) çalışmalar için önemlidir; Aksi takdirde, fareler sınırsız primer tümör büyümesi ile ilgili morbiditeye yenik düşebilir. Rezeksiyon zamanını belirlerken primer tümör boyutunu (rezeksiyonda kan kaybı riski) ve ülserasyonu (enfeksiyon riski) göz önünde bulundurun.

1. Başarılı primer tümör rezeksiyonunu test etmek için BLI sinyalinin olmadığı göz önüne alındığında, bölüm 6'da açıklandığı gibi ameliyat öncesi görüntüleme yapın ve ameliyat sonrası sinyal olmadığını onaylayın. Taze uygulanan lusiferin kullanarak önümüzdeki 1-2 gün içinde başarılı rezeksiyonu onaylayın.
   NOT: Hayvana gereksiz stresi önlemek için lusiferinin hemen yeniden uygulanması önerilmez. Primer tümör rezeksiyonundan önce enjekte edilen lusiferin, rezeksiyon tamamlanmadıysa sinyali tespit etmek için yeterli olmalıdır.
2. Fareyi% 2 izofluran kullanarak uyuşturun ve daha sonra bir ısıtma yastığı üzerinde% 0-3 izofluran kullanarak% 0-3 anestezi cerrahi düzlemini koruyarak bir burun konisine aktarın. Kornea refleksi ve / veya ayak parmağı sıkışma tepkisi eksikliği ile cerrahi anestezi düzlemini onaylayın.
3. Gözlere oftalmik merhem uygulayarak kornea kurumasına karşı koruyun
4. İşlem için analjezi olarak deri altına 5 mg / kg ketoprofen enjekte edin.
   NOT: Dozaj hesaplamaları için kullanılan değerler Tablo 1'de özetlenmiştir.
5. % 70 alkol ve betadin 3x fırçalarını değiştirerek cerrahi alanı hazırlayın. Devam etmeden önce son betadin fırçalamasının kurumasını bekleyin.
6. Primer tümörün üzerindeki cildi dikey olarak (rostral-kaudal) açmak için steril cerrahi makas kullanın. Ülserli cilt durumunda, primer tümörü geride bırakmamak ve ülserli cildi tamamen çıkarmak için ülserasyonun yan tarafına açılmaya başlayın.
7. Kapsüllenmiş tümörün etrafındaki bağ dokusunu dikkatlice incelemek için makas ve forseps kullanmaya devam edin, böylece kitle deriden ve altta yatan vücut dokularından tamamen çıkarılabilir, çünkü kalan herhangi bir tümör yeniden büyüyebilir.
8. Varsa, pamuk uçlu bir aplikatör ile basınç uygulayarak kanamayı kontrol edin.
9. Cerrahi açıklığı 5-0 Vicryl sütür ile kapatın.
   NOT: Kesintili dikiş, fareler cerrahi bölgeyi rahatsız etmeye eğilimli olduğundan daha iyi yara açıklığı ile sonuçlanabilir.
10. Hayvanın tamamen yürüyene kadar bir ısınma pedi üzerinde temiz bir kafeste iyileşmesine izin verin. Hayvanı kafese geri döndürürken nemli yiyecekleri ev kafesinin altına yerleştirin.
11. Ameliyattan sonra en az 2 gün boyunca günde bir kez deri altına 5 mg / kg ketoprofen enjekte edin. Bu zamanlarda yara sağlığını kontrol edin.

8. Nano ilacın teslimi

1. Nano ilaç dozu vücut ağırlığına dayandığı için fareleri tartın.
2. Fareyi% 2 izofluran kullanarak uyuşturun ve daha sonra bir ısıtma yastığı üzerinde% 0-3 izofluran kullanarak% 0-3 anestezi cerrahi düzlemini koruyarak bir burun konisine aktarın. Kornea refleksi ve / veya ayak parmağı sıkışma tepkisi eksikliği ile cerrahi anestezi düzlemini onaylayın.
   NOT: Alternatif olarak, nano ilaç kısıtlanmış bir uyanık fareye uygulanabilir. Sonraki tüm adımlar aynı olacaktır.
3. 10 mg Fe nano ilaç/kg fare vücut ağırlığı ile 29 G iğneli bir insülin şırıngası hazırlayın.
4. Kuyruk damarlarını genişletmek için hayvanın kuyruğunu 30 saniye ılık suya (30-35 °C) batırın.
5. Kuyruktaki fazla suyu silin ve enjeksiyon bölgesini %70 alkollü mendille temizleyin.
6. İğne eğimini kuyruğun yaklaşık yarısına kadar yanal kuyruk damarına yerleştirin ve iğneye kan geri tepmesi ile yerleştirmeyi doğrulamak için pistonu hafifçe geri çekin. Gerekirse, başarılı bir yerleştirme elde etmek için iğneyi hafifçe ileri veya daha yüzeysel bir derinliğe hareket ettirin.
7. Başarılı bir şekilde yerleştirildikten sonra, nano ilacı 40 μL'lik bir enjeksiyon için yaklaşık 5-10 sn gibi yavaş bir hızda sabit bir şekilde enjekte edin. Enjeksiyon bölgesinin yakınında kuyruğun derisi altında çözelti birikmesi eksikliği ve damarın koyulaşması (koyu nanopartikül çözeltisinden) ile başarılı enjeksiyonu onaylayın.
   NOT: Dozaj hesaplamaları için kullanılan değerler Tablo 1'de özetlenmiştir. Topaklanmış nanopartikül formülasyonları akciğere embolize olabilir. Enjeksiyondan kısa bir süre sonra solunum sıkıntısı görülürse, fare üzerinde nazikçe göğüs kompresyonları yapın. Acil eylem her zaman hayvanın bu olası sorundan başarılı bir şekilde kurtarılmasıyla sonuçlanır.
8. Enjeksiyon bölgesi üzerinde gazlı bezle baskı uygulayın ve kanama durana kadar yaklaşık 30 saniye boyunca basıncı koruyarak iğneyi çıkarın.
9. Hayvanın tamamen yürüyene kadar bir ısınma pedi üzerinde temiz bir kafeste iyileşmesine izin verin.

9. Analiz için metastazların toplanması

1. Fareleri bölüm 6'da açıklandığı gibi BLI ile görüntüleyin.
   NOT: Bu çalışmada 5 × 10³ parlaklık metastaz göstergesi olarak kabul edilir ve genellikle 5-7 haftada gözlenir. Fareler arasında metastaz yapma süresinde hafif bir değişiklik beklenebilir.
2. Görüntülemeden hemen sonra, fareleri ağır (% 5) izofluran altında servikal çıkık ile feda edin. Diseksiyondan önce, kornea refleksi eksikliği ve / veya ayak parmağı sıkışma tepkisi ile ölümü onaylayın.
3. Metastazları dikkatlice toplayın. Lenf nodu metastazları genişlemiş, kapsüllenmiş bir kitle olarak ortaya çıkar. Akciğer metastazları genellikle akciğer parankimi boyunca dağılacaktır; Bu nedenle, tüm akciğeri toplayın.
4. Toplanan dokuları bir Petri kabına yerleştirin ve biyolüminesansı (lusiferaz eksprese eden kanser hücrelerinin varlığını gösterir) ve floresanı (nanoilaç birikimini gösterir) doğrulamak için görüntüleme sistemini kullanarak görüntüleyin. Adım 6.3.2'de açıklandığı gibi aynı BLI edinme ayarlarını kullanın. FLI alım ayarları Pozlama = Otomatik, Binning = Orta, FStop = 1, Uyarma = 675 ve Emisyon = 720 (Cy5.5 boya için varsayılan program), Lamba Seviyesi = Yüksek, FOV = D, Yükseklik 1.50'dir. Toplanmaya değer kalan kanser dokusu olup olmadığını belirlemek için fare karkasını görüntüleyin.
5. Kanser dokularını PBS'de durulayın.
6. Mikroskopi veya qRT-PCR için doku toplamak için OCT'ye gömün ve işlemeye hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.
7. Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma optik emisyon spektroskopisi (ICP-OES) için doku toplamak için, 1,7 mL'lik boş bir tüp kullanarak bir tartıya darasını alın, dokuyu tüpe yerleştirin ve ağırlığını kaydedin. Dokuyu dondurun ve işlemeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

10. Floresan mikroskobu ile nanoilaç dağıtımının doğrulanması

1. OCT ile gömülü taze donmuş numuneleri 10 μm kalınlığında mikroskopi slaytlarına kriyoseksiyon yapın. Hazne ve numune tutucu sıcaklıklarını doku tipine göre ayarlayın. -20 °C ile -15 °C arasındaki ayarlar hem akciğer hem de lenf dokusu için uygundur.
2. Bölümleri veya tüm slaytları 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisine batırarak doku bölümlerini slaytlara sabitleyin. PBS ile dikkatlice durulayın.
3. Lamelleri kızakların üzerine monte edin. Doku mimarisinin görselleştirilmesi için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir ortam kullanın.
4. Nanoilaç dağıtımını gösteren Cy5.5 (uyarma 683 nm / emisyon 703 nm) bölümlerini incelemek için bir floresan mikroskobu kullanın. Negatif bir kontrol numunesi (enjekte edilmemiş bir hayvandan alınan doku) kullanarak sinyalin arka plan olmadığını onaylayın.

11. Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma optik emisyon spektroskopisi (ICP-OES) ile nanoilaç dağıtımının doğrulanması

1. -80 °C'de saklanan numuneleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve kuruması için 37 °C'de kapağı çıkarılmış bir fırında inkübe edin.
   NOT: Bu işlem MDA-MB-231 metastaz numuneleri için 24 saat sürmüştür ancak numunenin boyutuna ve nem içeriğine bağlı olarak birkaç gün sürebilir.
2. Bir terazi kullanarak kuru ağırlığı kaydedin.
3. Kaba 2 mL %70 eser HNO₃ ekleyin ve numuneyi mikrodalgada sindirin. Bu çalışmada kullanılan parametreler aşağıdaki gibidir: Güç = 1030 - 1800 W, Rampa Süresi = 20:00 - 25:00, Bekleme Süresi = 15:00, Sıcaklık = 200 °C, Soğutma = 30 dk.
   DİKKAT: Nitrik asit ile çalışırken dikkatli olun çünkü nitrik asit ve ısıtırken oluşan dumanlar oldukça aşındırıcıdır. Çalışma, laboratuvar önlüğü, gözlük/yüz siperi ve asitli çalışmayla uyumlu eldivenler gibi tam kişisel koruyucu ekipmanla iyi havalandırılan bir alanda tamamlanmalıdır. Burada kullanılan küçük hacimler ve uzun süreli soğutma riski bir miktar en aza indirir, ancak her zaman dikkatli olunmalıdır.
4. Sindirilmiş numuneleri metal içermeyen konik tüplere aktarın; daha sonra 300 μL'yi yeni bir tüpe aktarın. 9.7 mL ultra saf su kullanarak 10 mL'ye seyreltin, bu da %3'lük bir HNO₃ konsantrasyonu (h/h) ile sonuçlanır.
5. %3 HNO₃ (h/h) ve ultra saf suda 1000, 100, 10, 1, 0.1 ve 0 μg Fe/mL konsantrasyonlarında bireysel element Fe standartlarını hazırlayın. Ultra saf suda% 3 HNO₃ (h / v) içinde 1 μg / mL konsantrasyonda bireysel element Y iç standardını hazırlayın.
6. ICP-OES kullanarak numuneleri analiz edin. Hem eksenel hem de radyal modlar için, demir içeriğinin analizi için aşağıdaki emisyon çizgilerini seçin. Fe (234.350 nm), Fe (238.204 nm), Fe (259.940 nm) ve Y (371.029 nm) iç standardizasyon için kullanılır.
7. μg Fe/g doku hesaplamak için sonuçları girdi için kullanılan numune miktarına göre normalleştirin.

Sonuçlar

Önceki terapötik in vivo çalışmalarımızda, fareleri birkaç hafta boyunca haftada bir doz nano ilaç (10 mg Fe nano ilaç / kg fare vücut ağırlığı) ile tedavi ettik ^3,7,8. Bu gösteri için, 1 hafta sonra, bir doz sonra akciğer metastazlarında nanoilaç birikiminin gözlenip gözlenemeyeceğini belirlemeye çalıştık. Bu çalışmanın sonuçları, gelecekteki boylamsal...

Tartışmalar

Nanopartiküller kanser tedavisi için büyük potansiyele sahiptir. Burada, bir Cy5.5 konjuge MNP taşıyıcısının, metastatik meme kanserinin bir murin modelinde terapötik oligonükleotidler vermek için kanser dokularına ulaşabileceğini gösterdik. Nano ilacın sistemik olarak uygulanabilmesi ve aynı zamanda kanser dokularında önemli bir birikim elde edilmesi, genellikle lokal ve sıklıkla invaziv uygulama gerektiren mevcut birçok ASO uygulama yöntemine göre muazzam avan...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 5800 ICP-OES	Agilent	5800 ICP-OES	For ICP-OES
Ammonium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	458680025	For nanodrug synthesis
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	For tumor resection
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	For tumor resection
Crile Hemostats - Straight	F.S.T.	13004-14	For tumor resection
Cy5.5-NHS ester	Abcam	ab146455	For nanodrug synthesis
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	For cell culture of MDA-MB-231
Eclipse 50i Clinical Microscope	Nikon	50i-B	For imaging of cryosections
Epichlorohydrin	Thermo Fisher Scientific Inc	117780250	For nanodrug synthesis
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	For tumor resection and metastasis dissection
Fe standard	Inorganic Ventures	CGFE1-500ML	For ICP-OES
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	For cell culture of MDA-MB-231
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	For tumor resection and metastasis dissection
Flask (T-75)	Corning	430641U	For cell culture of MDA-MB-231
HNO3 nitric acid (70%, trace metal grade)	Fisher Chemical	A509P212	For ICP-OES
Insulin syringe 1 CC 29 G x 1/2"	Becton, Dickinson	324704	For tumor implant
Isoflurane	Covetrus	11695067772	For mouse anesthetization
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	For mouse anesthetization
Isopropyl alcohol (70%) wipe	Cardinal	MW-APL	For tumor resection
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	For bioluminescence imaging
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	For bioluminescence imaging
Ketofen (ketoprofen)	Zoetis	10004031	For tumor resection
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
MARS 6 microwave digestion system	CEM	MARS 6	For ICP-OES
Matrigel, growth factor-reduced	Corning	354230	For tumor implant of MDA-MB-231
MDA-MB-231-luc-D3H2LN	PerkinElmer/Revvity	119369	For mouse model of spontaneous metastasis
Metal-free polypropylene 15 mL conical tubes	Labcon	31343450019	For ICP-OES
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	DOT Scientific	RN1700-GMT	For metastasis sample collection
N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP)	Thermo Fisher Scientific Inc	21857	For nanodrug synthesis
PBS	Gibco	14190-144	For cell culture and tumor implant of MDA-MB-231
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture of MDA-MB-231
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	For tumor resection
Sodium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	3728-70	For nanodrug synthesis
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	For metastasis sample collection
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	For metastasis sample collection
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific Inc	T2556	For nanodrug synthesis
Trypsin, 0.25%	Gibco	25200-056	For cell culture of MDA-MB-231
Vicryl PLUS (Antibacterial) violet 27" RB-1 taper	Ethicon	VCP303H	For tumor resection