Surveillance de l’accumulation de nanomédicaments dans les métastases du cancer du sein murin

Résumé

Ici, nous décrivons le protocole d’administration in vivo de nanoparticules d’oxyde de fer magnétiques portant des oligomères d’ARN au cancer du sein métastatique dans des modèles animaux, fournissant une approche cliniquement viable pour le silençage thérapeutique des acides nucléiques oncogènes.

Résumé

Le cancer du sein métastatique est une maladie dévastatrice dont les options thérapeutiques sont très limitées, ce qui nécessite de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il a été démontré que les miARN oncogéniques sont associés au potentiel métastatique du cancer du sein et sont impliqués dans la migration, l’invasion et la viabilité des cellules tumorales. Cependant, il peut être difficile de délivrer une molécule d’ARN inhibitrice au tissu d’intérêt. Pour surmonter ce défi et délivrer des oligonucléotides antisens actifs aux tumeurs, nous avons utilisé des nanoparticules d’oxyde de fer magnétiques comme plate-forme d’administration. Ces nanoparticules ciblent les tissus ayant une perméabilité vasculaire accrue, tels que les sites d’inflammation ou de cancer. L’administration de ces nanoparticules peut être surveillée in vivo par imagerie par résonance magnétique (IRM) en raison de leurs propriétés magnétiques. L’application de cette approche thérapeutique en clinique sera plus accessible en raison de sa compatibilité avec cette modalité d’imagerie pertinente. Ils peuvent également être marqués avec d’autres rapporteurs d’imagerie, tels qu’un colorant optique proche infrarouge Cy5.5 pour l’imagerie optique corrélative et la microscopie à fluorescence. Ici, nous démontrons que des nanoparticules marquées avec Cy5.5 et conjuguées à des oligomères thérapeutiques ciblant le miARN-10b oncogénique (appelé MN-anti-miR10b, ou « nanomédicament ») administrées par voie intraveineuse s’accumulent dans des sites métastatiques, ouvrant ainsi la possibilité d’une intervention thérapeutique du cancer du sein métastatique.

Introduction

Malgré de nombreuses avancées dans le traitement du cancer du sein, les options cliniques pour la maladie métastatique restent limitées. Les patients reçoivent généralement des thérapies ciblées contre les moteurs identifiés dans la tumeur primaire, tels que l’œstrogène ou HER2, mais ces moteurs ne sont pas toujours conservés dans les métastases, ce qui rend le traitement inefficace¹. D’autres thérapies systémiques, telles que la chimiothérapie, sont non spécifiques et connues pour leurs effets secondaires. Pour développer des options efficaces pour le traitement du cancer du sein métastatique, il est important de prendre en compte les facteurs biologiques qui permettent aux cellules cancéreuses de se propager et de coloniser des sites distants. L’un de ces facteurs est miR-10b, un microARN oncogène, impliqué dans la viabilité, l’invasion et la migration des cellules cancéreuses du sein, qui s’est avéré suffisant pour conférer un potentiel métastatique dans des cellules cancéreuses du sein autrement non métastatiques ^2,3. Il est important de noter que miR-10b est également exprimé à des niveaux plus élevés dans les métastases par rapport aux tumeurs primaires appariées⁴, ce qui en fait une cible prometteuse pour le traitement des métastases existantes.

Bien que les miARN tels que miR-10b aient un grand potentiel en tant que cibles thérapeutiques pour la maladie métastatique, la conception de méthodes thérapeutiquement viables pour le silençage des miARN présente des défis uniques. Les oligonucléotides antisens (ASOs) qui se lient à leur séquence complémentaire de miARN sont généralement transférés aux cellules in vitro par lipofection, mais ne peuvent pas facilement atteindre les cellules tumorales in vivo en raison de l’instabilité inhérente, du risque de destruction par les nucléases, de la courte demi-vie du sang et de l’incapacité à pénétrer dans les cellules en raison de la répulsion charge-charge⁵. Pour lutter contre ces défis, nous avons développé un support cliniquement applicable pour les biomolécules utilisant des nanoparticules d’oxyde de fer magnétique (MNP)⁶ recouvertes de dextran. Les groupes amines sur la nanoparticule permettent la conjugaison d’oligonucléotides, de colorants fluorescents (par exemple, Cy5.5) et de fractions ciblées. De plus, le noyau d’oxyde de fer permet de surveiller in vivo l’administration du véhicule à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Nous avons conjugué l’acide nucléique verrouillé anti-miR-10b ASO et Cy5.5 à MNP pour créer un « nanomédicament » appelé MN-anti-miR10b, illustré à la figure 1⁷.

Dans nos études précédentes, nous avons montré que le nanomédicament provoque efficacement une régulation négative de miR-10b et inhibe la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du sein triple négatif in vitro⁷. Dans des modèles murins de cancer du sein métastatique, l’administration intraveineuse du nanomédicament a empêché le développement de métastases ganglionnaires ou, s’il était administré après la formation de métastases ganglionnaires, a arrêté leur croissance⁷. Notamment, on a observé que le nanomédicament s’accumule facilement dans les tissus cancéreux. Bien que le nanomédicament n’ait pas éradiqué les métastases par lui-même, dans des études ultérieures, nous avons montré que le traitement combiné avec la doxorubicine adjuvante était curatif dans les modèles de souris immunodéprimées et immunocompétentes ^3,8. Les effets de l’inhibition de miR-10b par le nanomédicament ont également été observés dans le carcinome mammaire félin⁹.

Pour traiter efficacement le cancer du sein, il est impératif de démontrer que le médicament s’accumule dans les tissus d’intérêt. Ici, nous présentons un protocole pour démontrer l’accumulation du transporteur de nanoparticules magnétiques utilisé pour délivrer des ASOs thérapeutiques anti-miR-10b aux tissus cancéreux en utilisant plusieurs modalités dans des modèles murins de cancer du sein métastatique.

Protocole

Le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Michigan (IACUC) a approuvé toutes les procédures impliquant des sujets animaux. Les valeurs utilisées pour les calculs sont résumées dans le tableau 1.

1. Étapes clés de la synthèse de MN-anti-miR10b

REMARQUE : Les détails de la synthèse de MN-anti-miR10b ont été décrits précédemment ^9,10,11.

1. Préparez le noyau de nanoparticules magnétiques (MN) par la méthode de co-précipitation.
2. Réticulez et aminifiez les nanoparticules préparées à l’aide d’hydroxyde de sodium, d’épichlorhydrine et d’hydroxyde d’ammonium.
3. Conjuguez un ester Cy5.5-NHS à MN par l’intermédiaire du réticulant hétérobifonctionnel N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP) pour obtenir MN-Cy5.5 afin de permettre l’imagerie par fluorescence et la microscopie.
4. Activer l’acide nucléique verrouillé anti-miR-10b avec 3 % de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) et le conjuguer à MN-Cy5.5 pour obtenir le MN-anti-miR10b.
5. Effectuer la caractérisation du conjugué pour déterminer la teneur en fer (par dosage du fer), le nombre de molécules Cy5.5 par nanoparticule (par spectrophotométrie) et la quantité de LNA conjugué (par électrophorèse sur gel d’agarose).

2. Acquérir des animaux d’étude

1. Décrivez l’étude à l’avance pour planifier les groupes expérimentaux et le nombre d’animaux par groupe. Abritez jusqu’à 5 souris par cage. Si plusieurs cages de 5 souris sont utilisées pendant le traitement, assurez-vous d’avoir des souris témoins et expérimentales à l’intérieur de chaque cage pour éliminer la cage comme variable confondante.
2. Obtenez des souris à l’âge de 6-7 semaines. Prévoyez au moins 1 semaine d’acclimatation aux conditions de logement avant l’induction de tumeurs orthotopiques.
   REMARQUE : Les procédures utilisant le modèle MDA-MB-231 (lignée cellulaire dérivée de l’homme) de métastases spontanées du cancer du sein sont décrites ci-dessous. Pour ce modèle, des souris nues athymiques (Foxn1^nu/Foxn1^nu) sont couramment utilisées. D’autres souches de souris immunodéprimées compatibles peuvent être utilisées, et les procédures sont également applicables aux modèles d’allogreffe chez les souris immunocompétentes (par exemple, les cellules cancéreuses du sein 4T1 chez les souris BALB/c).

3. Cellules de culture

1. Complétez le milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (milieu de croissance complet) pour cultiver des cellules MDA-MB-231 exprimant la luciférase (p. ex., MDA-MB-231-luc-D3H2LN). Cultivez les cellules dans des conditions aseptiques à 37 °C avec 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité, généralement dans une fiole T75. S’ils sont congelés, décongeler les cellules et le passage au moins une fois avant l’implantation de la tumeur. Inscrire le numéro de passage sur la fiole.
   REMARQUE : Dans cette étude, un flacon préalablement congelé de 1 × 10⁶ cellules a été décongelé et passé deux fois avant utilisation.
   1. Pour le passage, appliquez de la trypsine à 0,25 % pendant 3 min à 37 °C pour trypsiniser les cellules à une confluence de <80 %. Ajouter 4x volume de milieu de croissance complet pour neutraliser la trypsine.
   2. Centrifuger la suspension à 200 × g pendant 5 min dans un tube conique. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de milieu de croissance complet après décantation du surnageant. Placez une partie des cellules dans une nouvelle fiole et ajoutez un milieu de croissance complet supplémentaire en fonction du volume de la nouvelle fiole. Mettre à jour le numéro de passage sur la nouvelle fiole.
2. Décongelez les nouvelles cellules après 10 passages pour minimiser la dérive génétique entre les études.

4. Préparation des cellules pour l’induction de tumeurs orthotopiques

1. Placez le Matrigel congelé (extrait de matrice de membrane basale) à 4 °C pendant 24 h avant la préparation pour permettre à l’extrait de matrice de se liquéfier.
2. Déterminez la concentration et le volume de cellules nécessaires à l’étude. Implantez les souris avec 1 × 10⁶ cellules par souris dans un volume de 50 μL, composé de 1 partie de PBS réfrigéré et d’une partie de l’extrait matriciel.
3. Granulez les cellules trypsinisées comme décrit à l’étape 3.1.2. Remettre la pastille en suspension dans au moins 10 ml de PBS pour laver les cellules, puis centrifuger une fois de plus à 200 × g pendant 5 min. Remettre la pastille en suspension dans 500 μL de PBS (stock cellulaire) réfrigéré.
4. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Comme les cellules seront à une concentration élevée, diluez une petite aliquote (p. ex., 10 μL) au besoin, en gardant une trace du facteur de dilution jusqu’à ce que des mesures précises puissent être prises.
5. Diluez le nombre total requis de cellules à 40 × 10⁶ cellules/mL, puis ajoutez un volume égal d’extrait de matrice réfrigéré pour obtenir une concentration finale de 1 × 10⁶ cellules par 50 μL. Gardez sur de la glace pour éviter que l’extrait ne se solidifie avant l’implantation.
   REMARQUE : Les concentrations cellulaires sont résumées dans le tableau 1.

5. Induction de tumeurs orthotopiques

1. Anesthésie une souris à l’aide d’isoflurane à 2 %, puis transfère-la dans un cône nasal, en maintenant le plan chirurgical de l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 0-3 % sur un coussin chauffant. Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie par l’absence de réflexe cornéen et/ou de réponse par pincement des orteils. Protégez-vous contre le dessèchement de la cornée en appliquant une pommade ophtalmique sur les yeux.
2. Nettoyez la peau près du site d’injection avec une lingette à 70 % d’alcool et laissez l’alcool sécher quelques secondes. Induire au niveau de la glande mammaire #4 pour réduire le risque de chevauchement des signaux d’imagerie de bioluminescence entre la tumeur primaire et les sites de métastases les plus courants (poumon et ganglion lymphatique axillaire).
   REMARQUE : La numérotation des glandes mammaires a été décrite précédemment¹². En bref, une souris en position couchée avec la tête orientée vers le haut aura des glandes 1 à 5 sur le côté droit de l’injecteur (gauche de la souris) commençant par la plus proche de la tête (cervicale - glande 1) et descendant vers la plus caudale (inguinale - glande 5). Les glandes 6 à 10 sont orientées de la même manière du côté opposé de l’animal.
3. Pipetez le stock de cellules de haut en bas pour remettre les cellules en suspension. Prélevez 50 μL de la suspension de cellules glacées dans une seringue à insuline avec une aiguille de 29 G et injectez les cellules immédiatement. Gardez la seringue sur de la glace si vous ne pouvez pas l’injecter immédiatement.
   REMARQUE : Pipette de haut en bas entre chaque tirage de cellules pour éviter que les cellules ne se déposent.
4. Insérez le biseau directement sous le mamelon de la glande mammaire souhaitée parallèlement au corps de la souris à cet endroit et injectez les cellules à un rythme régulier et lent. Laissez l’aiguille dans la peau pendant au moins 5 secondes après la fin de l’injection pour permettre au Matrigel de se solidifier et d’éviter les fuites.
5. Déplacez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant pour la récupération et supervisez-la jusqu’à ce qu’elle soit complètement ambulatoire et capable de maintenir le décubitus sternal. Ne laissez pas la souris sans surveillance. Ne remettez la souris dans sa cage avec d’autres souris qu’une fois qu’elle s’est rétablie.

6. Surveillance de la croissance tumorale et du développement des métastases avec l’imagerie par bioluminescence (BLI)

REMARQUE : Comme les cellules MDA-MB-231 utilisées ici expriment la luciférase, l’injection de substrat de luciférine dans les souris produira un signal optique détecté par le scanner du système d’imagerie. Dans ce modèle, des métastases peuvent être attendues 5 à 7 semaines après l’induction de la tumeur. Il est recommandé d’imager les souris 1 à 3 fois par semaine, en fonction de l’importance d’identifier le moment exact où les métastases sont visualisées.

1. Anesthésier les souris à l’aide d’isoflurane à 2 % pour minimiser le risque de blessure à la souris lors de l’administration de luciférine. Protégez-vous contre le dessèchement de la cornée en appliquant une pommade ophtalmique sur les yeux.
2. Injectez 150 mg/kg de poids corporel de luciférine par voie intrapéritonéale dans chaque souris et renvoyez les souris dans leur cage sur un coussin chauffant pour permettre aux souris de se réveiller et de métaboliser la luciférine. Surveillez et ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elles soient complètement ambulatoires et capables de maintenir une décubitus sternal.
   REMARQUE : Les valeurs utilisées pour les calculs de dosage sont résumées dans le tableau 1.
3. Imagez les souris à l’aide du scanner du système d’imagerie à partir d’environ 10 minutes après l’injection de luciférine, en anesthésiant à nouveau les souris au besoin pour permettre le transfert vers l’IVIS.
   1. Imagez jusqu’à 5 souris ensemble en position couchée, en prenant soin de vous assurer que tout leur corps est inclus dans les marques de guidage du champ de vision et orienté aussi droit que possible. Utilisez du ruban adhésif transparent pour sécuriser leurs bras afin de mieux visualiser les ganglions lymphatiques axillaires. Si vous imagez plusieurs souris à la fois, utilisez des diviseurs de collecteurs pour séparer les souris afin d’empêcher les signaux de rayonner sur d’autres souris. S’il n’y a pas de séparateurs, utilisez des bandes de papier absorbant la lumière à leur place (p. ex., du papier cartonné épais et noir).
      REMARQUE : Les taux de métabolisme de la luciférine varient entre les modèles de souris et de lignées cellulaires, et l’acquisition d’images commençant à 10 minutes après l’injection peut ne pas produire le signal le plus fort. Il est recommandé d’effectuer des acquisitions à différents points temporels au début d’une nouvelle étude afin de déterminer le moment de l’intensité maximale du signal.
   2. Préparez le logiciel du système d’imagerie pour l’acquisition d’images avec les paramètres suivants pour BLI : Exposition = Auto, Binning = Moyen, FStop = 1, Excitation = Bloc, Émission = Ouvert, FOV = D, Hauteur = 1,50.
   3. Généralement, les signaux tumoraux primaires produiront un signal relativement fort en raison de leur emplacement superficiel à l’aide du réglage Exposition = Auto. Si vous surveillez la présence de métastases, utilisez du ruban isolant noir pour couvrir soigneusement la tumeur primaire et réglez manuellement Exposition = 300 s (ou plus) pour acquérir des signaux faibles s’ils sont présents.
      REMARQUE : Dans ce modèle, un signal distinct de la tumeur primaire qui est visible sur plusieurs séances d’imagerie lorsque le seuil inférieur est fixé à 5 × 10³ radiance est considéré comme indicatif de métastases.

7. Résection des tumeurs primitives

REMARQUE : La résection des tumeurs primitives est importante pour les études longitudinales (par exemple, thérapeutiques) dans les métastases ; Sinon, les souris peuvent succomber à une morbidité liée à une croissance tumorale primaire sans restriction. Tenez compte de la taille de la tumeur primaire (risque de perte de sang lors de la résection) et de l’ulcération (risque d’infection) pour déterminer le moment de la résection.

1. Si l’on considère l’absence de signal BLI pour tester la réussite de la résection tumorale primaire, effectuez l’imagerie préopératoire comme décrit dans la rubrique 6 et confirmez qu’il n’y a pas de signal après l’opération. Confirmez la réussite de la résection dans les 1 à 2 prochains jours à l’aide de luciférine fraîchement administrée.
   REMARQUE : La réadministration immédiate de luciférine n’est pas recommandée pour éviter un stress inutile à l’animal. La luciférine injectée avant la résection tumorale primaire devrait être suffisante pour détecter le signal si la résection n’était pas complète.
2. Anesthésie la souris à l’aide d’isoflurane à 2 %, puis transfère-la dans un cône nasal, en maintenant le plan chirurgical de l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 0-3 % sur un coussin chauffant. Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie par l’absence de réflexe cornéen et/ou de réponse par pincement des orteils.
3. Protéger contre le dessèchement de la cornée en appliquant une pommade ophtalmique sur les yeux
4. Injecter 5 mg/kg de kétoprofène par voie sous-cutanée comme analgésie pour l’intervention.
   REMARQUE : Les valeurs utilisées pour les calculs de dosage sont résumées dans le tableau 1.
5. Préparez la zone chirurgicale en alternant 3x les gommages à 70 % d’alcool et de bétadine. Laissez sécher le gommage final à la bétadine avant de continuer.
6. Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour ouvrir verticalement la peau au-dessus de la tumeur primitive (rostrale-caudale). Dans le cas d’une peau ulcérée, commencez à ouvrir sur le côté de l’ulcération pour éviter de laisser la tumeur primitive derrière vous et pour enlever complètement la peau ulcérée.
7. Continuez à utiliser des ciseaux et des pinces pour disséquer soigneusement le tissu conjonctif autour de la tumeur encapsulée afin d’éliminer complètement la masse de la peau, ainsi que des tissus corporels sous-jacents, car toute tumeur restante peut repousser.
8. Le cas échéant, contrôlez le saignement en appliquant une pression à l’aide d’un applicateur à embout de coton.
9. Fermez l’ouverture chirurgicale avec une suture 5-0 Vicryl.
   REMARQUE : Une suture interrompue peut entraîner une meilleure perméabilité de la plaie, car les souris ont tendance à déranger le site chirurgical.
10. Laissez l’animal se rétablir dans une cage propre sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il soit complètement ambulatoire. Placez de la nourriture humidifiée au fond de la cage familiale lorsque vous remettez l’animal dans la cage.
11. Injecter 5 mg/kg de kétoprofène par voie sous-cutanée une fois par jour pendant au moins 2 jours après la chirurgie. Vérifiez l’état de la plaie à ces moments-là.

8. Livraison du nanomédicament

1. Pesez les souris car le dosage du nanomédicament est basé sur le poids corporel.
2. Anesthésie la souris à l’aide d’isoflurane à 2 %, puis transfère-la dans un cône nasal, en maintenant le plan chirurgical de l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 0-3 % sur un coussin chauffant. Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie par l’absence de réflexe cornéen et/ou de réponse par pincement des orteils.
   REMARQUE : Alternativement, le nanomédicament peut être administré à une souris éveillée restreinte. Toutes les étapes suivantes seraient les mêmes.
3. Préparez une seringue à insuline avec une aiguille de 29 G avec 10 mg de nanomédicament Fe/kg de poids corporel de souris.
4. Immergez la queue de l’animal dans de l’eau tiède (30-35 °C) pendant 30 secondes pour dilater les veines de la queue.
5. Essuyez l’excès d’eau de la queue et nettoyez le site d’injection avec une lingette à 70 % d’alcool.
6. Insérez le biseau de l’aiguille dans la veine latérale de la queue à peu près à mi-chemin de la queue et tirez légèrement le piston vers l’arrière pour confirmer le placement avec retour de sang dans l’aiguille. Si nécessaire, déplacez l’aiguille légèrement vers l’avant ou à une profondeur plus superficielle pour obtenir un placement réussi.
7. Une fois l’insertion réussie, injectez le nanomédicament régulièrement à un rythme lent d’environ 5 à 10 s pour une injection de 40 μL. Confirmer le succès de l’injection par l’absence de solution qui s’accumule sous la peau de la queue près du site d’injection et par l’assombrissement de la veine (à partir de la solution de nanoparticules sombres).
   REMARQUE : Les valeurs utilisées pour les calculs de dosage sont résumées dans le tableau 1. Les formulations de nanoparticules agglomérées peuvent s’emboliser dans les poumons. Si une détresse respiratoire est observée peu de temps après l’injection, effectuez doucement des compressions thoraciques sur la souris. Une action immédiate permet toujours de permettre à l’animal de se remettre de ce problème possible.
8. Maintenez la pression sur le site d’injection avec de la gaze et retirez l’aiguille en maintenant la pression pendant environ 30 s jusqu’à ce que le saignement cesse.
9. Laissez l’animal se rétablir dans une cage propre sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il soit complètement ambulatoire.

9. Collecte de métastases pour analyse

1. Imagez les souris par BLI comme décrit dans la section 6.
   REMARQUE : Dans cette étude, 5 × 10³ radiance est considéré comme indicatif de métastases et est généralement observé à 5-7 semaines. Il faut s’attendre à une légère variation du temps écoulé jusqu’à la métastase chez les souris.
2. Immédiatement après l’imagerie, sacrifiez les souris par luxation cervicale sous isoflurane lourd (5 %). Avant la dissection, confirmer la mort par absence de réflexe cornéen et/ou de réponse par pincement des orteils.
3. Prélevez soigneusement les métastases. Les métastases ganglionnaires se présentent sous la forme d’une masse agrandie et encapsulée. Les métastases pulmonaires seront généralement réparties dans tout le parenchyme pulmonaire ; par conséquent, prélever tout le poumon.
4. Placez les tissus collectés dans une boîte de Pétri et imagez à l’aide du système d’imagerie pour confirmer la bioluminescence (indiquant la présence de cellules cancéreuses exprimant la luciférase) et la fluorescence (indiquant l’accumulation de nanomédicaments). Utilisez les mêmes paramètres d’acquisition BLI que ceux décrits à l’étape 6.3.2. Les paramètres d’acquisition FLI sont Exposition = Auto, Binning = Moyen, FStop = 1, Excitation = 675 et Émission = 720 (programme par défaut pour le colorant Cy5.5), Niveau de la lampe = Élevé, Champ de vision = D, Hauteur 1,50. Imagez la carcasse de la souris pour déterminer s’il reste du tissu cancéreux qui vaut la peine d’être collecté.
5. Rincer les tissus cancéreux dans le PBS.
6. Pour prélever des tissus pour la microscopie ou la qRT-PCR, intégrez-les dans l’OCT et conservez-les à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être traités.
7. Pour prélever des tissus en vue de la spectroscopie d’émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES), tarez une balance à l’aide d’un tube vide de 1,7 ml, placez le tissu dans le tube et notez son poids. Congelez le mouchoir et conservez-le à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être transformé.

10. Validation de l’administration de nanomédicaments par microscopie à fluorescence

1. Cryosection des échantillons fraîchement congelés inclus dans l’OCT sur des lames de microscopie à 10 μm d’épaisseur. Ajustez la température de la chambre et du porte-échantillon en fonction du type de tissu. Les réglages entre -20 °C et -15 °C conviennent à la fois aux tissus pulmonaires et lymphatiques.
2. Fixez les sections de tissu sur les lames en immergeant les sections ou les lames entières dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min. Rincez soigneusement avec du PBS.
3. Montez les lamelles sur les glissières. Utilisez un milieu avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser l’architecture tissulaire.
4. À l’aide d’un microscope à fluorescence, examinez les sections pour détecter la présence de Cy5.5 (excitation 683 nm/émission 703 nm), ce qui indique l’administration de nanomédicaments. Confirmez que le signal n’est pas en arrière-plan en utilisant un échantillon de contrôle négatif (tissu d’un animal non injecté).

11. Validation de l’administration de nanomédicaments par spectroscopie d’émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES)

1. Transférez les échantillons conservés à -80 °C dans un tube conique de 15 mL et incubez-les dans un four avec le capuchon retiré à 37 °C pour sécher.
   REMARQUE : Ce processus a duré 24 h pour les échantillons de métastases MDA-MB-231, mais peut prendre plusieurs jours selon la taille et la teneur en humidité de l’échantillon.
2. Enregistrez le poids sec à l’aide d’une balance.
3. Ajouter 2 mL de trace à 70 % de HNO₃ dans le récipient et digérer l’échantillon au micro-ondes. Les paramètres utilisés dans cette étude sont les suivants : Puissance = 1030 - 1800 W, Temps de rampe = 20:00 - 25:00, Temps de maintien = 15:00, Température = 200 °C, Refroidissement = 30 min.
   ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous travaillez avec de l’acide nitrique car celui-ci et les fumées générées lors de son chauffage sont très corrosifs. Le travail doit être effectué dans un endroit bien ventilé avec un équipement de protection individuelle complet, comme une blouse de laboratoire, des lunettes de protection/un écran facial et des gants compatibles avec le travail à l’acide. Les petits volumes et le long refroidissement utilisés ici minimisent quelque peu les risques, mais il faut toujours faire attention.
4. Transférez les échantillons digérés dans des tubes coniques sans métal ; ensuite, transférez 300 μL dans un nouveau tube. Diluer à 10 mL avec 9,7 mL d’eau ultrapure, ce qui permet d’obtenir une concentration de HNO₃ de 3 % (v/v).
5. Préparez des étalons individuels d’élément Fe à des concentrations de 1000, 100, 10, 1, 0,1 et 0 μg Fe/mL dans de l’eau à 3 % de HNO₃ (v/v) et de l’eau ultrapure. Préparer l’étalon interne de l’élément Y individuel à une concentration de 1 μg/mL dans 3 % de HNO₃ (v/v) dans de l’eau ultrapure.
6. Analysez des échantillons à l’aide de l’ICP-OES. Pour les modes axial et radial, sélectionnez les raies d’émission suivantes pour l’analyse de la teneur en fer. Fe (234,350 nm), Fe (238,204 nm), Fe (259,940 nm) et Y (371,029 nm) utilisés pour la normalisation interne.
7. Normaliser les résultats en fonction de la quantité d’échantillon utilisée pour calculer μg de Fe/g de tissu.

Résultats

Dans nos précédentes études thérapeutiques in vivo, nous avons traité des souris avec une dose de nanomédicament (10 mg Fe nanodrug/kg de poids corporel de souris) par semaine pendant plusieurs semaines ^3,7,8. Pour cette démonstration, nous avons cherché à déterminer si l’accumulation de nanomédicament pouvait être observée dans les métastases pulmonaires après une dose...

Discussion

Les nanoparticules ont un grand potentiel pour le traitement du cancer. Ici, nous avons montré qu’un porteur de MNP conjugué à Cy5.5 peut atteindre les tissus cancéreux pour délivrer des oligonucléotides thérapeutiques dans un modèle murin de cancer du sein métastatique. La capacité d’administrer le nanomédicament de manière systémique tout en réalisant une accumulation considérable dans les tissus cancéreux offre d’énormes avantages par rapport à de nombreuses m?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 5800 ICP-OES	Agilent	5800 ICP-OES	For ICP-OES
Ammonium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	458680025	For nanodrug synthesis
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	For tumor resection
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	For tumor resection
Crile Hemostats - Straight	F.S.T.	13004-14	For tumor resection
Cy5.5-NHS ester	Abcam	ab146455	For nanodrug synthesis
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	For cell culture of MDA-MB-231
Eclipse 50i Clinical Microscope	Nikon	50i-B	For imaging of cryosections
Epichlorohydrin	Thermo Fisher Scientific Inc	117780250	For nanodrug synthesis
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	For tumor resection and metastasis dissection
Fe standard	Inorganic Ventures	CGFE1-500ML	For ICP-OES
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	For cell culture of MDA-MB-231
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	For tumor resection and metastasis dissection
Flask (T-75)	Corning	430641U	For cell culture of MDA-MB-231
HNO3 nitric acid (70%, trace metal grade)	Fisher Chemical	A509P212	For ICP-OES
Insulin syringe 1 CC 29 G x 1/2"	Becton, Dickinson	324704	For tumor implant
Isoflurane	Covetrus	11695067772	For mouse anesthetization
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	For mouse anesthetization
Isopropyl alcohol (70%) wipe	Cardinal	MW-APL	For tumor resection
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	For bioluminescence imaging
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	For bioluminescence imaging
Ketofen (ketoprofen)	Zoetis	10004031	For tumor resection
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
MARS 6 microwave digestion system	CEM	MARS 6	For ICP-OES
Matrigel, growth factor-reduced	Corning	354230	For tumor implant of MDA-MB-231
MDA-MB-231-luc-D3H2LN	PerkinElmer/Revvity	119369	For mouse model of spontaneous metastasis
Metal-free polypropylene 15 mL conical tubes	Labcon	31343450019	For ICP-OES
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	DOT Scientific	RN1700-GMT	For metastasis sample collection
N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP)	Thermo Fisher Scientific Inc	21857	For nanodrug synthesis
PBS	Gibco	14190-144	For cell culture and tumor implant of MDA-MB-231
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture of MDA-MB-231
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	For tumor resection
Sodium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	3728-70	For nanodrug synthesis
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	For metastasis sample collection
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	For metastasis sample collection
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific Inc	T2556	For nanodrug synthesis
Trypsin, 0.25%	Gibco	25200-056	For cell culture of MDA-MB-231
Vicryl PLUS (Antibacterial) violet 27" RB-1 taper	Ethicon	VCP303H	For tumor resection