Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir das Protokoll für die in vivo Verabreichung von magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln, die RNA-Oligomere tragen, an metastasierenden Brustkrebs in Tiermodellen und bieten damit einen klinisch praktikablen Ansatz für das therapeutische Silencing von onkogenen Nukleinsäuren.

Zusammenfassung

Metastasierender Brustkrebs ist eine verheerende Krankheit mit sehr begrenzten therapeutischen Möglichkeiten, die neue therapeutische Strategien erfordert. Es wurde gezeigt, dass onkogene miRNAs mit dem metastasierenden Potenzial von Brustkrebs in Verbindung gebracht werden und an der Migration, Invasion und Lebensfähigkeit von Tumorzellen beteiligt sind. Es kann jedoch schwierig sein, ein inhibitorisches RNA-Molekül an das interessierende Gewebe abzugeben. Um diese Herausforderung zu meistern und aktive Antisense-Oligonukleotide an Tumore zu liefern, haben wir magnetische Eisenoxid-Nanopartikel als Verabreichungsplattform verwendet. Diese Nanopartikel zielen auf Gewebe mit erhöhter Gefäßpermeabilität ab, wie z. B. Entzündungs- oder Krebsstellen. Die Abgabe dieser Nanopartikel kann aufgrund ihrer magnetischen Eigenschaften in vivo durch Magnetresonanztomographie (MRT) überwacht werden. Die Übertragung dieses therapeutischen Ansatzes in die Klinik wird aufgrund seiner Kompatibilität mit dieser relevanten Bildgebungsmodalität leichter zugänglich sein. Sie können auch mit anderen bildgebenden Reportern markiert werden, wie z. B. einem Cy5.5-Nahinfrarot-Farbstoff für die korrelative optische Bildgebung und Fluoreszenzmikroskopie. Hier zeigen wir, dass Nanopartikel, die mit Cy5.5 markiert und an therapeutische Oligomere konjugiert sind, die auf onkogene miRNA-10b abzielen (als MN-anti-miR10b oder "Nanodrug" bezeichnet), intravenös verabreicht werden, sich an metastasierten Stellen anreichern, was eine Möglichkeit für eine therapeutische Intervention bei metastasierendem Brustkrebs eröffnet.

Einleitung

Trotz vieler Fortschritte in der Behandlung von Brustkrebs sind die klinischen Möglichkeiten für metastasierende Erkrankungen nach wie vor begrenzt. Die Patienten erhalten häufig Therapien, die gegen im Primärtumor identifizierte Treiber wie Östrogen oder HER2 gerichtet sind, aber diese Treiber sind in Metastasen nicht immer konserviert, so dass die Therapie unwirksam ist¹. Andere systemische Therapien, wie z.B. die Chemotherapie, sind unspezifisch und für ihre Nebenwirkungen bekannt. Um wirksame Optionen für die Behandlung von metastasiertem Brustkrebs zu entwickeln, ist es wichtig, die biologischen Treiber zu berücksichtigen, die es Krebszellen ermöglichen, sich auszubreiten und entfernte Stellen zu besiedeln. Einer dieser Treiber ist miR-10b, eine onkogene microRNA, die an der Lebensfähigkeit, Invasion und Migration von Brustkrebszellen beteiligt ist und sich als ausreichend erwiesen hat, um metastasierendes Potenzial in ansonsten nicht metastasierten Brustkrebszellen zu verleihen ^2,3. Wichtig ist, dass miR-10b auch in Metastasen in höheren Konzentrationen exprimiert wird als bei übereinstimmenden Primärtumoren⁴, was es zu einem vielversprechenden Ziel für die Behandlung bestehender Metastasen macht.

Obwohl miRNAs wie miR-10b ein großes Potenzial als therapeutische Ziele für metastasierende Erkrankungen haben, stellt das Design therapeutisch tragfähiger Methoden für das miRNA-Silencing einzigartige Herausforderungen dar. Antisense-Oligonukleotide (ASOs), die an ihre komplementäre miRNA-Sequenz binden, werden in vitro üblicherweise durch Lipofektion auf die Zellen übertragen, können Tumorzellen in vivo jedoch aufgrund der inhärenten Instabilität, des Risikos der Zerstörung durch Nukleasen, der kurzen Bluthalbwertszeit und der Unfähigkeit, aufgrund der Ladungs-Ladungsabstoßung in Zellen einzudringen, nicht leicht erreichen⁵. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir einen klinisch anwendbaren Träger für Biomoleküle entwickelt, der dextranbeschichtete magnetische Eisenoxid-Nanopartikel (MNP)⁶ verwendet. Amingruppen auf dem Nanopartikel ermöglichen die Konjugation von Oligonukleotiden, Fluoreszenzfarbstoffen (z. B. Cy5.5) und Targeting-Einheiten. Darüber hinaus ermöglicht der Eisenoxidkern die In-vivo-Überwachung der Fahrzeugauslieferung mittels Magnetresonanztomographie (MRT). Wir konjugierten die anti-miR-10b-gesperrten Nukleinsäuren ASO und Cy5.5 an MNP, um ein "Nanodrug" zu erzeugen, das als MN-anti-miR10b bezeichnet wird und in Abbildung 1⁷ dargestellt ist.

In unseren früheren Studien haben wir gezeigt, dass das Nanomedikament effizient eine Herunterregulierung von miR-10b bewirkt und die Migration und Invasion von dreifach negativen Brustkrebszellen in vitro hemmt ⁷. In Mausmodellen für metastasierenden Brustkrebs verhinderte die intravenöse Verabreichung des Nanomedikaments die Entwicklung von Lymphknotenmetastasen oder, wenn es nach der Bildung von Lymphknotenmetastasen verabreicht wurde,^{deren Wachstum 7}. Insbesondere wurde beobachtet, dass sich das Nanomedikament leicht in Krebsgeweben anreichert. Während das Nanomedikament die Metastasen nicht von selbst ausrottete, zeigten wir in nachfolgenden Studien, dass die Kombinationsbehandlung mit adjuvantem Doxorubicin sowohl in immungeschwächten als auch in immunkompetenten Mausmodellen kurativ war ^3,8. Die Auswirkungen der miR-10b-Hemmung durch das Nanomedikament wurden auch beim Mammakarzinom bei Katzen beobachtet⁹.

Um Brustkrebs wirksam zu behandeln, muss unbedingt nachgewiesen werden, dass sich das Medikament in interessierenden Geweben ansammelt. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Akkumulation des magnetischen Nanopartikelträgers zu demonstrieren, der verwendet wird, um therapeutische anti-miR-10b-ASOs an Krebsgewebe unter Verwendung mehrerer Modalitäten in Mausmodellen für metastasierenden Brustkrebs zu verabreichen.

Protokoll

Das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Michigan State University hat alle Verfahren mit Tieren genehmigt. Die Werte für die Berechnungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

1. Wichtige Schritte der MN-anti-miR10b-Synthese

HINWEIS: Einzelheiten der MN-anti-miR10b-Synthese wurden bereits beschrieben ^9,10,11.

1. Bereiten Sie den magnetischen Nanopartikel (MN)-Kern durch Co-Präzipitationsmethode vor.
2. Vernetzung und Aminierung der hergestellten Nanopartikel unter Verwendung von Natriumhydroxid, Epichlorhydrin und Ammoniumhydroxid.
3. Konjugieren Sie einen Cy5.5-NHS-Ester an MN durch den heterobifunktionellen Vernetzer N-Succinimidyl-3-[2-pyridyldithio]-propionat (SPDP), um MN-Cy5.5 zu erhalten und so Fluoreszenzbildgebung und Mikroskopie zu ermöglichen.
4. Aktivieren Sie die anti-miR-10b-gesperrte Nukleinsäure mit 3 % Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) und konjugieren Sie mit MN-Cy5.5, um das MN-anti-miR10b zu erhalten.
5. Durchführung einer Charakterisierung des Konjugats zur Bestimmung des Eisengehalts (durch Eisenassay), der Anzahl der Cy5,5-Moleküle pro Nanopartikel (durch Spektrophotometrie) und der Menge an konjugiertem LNA (durch Agarose-Gelelektrophorese).

2. Erwerben Sie Versuchstiere

1. Skizzieren Sie die Studie im Voraus, um die Versuchsgruppen und die Anzahl der Tiere pro Gruppe zu planen. Halten Sie bis zu 5 Mäuse pro Käfig. Wenn während der Behandlung mehrere Käfige mit 5 Mäusen verwendet werden, stellen Sie sicher, dass in jedem Käfig Kontroll- und Versuchsmäuse vorhanden sind, um den Käfig als Störvariable zu entfernen.
2. Erhalten Sie Mäuse im Alter von 6-7 Wochen. Erlauben Sie mindestens 1 Woche Eingewöhnung an die Haltungsbedingungen, bevor Sie orthotope Tumoren induzieren.
   HINWEIS: Im Folgenden werden Verfahren unter Verwendung des MDA-MB-231-Modells (human-derived cell line) für spontane Brustkrebsmetastasen beschrieben. Für dieses Modell werden häufig athyme Nacktmäuse (Foxn1^nu/Foxn1^nu) verwendet. Andere kompatible immungeschwächte Mausstämme können verwendet werden, und die Verfahren sind auch auf Allotransplantatmodelle in immunkompetenten Mäusen anwendbar (z. B. 4T1-Brustkrebszellen in BALB/c-Mäusen).

3. Zellen kultivieren

1. Ergänzen Sie das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (vollständiges Wachstumsmedium), um MDA-MB-231-Zellen zu züchten, die Luciferase exprimieren (z. B. MDA-MB-231-luc-D3H2LN). Die Zellen werden unter aseptischen Bedingungen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit gezüchtet, in der Regel in einem T75-Kolben. Wenn sie eingefroren sind, tauen Sie die Zellen und die Passage mindestens einmal vor der Tumorimplantation auf. Die Durchgangsnummer ist auf dem Kolben zu vermerken.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde eine zuvor gefrorene Durchstechflasche mit 1 × 10⁶ Zellen vor der Verwendung zweimal aufgetaut und durchgelassen.
   1. Zur Passage 0,25 % Trypsin für 3 Minuten bei 37 °C auftragen, um die Zellen bei einer Konfluenz von <80 % zu trypsinisieren. Fügen Sie das 4-fache Volumen des kompletten Wachstumsmediums hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.
   2. Die Suspension wird bei 200 × g 5 min lang in einem konischen Röhrchen zentrifugiert. Das Zellpellet wird nach dem Dekantieren des Überstands in 5 ml vollständigem Wachstumsmedium resuspendiert. Ein Teil der Zellen wird in einen neuen Kolben aliquotiert und zusätzliches vollständiges Wachstumsmedium auf der Grundlage des neuen Kolbenvolumens hinzugefügt. Aktualisieren Sie die Durchgangsnummer auf dem neuen Kolben.
2. Tauen Sie neue Zellen nach 10 Passagen auf, um die genetische Drift zwischen den Studien zu minimieren.

4. Vorbereitung der Zellen für die Induktion orthotoper Tumoren

1. Gefrorenes Matrigel (Basalmembran-Matrix-Extrakt) vor der Zubereitung 24 h lang bei 4 °C aufstellen, damit sich der Matrix-Extrakt verflüssigen kann.
2. Bestimmen Sie die Konzentration und das Volumen der Zellen, die für die Studie benötigt werden. Implantieren Sie den Mäusen 1 × 10⁶ Zellen pro Maus in einem Volumen von 50 μl, bestehend aus 1 Teil gekühltem PBS und 1 Teil Matrixextrakt.
3. Die trypsinisierten Zellen werden wie in Schritt 3.1.2 beschrieben pelletiert. Resuspendieren Sie das Zellpellet in mindestens 10 ml PBS, um die Zellen zu waschen, und zentrifugieren Sie dann erneut 5 Minuten lang bei 200 × g . Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl gekühltem PBS (Zellmaterial).
4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Da die Zellen eine hohe Konzentration aufweisen, verdünnen Sie nach Bedarf ein kleines Aliquot (z. B. 10 μl) und behalten Sie den Verdünnungsfaktor im Auge, bis genaue Messungen durchgeführt werden können.
5. Verdünnen Sie die erforderliche Gesamtzahl der Zellen auf 40 × 10⁶ Zellen/ml und fügen Sie dann ein gleiches Volumen des gekühlten Matrixextrakts hinzu, um eine Endkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro 50 μl zu erreichen. Auf Eis aufbewahren, um zu verhindern, dass sich der Extrakt vor der Implantation verfestigt.
   HINWEIS: Die Zellkonzentrationen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

5. Induktion orthotoper Tumoren

1. Betäuben Sie eine Maus mit 2 % Isofluran und übertragen Sie sie dann auf einen Nasenkonus, wobei Sie die chirurgische Anästhesieebene mit 0-3 % Isofluran auf einem Heizkissen beibehalten. Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie durch das Fehlen eines Hornhautreflexes und/oder einer Zehenklemmreaktion. Schützen Sie sich vor dem Austrocknen der Hornhaut, indem Sie Augensalbe auf die Augen auftragen.
2. Reinigen Sie die Haut in der Nähe der Injektionsstelle mit einem Tuch mit 70 % Alkohol und lassen Sie den Alkohol einige Sekunden trocknen. Induktion an der Brustdrüse #4, um das Risiko einer Überlappung von Biolumineszenz-Bildgebungssignalen zwischen dem Primärtumor und den häufigsten Metastasierungsstellen (Lunge und axillärer Lymphknoten) zu verringern.
   HINWEIS: Die Nummerierung der Brustdrüse wurde bereits beschrieben¹². Kurz gesagt, eine Maus in Rückenlage mit dem Kopf nach oben gerichtet, hat die Drüsen 1 bis 5 auf der rechten Seite des Injektors (linke Maus), beginnend mit der dem Kopf am nächsten gelegenen (Halswirbelsäule - Drüse 1) und absteigend bis zur kaudalsten (Leistendrüse - Drüse 5). Die Drüsen 6 bis 10 sind auf der gegenüberliegenden Seite des Tieres ähnlich ausgerichtet.
3. Pipettieren Sie den Zellfond auf und ab, um die Zellen wieder zu resuspendieren. Ziehen Sie 50 μL der eiskalten Zellsuspension mit einer 29 G Nadel in eine Insulinspritze und injizieren Sie die Zellen sofort. Bewahren Sie die Spritze auf Eis auf, wenn sie nicht sofort injiziert werden kann.
   HINWEIS: Pipettieren Sie zwischen jeder Zellentnahme auf und ab, um zu verhindern, dass sich die Zellen absetzen.
4. Führen Sie die Fase direkt unter der Brustwarze der gewünschten Brustdrüse parallel zum Körper der Maus an dieser Stelle ein und injizieren Sie die Zellen in einem gleichmäßigen, langsamen Tempo. Lassen Sie die Nadel nach Abschluss der Injektion mindestens 5 s in der Haut, damit sich das Matrigel verfestigen kann und ein Auslaufen verhindert wird.
5. Bewegen Sie die Maus zur Erholung in einen sauberen Käfig auf einem Wärmekissen und überwachen Sie, bis sie vollständig gehfähig ist und in der Lage ist, die sternale Liege aufrechtzuerhalten. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt. Bringen Sie die Maus erst dann mit anderen Mäusen in ihren Käfig zurück, wenn sie sich erholt hat.

6. Überwachung des Tumorwachstums und der Metastasenentwicklung mit Biolumineszenz-Bildgebung (BLI)

HINWEIS: Da die hier verwendeten MDA-MB-231-Zellen Luciferase exprimieren, erzeugt die Injektion von Luciferin-Substrat in Mäuse ein optisches Signal, das vom Scanner des Bildgebungssystems erfasst wird. In diesem Modell sind Metastasen 5-7 Wochen nach Tumorinduktion zu erwarten. Es wird empfohlen, Mäuse 1-3x pro Woche abzubilden, je nachdem, wie wichtig es ist, den genauen Zeitpunkt zu identifizieren, zu dem Metastasen sichtbar gemacht werden.

1. Betäuben Sie die Mäuse mit 2% Isofluran, um das Verletzungsrisiko für die Maus bei der Verabreichung von Luciferin zu minimieren. Schützen Sie sich vor dem Austrocknen der Hornhaut, indem Sie Augensalbe auf die Augen auftragen.
2. Injizieren Sie jeder Maus intraperitoneal 150 mg/kg Körpergewicht Luciferin und bringen Sie die Mäuse auf einem Wärmekissen in ihren Käfig zurück, damit die Mäuse Luciferin aufwecken und verstoffwechseln können. Beaufsichtigen Sie die Mäuse und lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie vollständig gehfähig sind und in der Lage sind, die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
   HINWEIS: Die für die Dosierungsberechnungen verwendeten Werte sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
3. Bilden Sie die Mäuse mit dem Scanner des Bildgebungssystems ab, beginnend etwa 10 Minuten nach der Injektion mit Luciferin, und betäuben Sie die Mäuse bei Bedarf erneut, um Zeit für die Übertragung auf das IVIS zu haben.
   1. Stellen Sie sich bis zu 5 Mäuse zusammen in Rückenlage vor und achten Sie darauf, dass ihr gesamter Körper in die Sichtfeldmarkierungen einbezogen und so gerade wie möglich ausgerichtet ist. Verwenden Sie durchsichtiges Klebeband, um die Arme zu sichern, um die axillären Lymphknoten besser sichtbar zu machen. Wenn Sie mehrere Mäuse gleichzeitig abbilden, verwenden Sie vielfältige Teiler, um die Mäuse zu trennen, um zu verhindern, dass Signale auf andere Mäuse ausgestrahlt werden. Wenn keine Trennwände verfügbar sind, verwenden Sie an ihrer Stelle Streifen aus lichtabsorbierendem Papier (z. B. dicken, schwarzen Karton).
      HINWEIS: Die Raten des Luciferin-Metabolismus variieren je nach Maus- und Zelllinienmodell, und die Bildaufnahme, die 10 Minuten nach der Injektion beginnt, liefert möglicherweise nicht das stärkste Signal. Es wird empfohlen, zu Beginn einer neuen Studie Aufnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten durchzuführen, um den Zeitpunkt für die maximale Signalintensität zu bestimmen.
   2. Bereiten Sie die Software des Bildgebungssystems für die Bildaufnahme mit den folgenden Einstellungen für BLI vor: Belichtung = Auto, Binning = Mittel, FStop = 1, Anregung = Block, Emission = Offen, FOV = D, Höhe = 1,50.
   3. Im Allgemeinen erzeugen Primärtumorsignale aufgrund ihrer oberflächlichen Lage mit der Einstellung Exposure = Auto ein relativ starkes Signal. Bei der Überwachung auf Metastasen verwenden Sie schwarzes Isolierband, um den Primärtumor vorsichtig abzudecken, und stellen Sie die Exposition = 300 s (oder mehr) manuell ein, um schwache Signale zu erfassen, falls vorhanden.
      HINWEIS: In diesem Modell wird ein vom Primärtumor getrenntes Signal, das über mehrere Bildgebungssitzungen hinweg sichtbar ist, wenn der untere Schwellenwert auf 5 × 10³ Ausstrahlung eingestellt ist, als Hinweis auf eine Metastasierung angesehen.

7. Resektion von Primärtumoren

HINWEIS: Die Resektion von Primärtumoren ist wichtig für longitudinale (z. B. therapeutische) Studien bei Metastasen; Andernfalls können Mäuse einer Morbidität erliegen, die mit dem ungehinderten Wachstum des Primärtumors zusammenhängt. Berücksichtigen Sie bei der Bestimmung des Resektionszeitpunkts die Größe des Primärtumors (Risiko eines Blutverlusts bei der Resektion) und die Ulzeration (Infektionsrisiko).

1. Wenn Sie davon ausgehen, dass kein BLI-Signal vorhanden ist, um eine erfolgreiche Primärtumorresektion zu testen, führen Sie eine präoperative Bildgebung durch, wie in Abschnitt 6 beschrieben, und bestätigen Sie, dass nach der Operation kein Signal vorhanden ist. Bestätigen Sie die erfolgreiche Resektion innerhalb der nächsten 1-2 Tage mit frisch verabreichtem Luciferin.
   HINWEIS: Eine sofortige erneute Verabreichung von Luciferin wird nicht empfohlen, um unnötigen Stress für das Tier zu vermeiden. Die Injektion von Luciferin vor der Resektion des Primärtumors sollte ausreichen, um das Signal zu erkennen, wenn die Resektion noch nicht abgeschlossen war.
2. Betäuben Sie die Maus mit 2 % Isofluran und übertragen Sie sie dann auf einen Nasenkonus, wobei Sie die chirurgische Anästhesieebene mit 0-3 % Isofluran auf einem Heizkissen beibehalten. Bestätigen Sie die chirurgische Anästhesieebene durch das Fehlen eines Hornhautreflexes und/oder einer Zehenklemmreaktion.
3. Schützen Sie sich vor dem Austrocknen der Hornhaut, indem Sie Augensalbe auf die Augen auftragen
4. Injizieren Sie 5 mg/kg Ketoprofen subkutan als Analgesie für den Eingriff.
   HINWEIS: Die für die Dosierungsberechnungen verwendeten Werte sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
5. Bereiten Sie das Operationsgebiet vor, indem Sie abwechselnd 3x Peelings mit 70% Alkohol und Betadin verwenden. Lassen Sie das abschließende Betadin-Peeling trocknen, bevor Sie fortfahren.
6. Verwenden Sie eine sterile chirurgische Schere, um die Haut über dem Primärtumor vertikal (rostral-kaudal) zu öffnen. Bei geschwüriger Haut beginnen Sie mit der Öffnung zur Seite des Geschwürs, um ein Zurückbleiben des Primärtumors zu vermeiden und die ulzerierte Haut vollständig zu entfernen.
7. Verwenden Sie weiterhin eine Schere und eine Pinzette, um das Bindegewebe um den eingekapselten Tumor herum vorsichtig zu präparieren, um die Masse vollständig von der Haut sowie dem darunter liegenden Körpergewebe zu entfernen, da der verbleibende Tumor nachwachsen kann.
8. Falls vorhanden, kontrollieren Sie die Blutung, indem Sie mit einem Applikator mit Wattespitze Druck ausüben.
9. Verschließen Sie die Operationsöffnung mit einer 5-0 Vicryl-Naht.
   HINWEIS: Eine unterbrochene Naht kann zu einer besseren Durchgängigkeit der Wunde führen, da Mäuse dazu neigen, die Operationsstelle zu stören.
10. Lassen Sie das Tier in einem sauberen Käfig auf einem Wärmekissen genesen, bis es vollständig gehfähig ist. Legen Sie das angefeuchtete Futter auf den Boden des Käfigs, wenn Sie das Tier in den Käfig zurückbringen.
11. Injizieren Sie 5 mg/kg Ketoprofen einmal täglich subkutan für mindestens 2 Tage nach der Operation. Überprüfen Sie zu diesen Zeiten die Gesundheit der Wunden.

8. Verabreichung des Nanomedikaments

1. Wiegen Sie die Mäuse, da die Dosierung des Nanomedikaments auf dem Körpergewicht basiert.
2. Betäuben Sie die Maus mit 2 % Isofluran und übertragen Sie sie dann auf einen Nasenkonus, wobei Sie die chirurgische Anästhesieebene mit 0-3 % Isofluran auf einem Heizkissen beibehalten. Bestätigen Sie die chirurgische Anästhesieebene durch das Fehlen eines Hornhautreflexes und/oder einer Zehenklemmreaktion.
   HINWEIS: Alternativ kann das Nanomedikament einer gefesselten wachen Maus verabreicht werden. Alle nachfolgenden Schritte wären identisch.
3. Bereiten Sie eine Insulinspritze mit einer 29-g-Nadel mit 10 mg Fe-Nanodrug/kg Körpergewicht der Maus vor.
4. Tauchen Sie den Schwanz des Tieres für 30 s in warmes Wasser (30-35 °C), um die Schwanzvenen zu erweitern.
5. Wischen Sie überschüssiges Wasser vom Schwanz ab und reinigen Sie die Injektionsstelle mit einem Tuch mit 70 % Alkohol.
6. Führen Sie die Nadelschräge etwa auf halber Höhe des Schwanzes in die seitliche Schwanzvene ein und ziehen Sie den Kolben leicht zurück, um die Platzierung mit dem Rückschlag des Blutes in die Nadel zu bestätigen. Bewegen Sie die Nadel bei Bedarf leicht nach vorne oder in eine oberflächlichere Tiefe, um eine erfolgreiche Platzierung zu erzielen.
7. Nach erfolgreicher Insertion injizieren Sie das Nanodrug gleichmäßig mit einer langsamen Geschwindigkeit von etwa 5-10 s für eine 40-μl-Injektion. Bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion durch das Fehlen von Lösungsansammlungen unter der Haut des Schwanzes in der Nähe der Injektionsstelle und durch Verdunkelung der Vene (aus der dunklen Nanopartikellösung).
   HINWEIS: Die für die Dosierungsberechnungen verwendeten Werte sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Verklumpte Nanopartikelformulierungen können in die Lunge embolisieren. Wenn kurz nach der Injektion Atemnot beobachtet wird, führen Sie vorsichtig eine Herzdruckmassage an der Maus durch. Sofortiges Handeln führt immer zu einer erfolgreichen Genesung des Tieres von diesem möglichen Problem.
8. Halten Sie den Druck mit der Gaze auf die Injektionsstelle und entfernen Sie die Nadel, wobei Sie den Druck ca. 30 s lang halten, bis die Blutung aufhört.
9. Lassen Sie das Tier in einem sauberen Käfig auf einem Wärmekissen genesen, bis es vollständig gehfähig ist.

9. Entnahme von Metastasen für die Analyse

1. Bilden Sie die Mäuse mit BLI ab, wie in Abschnitt 6 beschrieben.
   HINWEIS: In dieser Studie gilt eine Ausstrahlung von 5 ×^{10 3} als Indikator für eine Metastasierung und wird im Allgemeinen nach 5-7 Wochen beobachtet. Eine leichte Varianz in der Zeit bis zur Metastasierung ist zwischen den Mäusen zu erwarten.
2. Unmittelbar nach der Bildgebung werden die Mäuse durch Zervixdislokation unter schwerem (5%) Isofluran getötet. Vor der Dissektion ist der Tod durch fehlenden Hornhautreflex und/oder Zehenkneifreaktion zu bestätigen.
3. Sammeln Sie vorsichtig die Metastasen. Lymphknotenmetastasen präsentieren sich als vergrößerte, verkapselte Masse. Lungenmetastasen sind im Allgemeinen über das gesamte Lungenparenchym verteilt; Sammeln Sie daher die ganze Lunge.
4. Legen Sie das gesammelte Gewebe in eine Petrischale und verwenden Sie das Bildgebungssystem, um die Biolumineszenz (die das Vorhandensein von Luciferase-exprimierenden Krebszellen anzeigt) und die Fluoreszenz (die auf die Akkumulation von Nanomedikamenten hinweist) zu bestätigen. Verwenden Sie die gleichen BLI-Erfassungseinstellungen wie in Schritt 6.3.2 beschrieben. Die FLI-Aufnahmeeinstellungen sind Belichtung = Auto, Binning = Mittel, FStop = 1, Anregung = 675 und Emission = 720 (Standardprogramm für Cy5.5-Farbstoff), Lampenpegel = Hoch, FOV = D, Höhe 1,50. Stellen Sie sich den Mauskadaver vor, um festzustellen, ob noch Krebsgewebe vorhanden ist, das es wert ist, gesammelt zu werden.
5. Spülen Sie das Krebsgewebe in PBS aus.
6. Zur Entnahme von Geweben für die Mikroskopie oder qRT-PCR in OCT einbetten und bis zur Verarbeitung bei -80 °C lagern.
7. Um Gewebe für die optische Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES) zu entnehmen, tarieren Sie eine Waage mit einem leeren 1,7-ml-Röhrchen, legen Sie das Gewebe in das Röhrchen und notieren Sie sein Gewicht. Das Tuch einfrieren und bis zur Verarbeitung bei -80 °C lagern.

10. Validierung der Verabreichung von Nanomedikamenten durch Fluoreszenzmikroskopie

1. Kryosektion der in die OCT eingebetteten, frisch gefrorenen Proben auf Mikroskopie-Objektträger mit einer Dicke von 10 μm. Passen Sie die Temperaturen der Kammer und des Probenhalters je nach Gewebetyp an. Einstellungen zwischen -20 °C und -15 °C sind sowohl für Lungen- als auch für Lymphgewebe geeignet.
2. Befestigen Sie die Gewebeschnitte auf Objektträgern, indem Sie die Schnitte oder ganze Objektträger 15 Minuten lang in 4%ige Paraformaldehydlösung tauchen. Vorsichtig mit PBS spülen.
3. Montieren Sie Deckgläser auf den Objektträgern. Verwenden Sie ein Medium mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zur Visualisierung der Gewebearchitektur.
4. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um Schnitte auf Cy5.5 (Anregung 683 nm/Emission 703 nm) zu untersuchen, was auf die Verabreichung von Nanomedikamenten hinweist. Vergewissern Sie sich, dass es sich bei dem Signal nicht um einen Hintergrund handelt, indem Sie eine negative Kontrollprobe (Gewebe eines nicht injizierten Tieres) verwenden.

11. Validierung der Verabreichung von Nanowirkstoffen durch optische Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES)

1. Die bei -80 °C gelagerten Proben werden in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und in einem Ofen mit abgenommener Kappe bei 37 °C zum Trocknen inkubiert.
   HINWEIS: Dieser Vorgang dauerte 24 Stunden für MDA-MB-231-Metastasenproben, kann jedoch je nach Größe und Feuchtigkeitsgehalt der Probe mehrere Tage dauern.
2. Notieren Sie das Trockengewicht mit einer Waage.
3. Geben Sie 2 ml 70%ige Spur HNO₃ in das Gefäß und verdauen Sie die Probe in der Mikrowelle. Die in dieser Studie verwendeten Parameter sind wie folgt: Leistung = 1030 - 1800 W, Rampenzeit = 20:00 - 25:00, Haltezeit = 15:00, Temperatur = 200 °C, Kühlung = 30 min.
   ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie mit Salpetersäure arbeiten, da diese und die beim Erhitzen entstehenden Dämpfe stark korrosiv sind. Die Arbeiten sollten in einem gut belüfteten Raum mit vollständiger persönlicher Schutzausrüstung wie Laborkittel, Schutzbrille/Gesichtsschutz und Handschuhen durchgeführt werden, die für Säurearbeiten geeignet sind. Die geringen Volumina und die langwierige Kühlung, die hier zum Einsatz kommen, minimieren das Risiko etwas, aber Vorsicht ist immer geboten.
4. Übertragen Sie die aufgeschlossenen Proben in metallfreie konische Röhrchen; Übertragen Sie dann 300 μl in ein neues Röhrchen. Mit 9,7 mL Reinstwasser auf 10 mL verdünnen, was zu einer HNO_{3-Konzentration} von 3 % (v/v) führt.
5. Bereiten Sie Fe-Standards für einzelne Elemente in Konzentrationen von 1000, 100, 10, 1, 0,1 und 0 μg Fe/ml in 3 % HNO₃ (v/v) und Reinstwasser vor. Bereiten Sie den internen Standard für das einzelne Element Y in einer Konzentration von 1 μg/ml in 3 % HNO₃ (v/v) in Reinstwasser vor.
6. Analysieren Sie Proben mit ICP-OES. Wählen Sie sowohl für den axialen als auch für den radialen Modus die folgenden Emissionslinien für die Analyse des Eisengehalts aus. Fe (234,350 nm), Fe (238,204 nm), Fe (259,940 nm) und Y (371,029 nm) werden für die interne Standardisierung verwendet.
7. Normalisieren Sie die Ergebnisse auf die Probenmenge, die für die Eingabe zur Berechnung von μg Fe/g Gewebe verwendet wurde.

Ergebnisse

In unseren früheren therapeutischen In-vivo-Studien behandelten wir Mäuse über mehrere Wochen wöchentlich mit einer Dosis Nanodrug (10 mg Fe-Nanodrug/kg Körpergewicht der Maus) ^3,7,8. Für diese Demonstration versuchten wir zu bestimmen, ob eine Akkumulation von Nanodrug in Lungenmetastasen nach einer Dosis, 1 Woche später, beobachtet werden konnte. Die Ergebnisse dieser Studie w?...

Diskussion

Nanopartikel haben ein großes Potenzial für die Krebsbehandlung. Hier zeigten wir, dass ein Cy5.5-konjugierter MNP-Träger Krebsgewebe erreichen kann, um therapeutische Oligonukleotide in einem Mausmodell für metastasierenden Brustkrebs zu verabreichen. Die Möglichkeit, das Nanomedikament systemisch zu verabreichen und gleichzeitig eine beträchtliche Akkumulation in Krebsgeweben zu erreichen, bietet enorme Vorteile gegenüber vielen bestehenden ASO-Verabreichungsmethoden, die häufi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 5800 ICP-OES	Agilent	5800 ICP-OES	For ICP-OES
Ammonium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	458680025	For nanodrug synthesis
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	For tumor resection
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	For tumor resection
Crile Hemostats - Straight	F.S.T.	13004-14	For tumor resection
Cy5.5-NHS ester	Abcam	ab146455	For nanodrug synthesis
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	For cell culture of MDA-MB-231
Eclipse 50i Clinical Microscope	Nikon	50i-B	For imaging of cryosections
Epichlorohydrin	Thermo Fisher Scientific Inc	117780250	For nanodrug synthesis
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	For tumor resection and metastasis dissection
Fe standard	Inorganic Ventures	CGFE1-500ML	For ICP-OES
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	For cell culture of MDA-MB-231
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	For tumor resection and metastasis dissection
Flask (T-75)	Corning	430641U	For cell culture of MDA-MB-231
HNO3 nitric acid (70%, trace metal grade)	Fisher Chemical	A509P212	For ICP-OES
Insulin syringe 1 CC 29 G x 1/2"	Becton, Dickinson	324704	For tumor implant
Isoflurane	Covetrus	11695067772	For mouse anesthetization
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	For mouse anesthetization
Isopropyl alcohol (70%) wipe	Cardinal	MW-APL	For tumor resection
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	For bioluminescence imaging
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	For bioluminescence imaging
Ketofen (ketoprofen)	Zoetis	10004031	For tumor resection
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
MARS 6 microwave digestion system	CEM	MARS 6	For ICP-OES
Matrigel, growth factor-reduced	Corning	354230	For tumor implant of MDA-MB-231
MDA-MB-231-luc-D3H2LN	PerkinElmer/Revvity	119369	For mouse model of spontaneous metastasis
Metal-free polypropylene 15 mL conical tubes	Labcon	31343450019	For ICP-OES
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	DOT Scientific	RN1700-GMT	For metastasis sample collection
N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP)	Thermo Fisher Scientific Inc	21857	For nanodrug synthesis
PBS	Gibco	14190-144	For cell culture and tumor implant of MDA-MB-231
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture of MDA-MB-231
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	For tumor resection
Sodium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	3728-70	For nanodrug synthesis
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	For metastasis sample collection
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	For metastasis sample collection
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific Inc	T2556	For nanodrug synthesis
Trypsin, 0.25%	Gibco	25200-056	For cell culture of MDA-MB-231
Vicryl PLUS (Antibacterial) violet 27" RB-1 taper	Ethicon	VCP303H	For tumor resection