マウス乳がん転移におけるナノ薬物蓄積のモニタリング

要約

ここでは、動物モデルにおける転移性乳がんへのRNAオリゴマーを運ぶ磁性酸化鉄ナノ粒子の in vivo 送達のプロトコルについて説明し、発がん性核酸の治療的サイレンシングのための臨床的に実行可能なアプローチを提供します。

要約

転移性乳がんは、治療の選択肢が非常に限られている壊滅的な疾患であり、新たな治療戦略が求められています。発がん性miRNAは、乳がんの転移可能性と関連していることが示されており、腫瘍細胞の遊走、浸潤、生存率に関与しています。しかし、阻害性RNA分子を目的の組織に送達することは困難な場合があります。この課題を克服し、活性アンチセンスオリゴヌクレオチドを腫瘍に送達するために、磁性酸化鉄ナノ粒子を送達プラットフォームとして利用しました。これらのナノ粒子は、炎症部位やがん部位など、血管透過性が高い組織を標的としています。これらのナノ粒子の送達は、その磁気特性により、磁気共鳴画像法(MRI)によって in vivo で監視できます。この治療アプローチを臨床に応用することは、この関連する画像診断法との互換性により、よりアクセスしやすくなるでしょう。また、相関光学イメージングや蛍光顕微鏡用のCy5.5近赤外光学色素など、他のイメージングレポーターで標識することもできます。本研究では、Cy5.5で標識し、発がん性miRNA-10b(MN-anti-miR10b、または「ナノドラッグ」と命名)を標的とする治療用オリゴマーに結合したナノ粒子が転移部位に蓄積し、転移性乳がんの治療介入の可能性を開くことを示しました。

概要

乳がんの治療には多くの進歩があるにもかかわらず、転移性疾患の臨床選択肢は依然として限られています。患者は一般的に、エストロゲンやHER2など、原発腫瘍で特定されたドライバーを対象とした治療を受けますが、これらのドライバーは必ずしも転移中に保存されているとは限らず、治療が効果を発揮しません¹。化学療法などの他の全身療法は非特異的であり、副作用で知られています。転移性乳がんの治療に効果的な選択肢を開発するためには、がん細胞が遠く離れた場所に広がり、コロニーを形成することを可能にする生物学的ドライバーを考慮することが重要です。これらのドライバーの1つは、乳がん細胞の生存率、浸潤、および遊走に関与する発がん性マイクロRNAであるmiR-10bであり、これは、他の方法では非転移性乳がん細胞に転移の可能性を付与するのに十分であることが示されています^2,3。重要なことに、miR-10b は、対応する原発腫瘍と比較して、転移でも高レベルで発現しており⁴、既存の転移の治療の有望な標的となっています。

miR-10b などの miRNA は、転移性疾患の治療標的として大きな可能性を秘めていますが、miRNA サイレンシングの治療可能な方法の設計には独自の課題があります。相補的なmiRNA配列に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は、通常、リポフェクションを使用して in vitro で細胞に転写されますが、固有の不安定性、ヌクレアーゼによる破壊のリスク、短い血半減期、および電荷-電荷反発による細胞への侵入不能のために、 in vivo で腫瘍細胞に容易に到達することはできません⁵.これらの課題に対処するために、デキストラン被覆磁性酸化鉄ナノ粒子(MNP)⁶を用いて、生体分子の臨床的に適用可能な担体を開発しました。ナノ粒子上のアミン基は、オリゴヌクレオチド、蛍光色素(Cy5.5など)、およびターゲティング部分の結合を可能にします。さらに、酸化鉄コアにより、磁気共鳴画像法(MRI)を使用した車両配送の in vivo モニタリングが可能になります。抗miR-10bロック核酸ASOとCy5.5をMNPに結合させ、 図1⁷に示すように、MN-anti-miR10bと呼ばれる「ナノドラッグ」を作製しました。

これまでの研究では、このナノドラッグが効率的にmiR-10bのダウンレギュレーションを引き起こし、in vitroでトリプルネガティブ乳がん細胞の遊走と浸潤を阻害することを示しました⁷。転移性乳がんのマウスモデルでは、ナノ薬剤の静脈内投与によりリンパ節転移の発生が予防され、リンパ節転移形成後に投与された場合、リンパ節転移の成長が停止しました⁷。特に、ナノドラッグはがん組織に容易に蓄積することが観察されました。このナノドラッグは単独では転移を根絶しませんでしたが、その後の研究では、アジュバントドキソルビシンとの併用療法が免疫不全マウスモデルと免疫コンピテントマウスモデルの両方で治癒的であることを示しました^3,8。ナノドラッグによるmiR-10b阻害の効果は、ネコの乳がん⁹でも見られます。

乳がんを効果的に治療するためには、薬物が目的の組織に蓄積することを示すことが不可欠です。ここでは、転移性乳がんのマウスモデルにおいて、複数のモダリティを使用して、治療用抗miR-10b ASOをがん組織に送達するために使用される磁性ナノ粒子担体の蓄積を実証するためのプロトコルを紹介します。

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プロトコル

ミシガン州立大学の動物管理および使用委員会(IACUC)は、動物を対象とするすべての手順を承認しました。計算の値を 表 1 にまとめます。

1. MN-抗miR10b合成のキーステップ

注:MN-抗miR10b合成の詳細は、前述の^9,10,11に記載されている。

1. 磁性ナノ粒子(MN)コアを共沈法で作製します。
2. 調製したナノ粒子を水酸化ナトリウム、エピクロロヒドリン、および水酸化アンモニウムを用いて架橋し、アミネートします。
3. ヘテロ二官能性架橋剤N-スクシンイミジル3-[2-ピリジルジチオ]-プロピオン酸(SPDP)を介してCy5.5-NHSエステルをMNに結合させ、MN-Cy5.5を取得し、蛍光イメージングと顕微鏡観察を可能にします。
4. 3%トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)で抗miR-10bロック核酸を活性化し、MN-Cy5.5に結合してMN-anti-miR10bを生成します。
5. コンジュゲートの特性評価を行い、鉄含有量(鉄アッセイによる)、ナノ粒子あたりのCy5.5分子数(分光光度法による)、およびコンジュゲートLNAの量(アガロースゲル電気泳動による)を決定します。

2. 研究動物の入手

1. 実験グループとグループあたりの動物数を計画するために、事前に研究の概要を説明します。ケージごとに最大5匹のマウスを収容します。治療中に5匹のマウスの複数のケージを使用する場合は、交絡変数としてケージを取り除くために、各ケージ内にコントロールマウスと実験マウスを必ず配置してください。
2. 6-7週齢でマウスを入手してください。同所性腫瘍の誘導前に、住宅条件に少なくとも 1 週間順応するのを待ちます。
   注:自然発生性乳がん転移のMDA-MB-231(ヒト由来細胞株)モデルを使用した手順を以下に説明します。このモデルでは、無腸体操マウス(Foxn1^nu/Foxn1^nu)が一般的に使用されます。他の適合性免疫不全マウス系統を使用でき、この手順は免疫適格マウスの同種移植モデル(例えば、BALB/cマウスの4T1乳がん細胞)にも適用できます。

3. 細胞の培養

1. ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(完全増殖培地)を添加して、ルシフェラーゼを発現するMDA-MB-231細胞(MDA-MB-231-luc-D3H2LNなど)を増殖させます。37°C、5%の_CO2 、湿度95%の無菌条件下で、通常はT75フラスコ内で細胞を増殖させます。凍結した場合は、腫瘍移植前に少なくとも1回は細胞を解凍し、継代してください。フラスコに通過番号を記録します。
   注:この研究では、1×10⁶ 細胞の以前に凍結されたバイアルを解凍し、使用前に2回継代しました。
   1. 継代するには、0.25%トリプシンを37°Cで3分間適用し、<80%のコンフルエントで細胞をトリプシン化します。トリプシンを中和するために、4倍の量の完全な増殖培地を追加します。
   2. 懸濁液を200 × g で円錐形チューブ内で5分間遠心分離します。上清をデカントした後、細胞ペレットを5 mLの完全増殖培地に再懸濁します。細胞の一部を新しいフラスコに分注し、新しいフラスコの容量に基づいて追加の完全な増殖培地を追加します。新しいフラスコの通路番号を更新します。
2. 10回の継代後に新しい細胞を解凍して、研究間の遺伝的ドリフトを最小限に抑えます。

4. 同所性腫瘍の誘導のための細胞の調製

1. 調製前に凍結したマトリゲル(基底膜マトリックス抽出物)を4°Cで24時間置き、マトリックス抽出物を液化させます。
2. 研究に必要な細胞の濃度と量を決定します。マウス1匹につき1個×10個⁶ 個の細胞を、1部のチルドPBSと1部のマトリックス抽出物からなる50μLの容量に移植します。
3. ステップ3.1.2で説明されているように、トリプシン化した細胞をペレット化します。細胞ペレットを少なくとも10 mLのPBSに再懸濁して細胞を洗浄し、再度200 × g で5分間遠心分離します。ペレットを500 μLのチルドPBS(細胞ストック)に再懸濁します。
4. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞は高濃度になるため、必要に応じて少量のアリコート(10μLなど)を希釈し、正確な測定が可能になるまで希釈係数を追跡します。
5. 必要な細胞の総数を40 × 10⁶ 細胞/mLに希釈し、その後、等量の冷却マトリックス抽出物を添加して、50μLあたり1×10⁶ 細胞の最終濃度を達成します。
   注:細胞濃度を 表1にまとめます。

5. 同所性腫瘍の誘発

1. 2%イソフルランを使用してマウスを麻酔し、次にそれをノーズコーンに移し、加熱パッド上で0〜3%イソフルランを使用して麻酔の手術面を維持します。角膜反射および/またはつま先の挟み込み反応の欠如により、麻酔の手術面を確認します。眼科用軟膏を目に塗布することにより、角膜の乾燥から保護します。.
2. 70%アルコールワイプで注射部位の近くの皮膚をきれいにし、アルコールが乾くまで数秒待ちます。.乳腺#4で誘導して、原発腫瘍と最も一般的な転移部位(肺および腋窩リンパ節)との間の生物発光イメージングシグナルの重複のリスクを減らします。
   注:乳腺の番号付けは以前に説明されています¹²。簡単に言えば、頭が上を向いている仰臥位のマウスは、インジェクターの右側(マウスの左側)に腺1〜5を持ち、頭に最も近いもの(頸部-腺1)から最も尾側(鼠径腺-腺5)まで下降します。グランド6〜10は、動物の反対側に同様に向けられています。
3. セルストックを上下にピペッティングして、セルを再懸濁します。氷冷した細胞懸濁液50μLを29G針でインスリン注射器に吸引し、すぐに細胞を注入します。すぐに注射できない場合は、シリンジを氷の上に置いてください。
   注意: セルが沈降するのを防ぐために、セルの各ドロー間でピペを上下に動かします。
4. 目的の乳腺の乳首の真下に斜角をマウスの体と平行にその位置に挿入し、細胞を安定したゆっくりとした速度で注入します。注射終了後、針を皮膚内に少なくとも5秒間放置して、マトリゲルを固化させ、漏れを防ぎます。.
5. マウスをウォーミングパッドの上の清潔なケージに移動して回復し、完全に歩行可能になり、胸骨の横臥を維持できるようになるまで監督します。マウスを放置しないでください。マウスを他のマウスと一緒にケージに戻してください。マウスは回復した後で行ってください。

6. 生物発光イメージング(BLI)による腫瘍の増殖と転移発生のモニタリング

注:ここで利用されるMDA-MB-231細胞はルシフェラーゼを発現するため、ルシフェリン基質をマウスに注入すると、イメージングシステムスキャナーによって検出される光信号が生成されます。このモデルでは、腫瘍導入後5〜7週間で転移が予想されます。マウスを週に1〜3回画像化することをお勧めしますが、これは転移が視覚化される正確な瞬間を特定することの重要性によって異なります。

1. 2%イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけ、ルシフェリンを投与する際のマウスの損傷のリスクを最小限に抑えます。.眼科用軟膏を目に塗布することにより、角膜の乾燥から保護します。.
2. 150 mg / kg体重のルシフェリンを各マウスに腹腔内に注入し、マウスを温暖化パッド上のケージに戻して、マウスがルシフェリンを目覚めさせて代謝できるようにします。.監督し、完全に歩行可能になり、胸骨の横臥を維持できるようになるまでマウスを放置しないでください。
   注:投与量の計算に使用される値は、 表1にまとめられています。.
3. ルシフェリンの注射後約10分からイメージングシステムスキャナーを使用してマウスを画像化し、IVISへの移管時間を確保するために必要に応じてマウスを再麻酔します。
   1. 最大5匹のマウスを仰臥位で一緒に画像化し、全身が視野ガイドマーキングに含まれ、できるだけまっすぐに向けられるように注意する必要があります。透明なテープを使用して腕を固定し、腋窩リンパ節の視認性を高めます。一度に複数のマウスをイメージングする場合は、マニホールドディバイダーを使用してマウスを分離し、信号が他のマウスに放射されないようにします。仕切りが利用できない場合は、代わりに光を吸収する紙片を使用します(厚手の黒い厚紙など)。
      注:ルシフェリン代謝の速度はマウスおよび細胞株モデルによって異なり、注射後10分で開始する画像取得では、最も強いシグナルが得られない場合があります。新しい試験の開始時には、ピーク信号強度のタイミングを決定するために、異なる時点での集録を実行することをお勧めします。
   2. BLIの設定で、画像取得用のイメージングシステムソフトウェアを準備します: 露出=自動、ビニング=中、FStop=1、励起=ブロック、放出=オープン、FOV = D、高さ=1.50。
   3. 一般に、原発腫瘍の信号は、 露出 = 自動の設定を使用して、その表面的な位置のために比較的強い信号を生成します。転移をモニタリングする場合は、黒い電気テープを使用して原発腫瘍を慎重に覆い、 手動で曝露 = 300 秒 (またはそれ以上) を設定して、微弱な信号がある場合は取得します。
      注:このモデルでは、下限しきい値が5 × 10³ の輝度に設定されている場合に複数のイメージングセッションで見える原発腫瘍とは別の信号が転移を示していると見なされます。

7. 原発腫瘍の切除

注:原発腫瘍の切除は、転移における縦断的(例えば、治療的)研究にとって重要です。さもなければ、マウスは無制限の原発腫瘍増殖に関連する罹患率に屈する可能性があります。切除時期を決定する際には、原発腫瘍の大きさ(切除時の失血リスク)および潰瘍形成(感染リスク)を考慮する。

1. 原発腫瘍切除の成功を検査するためにBLI信号がないことを考慮する場合は、セクション6で説明されているように術前画像検査を行い、術後に信号がないことを確認します。新たに投与されたルシフェリンを使用して、次の1〜2日以内に切除が成功したことを確認します。
   注:動物への不必要なストレスを避けるために、ルシフェリンの即時再投与は推奨されません。.原発腫瘍切除前に注射されたルシフェリンは、切除が完了しなかった場合にシグナルを検出するのに十分であるべきです。
2. 2%イソフルランを使用してマウスを麻酔し、次にそれをノーズコーンに移し、加熱パッド上で0〜3%イソフルランを使用して麻酔の手術面を維持します。角膜反射および/またはつま先の挟み込み反応の欠如により、麻酔の手術面を確認します。
3. 眼科用軟膏を目に塗布することにより、角膜の乾燥から保護します
4. 手順の鎮痛剤として5 mg / kgケトプロフェンを皮下注射します。.
   注:投与量の計算に使用される値は、 表1にまとめられています。.
5. 70%アルコールとベタジン3xを交互にスクラブして、手術領域を準備します。先に進む前に、最終的なベタジンスクラブを乾かします。
6. 滅菌手術用ハサミを使用して、原発腫瘍の上の皮膚を垂直に開きます(吻側-尾側)。潰瘍性皮膚の場合は、原発腫瘍が残らないように、潰瘍性皮膚を完全に取り除くために、潰瘍の側面から開口部を開始します。
7. はさみと鉗子を使用し続けて、カプセル化された腫瘍の周囲の結合組織を慎重に解剖し、皮膚から腫瘤を完全に除去し、残りの腫瘍が再増殖する可能性があるため、その下にある体組織も完全に除去します。
8. 存在する場合は、綿の先端のアプリケーターで圧力を加えて出血を制御します。.
9. 5-0 Vicryl 縫合糸で手術用開口部を閉じます。
   注:縫合が中断されると、マウスが手術部位を悩ませやすいため、創傷の開存性が向上する可能性があります。
10. 動物が完全に歩行できるようになるまで、ウォーミングパッドの上の清潔なケージで回復させます。動物をケージに戻すときは、湿らせた食べ物をホームケージの底に置きます。
11. 手術後少なくとも2日間、5 mg / kgケトプロフェンを1日1回皮下注射します。.これらの時間に傷の健康状態を確認してください。

8. ナノドラッグの送達

1. ナノ薬物の投与量は体重に基づいているため、マウスの体重を量ります。
2. 2%イソフルランを使用してマウスを麻酔し、次にそれをノーズコーンに移し、加熱パッド上で0〜3%イソフルランを使用して麻酔の手術面を維持します。角膜反射および/またはつま先の挟み込み反応の欠如により、麻酔の手術面を確認します。
   注:あるいは、ナノ薬物は、拘束された覚醒マウスに投与することができる。後続の手順はすべて同じです。
3. 29 G針でインスリン注射器を準備し、10 mgのFeナノドラッグ/ kgマウス体重をマウス体重で使用します。
4. 動物の尾を温水(30〜35°C)に30秒間沈めて、尾静脈を拡張します。
5. テールから余分な水分を拭き取り、70%アルコールワイプで注入部位を清掃します。
6. 針を尾の約半分の側尾静脈に挿入し、プランジャーを少し引き戻して、針への血液のフラッシュバックで配置を確認します。必要に応じて、針を少し前方に動かすか、より表面的な深さに動かして、配置を成功させます。
7. 挿入が成功したら、ナノドラッグを約5〜10秒のゆっくりとした速度で着実に注入し、40μLの注射を行います。注入部位近くの尾の皮膚の下に溶液が溜まっていないことと、静脈が黒ずむこと(暗いナノ粒子溶液から)により、注入が成功したことを確認します。
   注:投与量の計算に使用される値は、 表1にまとめられています。.凝集したナノ粒子製剤は、肺に塞栓することがあります。注射直後に呼吸困難が観察された場合は、マウスで胸骨圧迫を穏やかに行ってください。すぐに行動を起こすことで、この起こりうる問題から動物を成功裏に回復させることができます。
8. 注射部位をガーゼで押さえて針を抜き、出血が止まるまで約30秒間圧力を保ちます。.
9. 動物が完全に歩行できるようになるまで、ウォーミングパッドの上の清潔なケージで回復させます。

9. 解析のための転移の採取

1. セクション6で説明したように、BLIによるマウスの画像化。
   注:この研究では、5×10³ の輝度が転移の指標と考えられており、一般的に5〜7週間で観察されます。転移までの時間にはマウス間でわずかなばらつきが予想されます。
2. イメージングの直後に、重い(5%)イソフルランの下で子宮頸部脱臼によってマウスを犠牲にします。解剖する前に、角膜反射の欠如および/またはつま先の挟み込み反応による死亡を確認します。
3. 転移を慎重に収集します。リンパ節転移は、拡大し、カプセル化された腫瘤として現れます。肺転移は一般に肺実質全体に分布します。したがって、肺全体を採取します。
4. 採取した組織をペトリ皿にセットし、イメージングシステムを用いて画像化することにより、生物発光(ルシフェラーゼ発現がん細胞の存在を示す)と蛍光(ナノ薬物の蓄積を示す)を確認します。手順6.3.2で説明したのと同じBLI取得設定を使用します。FLI取得設定は、 露出 = 自動、ビニング = 中、FStop = 1、励起 = 675、放出 = 720(Cy5.5色素のデフォルトプログラム)、ランプレベル = 高、FOV = D、高さ1.50です。マウスの死骸を画像化して、収集する価値のあるがん組織が残っているかどうかを判断します。
5. PBSでがん組織をすすぎます。
6. 顕微鏡検査やqRT-PCRのために組織を採取するには、OCTに埋め込み、処理の準備が整うまで-80°Cで保存します。
7. 誘導結合プラズマ発光分光法(ICP-OES)で組織を採取するには、空の1.7 mLチューブを使用してスケールを風袋引きし、組織をチューブに入れて重量を記録します。ティッシュを凍結し、処理の準備ができるまで-80°Cで保存します。

10. 蛍光顕微鏡によるナノドラッグデリバリーの検証

1. OCTに包埋した新鮮凍結サンプルを厚さ10 μmの顕微鏡スライド上に凍結切片します。チャンバーと検体ホルダーの温度は、組織の種類に合わせて調整してください。-20°Cから-15°Cの間の設定は、肺組織とリンパ組織の両方に適しています。
2. 切片またはスライド全体を4%パラホルムアルデヒド溶液に15分間浸すことにより、組織切片をスライドに固定します。PBSで注意深くすすいでください。
3. カバースリップをスライドに取り付けます。組織構造の視覚化には、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む培地を使用します。
4. 蛍光顕微鏡を使用して、ナノ薬物送達を示すCy5.5(励起683 nm/発光703 nm)の切片を検査します。ネガティブコントロールサンプル(注射されていない動物の組織)を使用して、シグナルがバックグラウンドではないことを確認します。

11. 誘導結合プラズマ発光分光法(ICP-OES)によるナノドラッグデリバリーの検証

1. -80°Cで保存したサンプルを15 mLのコニカルチューブに移し、キャップを取り外した状態でオーブンで37°Cでインキュベートして乾燥させます。
   注:このプロセスは、MDA-MB-231転移サンプルに24時間かかりましたが、サンプルのサイズと水分含有量によっては数日かかる場合があります。
2. 天びんを使用して乾燥重量を記録します。
3. 2 mLの70%トレースHNO₃ を容器に加え、サンプルをマイクロ波分解します。この研究で使用されたパラメータは、 電力 = 1030 - 1800 W、ランプ時間 = 20:00 - 25:00、ホールド時間 = 15:00、温度 = 200 °C、冷却 = 30 分です。
   注意: 硝酸と硝酸を加熱するときに発生する煙は非常に腐食性が高いため、硝酸を扱うときは注意してください。作業は、白衣、ゴーグル/フェイスシールド、酸性作業に対応した手袋などの完全な個人用保護具を備えた換気の良いスペースで完了する必要があります。ここで使用される少量と長時間の冷却は、リスクを多少最小限に抑えますが、常に注意を払う必要があります。
4. 分解したサンプルを金属を含まない円錐管に移します。その後、300μLを新しいチューブに移します。9.7 mLの超純水を使用して10 mLに希釈すると、HNO₃ 濃度が3%(v / v)になります。
5. 3% HNO₃ (v/v) および超純水中に 1000、100、10、1、0.1、0 μg Fe/mL の濃度で、個々の元素 Fe 標準試料を調製します。超純水中の3% HNO₃ (v/v)中に1 μg/mLの濃度で、個々の元素Y内部標準液を調製します。
6. ICP-OESを使用してサンプルを分析します。軸方向モードと半径方向モードの両方で、鉄含有量の分析に次の輝線を選択します。内部標準化に使用されるFe(234.350 nm)、Fe(238.204 nm)、Fe(259.940 nm)、およびY(371.029 nm)。
7. 結果を入力に使用したサンプルの量に正規化して、組織の μg Fe/g を計算します。

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結果

私たちの以前の治療in vivo研究では、マウスをナノドラッグ(10 mg Feナノドラッグ/ kgマウス体重)を毎週1回投与して数週間治療しました^3,7,8。このデモンストレーションでは、1回の投与後、1週間後の肺転移にナノ薬物の蓄積が観察されるかどうかを検討しました。この研究の結果は、将来の縦...

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ディスカッション

ナノ粒子は、がん治療に大きな可能性を秘めています。ここでは、Cy5.5標識MNPキャリアががん組織に到達し、転移性乳がんのマウスモデルにおいて治療用オリゴヌクレオチドを送達できることを示しました。ナノ薬物を全身的に投与しながら、がん組織にかなりの蓄積を達成できる能力は、局所投与や侵襲的な投与を必要とする多くの既存のASO送達方法に比べて大き?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 5800 ICP-OES	Agilent	5800 ICP-OES	For ICP-OES
Ammonium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	458680025	For nanodrug synthesis
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	For tumor resection
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	For tumor resection
Crile Hemostats - Straight	F.S.T.	13004-14	For tumor resection
Cy5.5-NHS ester	Abcam	ab146455	For nanodrug synthesis
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	For cell culture of MDA-MB-231
Eclipse 50i Clinical Microscope	Nikon	50i-B	For imaging of cryosections
Epichlorohydrin	Thermo Fisher Scientific Inc	117780250	For nanodrug synthesis
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	For tumor resection and metastasis dissection
Fe standard	Inorganic Ventures	CGFE1-500ML	For ICP-OES
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	For cell culture of MDA-MB-231
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	For tumor resection and metastasis dissection
Flask (T-75)	Corning	430641U	For cell culture of MDA-MB-231
HNO3 nitric acid (70%, trace metal grade)	Fisher Chemical	A509P212	For ICP-OES
Insulin syringe 1 CC 29 G x 1/2"	Becton, Dickinson	324704	For tumor implant
Isoflurane	Covetrus	11695067772	For mouse anesthetization
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	For mouse anesthetization
Isopropyl alcohol (70%) wipe	Cardinal	MW-APL	For tumor resection
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	For bioluminescence imaging
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	For bioluminescence imaging
Ketofen (ketoprofen)	Zoetis	10004031	For tumor resection
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
MARS 6 microwave digestion system	CEM	MARS 6	For ICP-OES
Matrigel, growth factor-reduced	Corning	354230	For tumor implant of MDA-MB-231
MDA-MB-231-luc-D3H2LN	PerkinElmer/Revvity	119369	For mouse model of spontaneous metastasis
Metal-free polypropylene 15 mL conical tubes	Labcon	31343450019	For ICP-OES
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	DOT Scientific	RN1700-GMT	For metastasis sample collection
N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP)	Thermo Fisher Scientific Inc	21857	For nanodrug synthesis
PBS	Gibco	14190-144	For cell culture and tumor implant of MDA-MB-231
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture of MDA-MB-231
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	For tumor resection
Sodium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	3728-70	For nanodrug synthesis
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	For metastasis sample collection
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	For metastasis sample collection
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific Inc	T2556	For nanodrug synthesis
Trypsin, 0.25%	Gibco	25200-056	For cell culture of MDA-MB-231
Vicryl PLUS (Antibacterial) violet 27" RB-1 taper	Ethicon	VCP303H	For tumor resection