Мониторинг накопления нанопрепаратов в метастазах рака молочной железы у мышей

Резюме

В данной статье мы описываем протокол in vivo доставки магнитных наночастиц оксида железа, несущих РНК-олигомеры, к метастатическому раку молочной железы на животных моделях, обеспечивая клинически жизнеспособный подход к терапевтическому подавлению онкогенных нуклеиновых кислот.

Аннотация

Метастатический рак молочной железы является разрушительным заболеванием с очень ограниченными терапевтическими возможностями, требующим новых терапевтических стратегий. Было показано, что онкогенные микроРНК связаны с метастатическим потенциалом рака молочной железы и участвуют в миграции, инвазии и жизнеспособности опухолевых клеток. Тем не менее, может быть трудно доставить молекулу ингибирующей РНК в интересующую ткань. Чтобы решить эту проблему и доставить активные антисмысловые олигонуклеотиды в опухоли, мы использовали магнитные наночастицы оксида железа в качестве платформы для доставки. Эти наночастицы нацелены на ткани с повышенной проницаемостью сосудов, такие как места воспаления или рака. Доставка этих наночастиц может контролироваться in vivo с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) благодаря их магнитным свойствам. Внедрение этого терапевтического подхода в клинику будет более доступным благодаря его совместимости с этим актуальным методом визуализации. Они также могут быть помечены другими репортерами визуализации, такими как оптический краситель ближнего инфракрасного диапазона Cy5.5 для корреляционной оптической визуализации и флуоресцентной микроскопии. В данной работе мы демонстрируем, что наночастицы, меченные Cy5.5 и конъюгированные с терапевтическими олигомерами, нацеленными на онкогенную микроРНК-10b (называемую MN-anti-miR10b или «нанопрепаратом»), вводимые внутривенно, накапливаются в метастатических центрах, открывая возможность для терапевтического вмешательства при метастатическом раке молочной железы.

Введение

Несмотря на многие достижения в лечении рака молочной железы, клинические возможности лечения метастатического заболевания остаются ограниченными. Пациенты обычно получают терапию, направленную против драйверов, идентифицированных в первичной опухоли, таких как эстроген или HER2, но эти драйверы не всегда сохраняются в метастазах, что делает терапию^{неэффективной}. Другие системные методы лечения, такие как химиотерапия, неспецифичны и известны своими побочными эффектами. Чтобы разработать эффективные варианты лечения метастатического рака молочной железы, важно учитывать биологические факторы, которые позволяют раковым клеткам распространяться и колонизировать отдаленные участки. Одним из таких драйверов является miR-10b, онкогенная микроРНК, участвующая в жизнеспособности, инвазии и миграции клеток рака молочной железы, которая, как было показано, достаточна для придания метастатического ^{потенциала клеткам} рака молочной железы, которые в противном случае не метастазировали. Важно отметить, что miR-10b также экспрессируется на более высоких уровнях в метастазах по сравнению с соответствующими первичными опухолями4^, что делает его перспективной мишенью для лечения существующих метастазов.

Несмотря на то, что микроРНК, такие как miR-10b, обладают большим потенциалом в качестве терапевтических мишеней для лечения метастатического заболевания, разработка терапевтически жизнеспособных методов сайленсинга микроРНК представляет собой уникальную проблему. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО), которые связываются с их комплементарной последовательностью микроРНК, обычно переносятся в клетки in vitro с помощью липофектии, но не могут легко достичь опухолевых клеток in vivo из-за присущей им нестабильности, риска разрушения нуклеазами, короткого периода полувыведения крови и неспособности проникать в клетки из-за отталкивания заряда.. Для решения этих проблем мы разработали клинически применимый носитель для биомолекул с использованием магнитных наночастиц оксида железа (MNP^{) с} покрытием из декстрана6. Аминогруппы на наночастице позволяют конъюгировать олигонуклеотиды, флуоресцентные красители (например, Cy5.5) и нацеливаться на фрагменты. Кроме того, сердцевина из оксида железа позволяет in vivo контролировать доставку автомобиля с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Мы конъюгировали анти-miR-10b заблокированную нуклеиновую кислоту ASO и Cy5,5 с MNP для создания «нанопрепарата», обозначенного как MN-anti-miR10b, изображенного на рисунке 1⁷.

В наших предыдущих исследованиях мы показали, что нанопрепарат эффективно вызывает подавление miR-10b и ингибирует миграцию и инвазию клеток трижды негативного рака молочной железы in vitro 7. В мышиных моделях метастатического рака молочной железы внутривенное введение нанопрепарата предотвращало развитие метастазов в лимфатических узлах или, в случае введения после образования метастазов в лимфатических узлах, останавливало их рост⁷. Примечательно, что было замечено, что нанопрепарат легко накапливается в раковых тканях. Несмотря на то, что нанопрепарат не уничтожал метастазы сам по себе, в последующих исследованиях мы показали, что комбинированное лечение адъювантным доксорубицином было излечивающим как у иммунокомпрометированных, так и у иммунокомпетентных мышиных моделей ^3,8. Эффекты ингибирования miR-10b нанопрепаратом также были замечены при карциноме молочной железы кошек⁹.

Для эффективного лечения рака молочной железы крайне важно продемонстрировать, что препарат накапливается в представляющих интерес тканях. В данной работе мы представляем протокол для демонстрации накопления носителя магнитных наночастиц, используемого для доставки терапевтических анти-miR-10b ASO в раковые ткани с использованием нескольких модальностей на мышиных моделях метастатического рака молочной железы.

протокол

Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию (IACUC) Мичиганского государственного университета утвердил все процедуры, связанные с животными. Значения для расчетов сведены в таблицу 1.

1. Основные этапы синтеза MN-анти-miR10b

Примечание: Детали синтеза MN-анти-miR10b были описаны ранее ^9,10,11.

1. Подготовьте ядро магнитных наночастиц (MN) методом совместного осаждения.
2. Сшивайте и аминируйте полученные наночастицы с помощью гидроксида натрия, эпихлоргидрина и гидроксида аммония.
3. Конъюгируйте эфир Cy5.5-NHS с MN через гетеробифункциональный сшивающий агент N-сукцинимидил 3-[2-пиридилдитио]-пропионат (SPDP) для получения MN-Cy5.5 для обеспечения флуоресцентной визуализации и микроскопии.
4. Активируйте нуклеиновую кислоту, заблокированную анти-miR-10b, с помощью 3% трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) и конъюгата с MN-Cy5,5 с получением MN-анти-miR10b.
5. Провести характеризацию конъюгата для определения содержания железа (методом анализа железа), количества молекул Cy5,5 на наночастицу (методом спектрофотометрии) и количества конъюгированного LNA (методом электрофореза в агарозном геле).

2. Приобретайте животных для изучения

1. Заранее наметьте план исследования, чтобы спланировать экспериментальные группы и количество животных в группе. Содержать до 5 мышей в одной клетке. Если во время лечения используется несколько клеток по 5 мышей, обязательно держите контрольных и экспериментальных мышей в каждой клетке, чтобы удалить клетку как вмешивающуюся переменную.
2. Заводят мышей в возрасте 6-7 недель. Дайте не менее 1 недели на акклиматизацию к условиям содержания до индукции ортотопических опухолей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры с использованием модели спонтанного метастазирования рака молочной железы MDA-MB-231 (человеческая клеточная линия) описаны ниже. Для этой модели обычно используются атимические обнаженные мыши (Foxn1^nu/Foxn1^nu). Могут быть использованы другие совместимые линии мышей с ослабленным иммунитетом, и эти процедуры также применимы к моделям аллотрансплантатов у иммунокомпетентных мышей (например, клетки рака молочной железы 4T1 у мышей BALB/c).

3. Культуральные клетки

1. Дополните модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином (полноценная питательная среда) для выращивания клеток MDA-MB-231, экспрессирующих люциферазу (например, MDA-MB-231-luc-D3H2LN). Выращивайте клетки в асептических условиях при 37 °C с 5%_CO2 и влажностью 95%, как правило, в колбе T75. Если опухоль заморожена, разморозьте клетки и пассаж хотя бы один раз перед имплантацией опухоли. Запишите номер прохода на колбе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании предварительно замороженный флакон с 1 × 10⁶ ячейками был разморожен и дважды пропущен перед использованием.
   1. Для прохождения необходимо применять 0,25% трипсин в течение 3 мин при 37 °C для трипсинизации клеток с конфлюенсацией <80%. Добавьте в 4 раза больше полной питательной среды, чтобы нейтрализовать трипсин.
   2. Центрифугировать суспензию при 200 × г в течение 5 мин в конической пробирке. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл полной питательной среды после сцеживания надосадочной жидкости. Аликвотируйте часть ячеек в новую колбу и добавьте дополнительную полноценную питательную среду исходя из объема новой колбы. Обновите номер прохода на новой колбе.
2. Размораживание новых клеток после 10 пассажей, чтобы свести к минимуму генетический дрейф в исследованиях.

4. Подготовка клеток к индукции ортотопических опухолей

1. Поместите замороженный Матригель (матричный экстракт базальной мембраны) при температуре 4 °C на 24 часа перед приготовлением, чтобы матричный экстракт успел разжижаться.
2. Определите концентрацию и объем клеток, необходимых для исследования. Имплантируйте мышам 1 × 10⁶ клеток на мышь в объеме 50 μл, состоящем из 1 части охлажденного PBS и 1 части матричного экстракта.
3. Гранулируйте трипсинизированные клетки, как описано в шаге 3.1.2. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в не менее 10 мл PBS для промывания клеток, затем снова центрифугируйте при 200 × г в течение 5 минут. Ресуспендируйте гранулу в 500 μл охлажденного PBS (клеточного материала).
4. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Поскольку клетки будут иметь высокую концентрацию, разбавляйте небольшую аликвоту (например, 10 мкл) по мере необходимости, отслеживая фактор разбавления до тех пор, пока не будут проведены точные измерения.
5. Разбавьте необходимое общее количество клеток до 40 × 10⁶ клеток/мл, затем добавьте равный объем охлажденного матричного экстракта до достижения конечной концентрации 1 × 10⁶ клеток на 50 мкл. Держите на льду, чтобы предотвратить затвердевание экстракта перед имплантацией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации клеток обобщены в таблице 1.

5. Индукция ортотопических опухолей

1. Обезболите мышь с помощью 2% изофлурана, а затем перенесите ее на носовой конус, поддерживая операционную плоскость анестезии с помощью 0-3% изофлурана на грелке. Подтвердите операционную плоскость анестезии по отсутствию роговичного рефлекса и/или реакции на защемление пальца ноги. Защитите от пересыхания роговицы, нанеся на глаза офтальмологическую мазь.
2. Очистите кожу рядом с местом инъекции салфеткой с 70% содержанием спирта и дайте несколько секунд спирту высохнуть. Индуцировать в молочной железе #4 для снижения риска перекрытия сигналов биолюминесцентной визуализации между первичной опухолью и наиболее распространенными местами метастазирования (легкими и подмышечными лимфатическими узлами).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нумерация молочных желез была описана ранее¹². Вкратце, мышь в лежачем положении с направлением головы вверх будет иметь железы с 1 по 5 с правой стороны инжектора (слева от мыши), начиная от ближайшей к голове (шейная - железа 1) и спускающаяся к самой хвостовой (паховая - железа 5). Железы от 6 до 10 ориентированы одинаково с противоположной стороны животного.
3. Пипетируйте клеточный запас вверх и вниз, чтобы снова суспендировать клетки. Наберите 50 μл суспензии ледяных клеток в инсулиновый шприц с помощью иглы 29 G и немедленно введите клетки. Держите шприц на льду, если вы не можете сделать инъекцию немедленно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетируйте вверх и вниз между каждым забором клеток, чтобы предотвратить их оседание.
4. Вставьте скос непосредственно под сосок нужной молочной железы параллельно телу мыши в этом месте и вводите клетки с равномерной, медленной скоростью. Оставьте иглу на коже не менее чем на 5 секунд после завершения инъекции, чтобы Матригель затвердел и предотвратил утечку.
5. Переместите мышь в чистую клетку на грелку для восстановления и наблюдайте за ней до тех пор, пока она полностью не станет амбулаторной и не сможет поддерживать лежачее положение грудины. Не оставляйте мышь без присмотра. Возвращайте мышь в клетку с другими мышами только после того, как она восстановится.

6. Мониторинг роста опухоли и развития метастазов с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI)

Примечание: Поскольку используемые здесь клетки MDA-MB-231 экспрессируют люциферазу, инъекция субстрата люциферина мышам будет производить оптический сигнал, обнаруженный сканером системы визуализации. В этой модели метастазы можно ожидать через 5-7 недель после индукции опухоли. Рекомендуется визуализировать мышей 1-3 раза в неделю, в зависимости от важности выявления точного момента, когда визуализируются метастазы.

1. Обезболите мышей с помощью 2% изофлурана, чтобы свести к минимуму риск травмирования мыши при введении люциферина. Защитите от пересыхания роговицы, нанеся на глаза офтальмологическую мазь.
2. Введите 150 мг/кг массы тела люциферина внутрибрюшинно каждой мыши и верните мышей в клетку на согревающей подушке, чтобы мыши могли проснуться и метаболизировать люциферин. Наблюдайте и не оставляйте мышей без присмотра до тех пор, пока они полностью не амбулаторно не смогут поддерживать лежачее состояние грудины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения, используемые для расчета дозирования, сведены в Таблицу 1.
3. Визуализируйте мышей с помощью сканера системы визуализации, начиная примерно через 10 минут после инъекции люциферина, повторно обезболив мышей при необходимости, чтобы дать время для перевода в IVIS.
   1. Представьте до 5 мышей вместе в лежачем положении, следя за тем, чтобы все их тела были включены в поле зрения направляющей маркировки и ориентированы как можно прямее. Используйте прозрачный пластырь, чтобы зафиксировать свои руки для лучшей визуализации подмышечных лимфатических узлов. Если вы визуализируете несколько мышей одновременно, используйте многообразные делители, чтобы разделить мышей, чтобы предотвратить передачу сигналов другим мышам. Если разделителей нет, используйте вместо них полоски светопоглощающей бумаги (например, плотный черный картон).
      Скорость метаболизма люциферина варьируется в зависимости от модели мышей и клеточных линий, и получение изображения, начинающееся через 10 минут после инъекции, может не дать самого сильного сигнала. В начале нового исследования рекомендуется проводить сбор данных в разные моменты времени для определения времени пиковой интенсивности сигнала.
   2. Подготовьте программное обеспечение системы обработки изображений для получения изображений со следующими настройками BLI: Экспозиция = Авто, Объединение = Средний, FStop = 1, Возбуждение = Блок, Излучение = Открытый, FOV = D, Высота = 1,50.
   3. Как правило, первичные опухолевые сигналы будут давать относительно сильный сигнал из-за их поверхностного расположения при использовании настройки Exposure = Auto. При мониторинге метастазов используйте черную изоленту, чтобы тщательно закрыть первичную опухоль, и вручную установите Exposure = 300 s (или более) для получения слабых сигналов, если они есть.
      Примечание: В этой модели сигнал, отделенный от первичной опухоли, который виден в течение нескольких сеансов визуализации, когда нижний порог установлен на уровне излучения 5 × 10³ , считается признаком метастазирования.

7. Резекция первичных опухолей

ПРИМЕЧАНИЕ: Резекция первичных опухолей важна для лонгитюдных (например, терапевтических) исследований в метастазах; В противном случае мыши могут стать жертвами заболеваемости, связанной с неограниченным ростом первичной опухоли. Учитывайте размер первичной опухоли (риск кровопотери при резекции) и изъязвление (риск инфекции) при определении времени резекции.

1. Если вы считаете отсутствие сигнала BLI для проведения теста на успешную первичную резекцию опухоли, выполните предоперационную визуализацию, как описано в разделе 6, и убедитесь, что после операции сигнал отсутствует. Подтвердите успешную резекцию в течение следующих 1-2 дней с помощью только что введенного люциферина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленное повторное введение люциферина не рекомендуется, чтобы избежать ненужного стресса для животного. Люциферин, введенный перед первичной резекцией опухоли, должен быть достаточным для обнаружения сигнала, если резекция не была полной.
2. Обезболите мышь с помощью 2% изофлурана, а затем перенесите его на носовой конус, поддерживая операционную плоскость анестезии с помощью 0-3% изофлурана на грелке. Подтвердите хирургическую плоскость анестезии по отсутствию роговичного рефлекса и/или реакции на защемление пальца ноги.
3. Защитите от пересыхания роговицы, нанеся на глаза офтальмологическую мазь
4. Введите 5 мг/кг кетопрофена подкожно в качестве обезболивания для процедуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения, используемые для расчета дозирования, сведены в Таблицу 1.
5. Подготовьте операционную область, чередуя скрабы из 70% спирта и бетадина 3 раза. Дайте окончательному скрабу бетадина высохнуть, прежде чем продолжить.
6. С помощью стерильных хирургических ножниц вскройте кожу над первичной опухолью по вертикали (рострально-каудально). В случае изъязвления кожи начните открывать его в сторону изъязвления, чтобы не оставить первичную опухоль и полностью удалить изъязвленную кожу.
7. Продолжайте использовать ножницы и щипцы для тщательного рассечения соединительной ткани вокруг инкапсулированной опухоли, чтобы полностью удалить массу с кожи, а также с подлежащих тканей тела, поскольку любая оставшаяся опухоль может вырасти снова.
8. Если оно присутствует, остановите кровотечение, надавливая аппликатором с ватным наконечником.
9. Закройте хирургическое отверстие шовным материалом 5-0 Vicryl.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прерванное наложение швов может привести к улучшению проходимости раны, так как мыши склонны беспокоить место операции.
10. Дайте животному восстановиться в чистой клетке на грелке до полной амбулатории. Поместите увлажненный корм на дно домашней клетки при возвращении животного в клетку.
11. Вводите 5 мг/кг кетопрофена подкожно один раз в сутки в течение не менее 2 дней после операции. В это время проверяйте состояние раны.

8. Доставка нанолекарств

1. Взвешивание мышей по мере дозировки нанопрепаратов основано на массе тела.
2. Обезболите мышь с помощью 2% изофлурана, а затем перенесите его на носовой конус, поддерживая операционную плоскость анестезии с помощью 0-3% изофлурана на грелке. Подтвердите хирургическую плоскость анестезии по отсутствию роговичного рефлекса и/или реакции на защемление пальца ноги.
   Примечание: В качестве альтернативы, нанопрепарат можно вводить удерживаемой мыши. Все последующие шаги будут такими же.
3. Приготовьте инсулиновый шприц с иглой 29 г с 10 мг нанопрепарата Fe/кг массы тела мыши.
4. Погрузите хвост животного в теплую воду (30-35 °C) на 30 с, чтобы расширить хвостовые жилки.
5. Вытрите лишнюю воду с хвоста и очистите место инъекции 70% спиртовой салфеткой.
6. Вставьте скос иглы вверх в боковую вену хвоста примерно на полпути вниз по хвосту и слегка оттяните поршень, чтобы подтвердить размещение с эффектом вспышки крови в иглу. При необходимости переместите иглу немного вперед или на более поверхностную глубину, чтобы добиться удачного размещения.
7. После успешного введения нанопрепарат вводите непрерывно с медленной скоростью примерно 5-10 с для инъекции объемом 40 мкл. Подтверждение успешной инъекции может быть подтверждено отсутствием скопления раствора под кожей хвоста вблизи места инъекции и потемнением вены (от темного раствора наночастиц).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения, используемые для расчета дозирования, сведены в Таблицу 1. Комкующиеся составы наночастиц могут эмболизироваться в легкие. Если вскоре после инъекции наблюдается респираторный дистресс, аккуратно выполните компрессии грудной клетки мыши. Немедленные действия всегда приводят к успешному выздоровлению животного от этой возможной проблемы.
8. Удерживайте давление на месте инъекции с помощью марли и извлеките иглу, сохраняя давление примерно 30 с, пока кровотечение не остановится.
9. Дайте животному восстановиться в чистой клетке на грелке до полной амбулатории.

9. Забор метастазов для анализа

1. Представьте себе мышей с помощью BLI, как описано в разделе 6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании яркость 5 × 10³ считается признаком метастазирования и, как правило, наблюдается через 5-7 недель. Следует ожидать небольшой разницы во времени до метастазирования у мышей.
2. Сразу после визуализации принесите мышей в жертву при вывихе шейки матки под действием тяжелого (5%) изофлурана. Перед вскрытием подтвердите смерть из-за отсутствия роговичного рефлекса и/или реакции на защемление пальца ноги.
3. Тщательно соберите метастазы. Метастазы в лимфатические узлы проявляются в виде увеличенного, инкапсулированного образования. Метастазы в легкие, как правило, распространяются по всей паренхиме легких; Следовательно, соберите все легкое.
4. Поместите собранные ткани в чашку Петри и получите изображение с помощью системы визуализации для подтверждения биолюминесценции (указывающей на наличие раковых клеток, экспрессирующих люциферазу) и флуоресценции (указывающей на накопление нанопрепаратов). Используйте те же настройки сбора BLI, которые описаны в шаге 6.3.2. Настройки сбора данных FLI: Экспозиция = Авто, Биннинг = Средний, FStop = 1, Возбуждение = 675 и Излучение = 720 (программа по умолчанию для красителя Cy5.5), Уровень лампы = Высокий, FOV = D, Высота 1.50. Сфотографируйте тушу мыши, чтобы определить, осталась ли раковая ткань, которую стоит собрать.
5. Промойте раковые ткани в PBS.
6. Чтобы собрать ткани для микроскопии или qRT-PCR, внедрите в ОКТ и храните при температуре -80 °C до готовности к обработке.
7. Чтобы собрать ткани для оптической эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-ОЭС), изготовьте весы с помощью пустой пробирки объемом 1,7 мл, поместите ткань в пробирку и запишите ее вес. Заморозьте салфетку и храните при температуре -80 °C до готовности к обработке.

10. Валидация доставки нанолекарств методом флуоресцентной микроскопии

1. Криосекция свежезамороженных образцов, внедренных в ОКТ, на предметные стекла микроскопии толщиной 10 мкм. Отрегулируйте температуру камеры и держателя образца в соответствии с типом ткани. Настройки от -20 °C до -15 °C подходят как для легких, так и для лимфатической ткани.
2. Закрепите срезы ткани на предметных стеклах, погрузив срезы или целые срезы в 4% раствор параформальдегида на 15 минут. Тщательно промойте PBS.
3. Закрепите покровные стекла на предметных стеклах. Используйте среду с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для визуализации архитектуры тканей.
4. С помощью флуоресцентного микроскопа исследуйте срезы на Cy5,5 (возбуждение 683 нм/излучение 703 нм), указывающих на доставку нанолекарств. Убедитесь, что сигнал не является фоновым, используя отрицательный контрольный образец (ткань животного, которому не вводили инъекцию).

11. Валидация доставки нанолекарств методом оптической эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-ОЭС)

1. Переложите образцы, хранящиеся при температуре -80 °C, в коническую пробирку объемом 15 мл и инкубируйте ее в печи со снятой крышкой при температуре 37 °C для сушки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс занял 24 часа для образцов метастазов MDA-MB-231, но может занять несколько дней в зависимости от размера и содержания влаги в образце.
2. Запишите сухой вес с помощью весов.
3. Добавьте в сосуд 2 мл 70% trace HNO₃ и рассортируйте образец в микроволновой печи. В данном исследовании использовались следующие параметры: Мощность = 1030 - 1800 Вт, Время нарастания = 20:00 - 25:00, Время удержания = 15:00, Температура = 200 °C, Охлаждение = 30 мин.
   ВНИМАНИЕ: Соблюдайте осторожность при работе с азотной кислотой, так как она и пары, образующиеся при ее нагревании, очень коррозионны. Работа должна выполняться в хорошо проветриваемом помещении с полным набором средств индивидуальной защиты, таких как лабораторный халат, защитные очки/лицевой щиток и перчатки, совместимые с кислотными работами. Используемые здесь небольшие объемы и длительное охлаждение несколько минимизируют риск, но всегда следует соблюдать осторожность.
4. Переложить переваренные образцы в безметалловые конические пробирки; затем переложите 300 μL в новую пробирку. Разбавьте до 10 мл с использованием 9,7 мл сверхчистой воды, в результате чего концентрация HNO₃ составит 3% (v/v).
5. Приготовьте отдельные стандарты Fe в концентрациях 1000, 100, 10, 1, 0,1 и 0 μг Fe/мл в 3% HNO₃ (v/v) и сверхчистой воде. Приготовьте отдельный элемент Y внутреннего стандарта в концентрации 1 г/мл в 3% HNO₃ (v/v) в ультрачистой воде.
6. Анализируйте образцы с помощью ICP-OES. Для осевой и радиальной мод выберите следующие эмиссионные линии для анализа содержания железа. Fe (234,350 нм), Fe (238,204 нм), Fe (259,940 нм) и Y (371,029 нм), используемые для внутренней стандартизации.
7. Нормализуйте результаты по количеству образца, использованного для расчета μг Fe/г ткани.

Результаты

В наших предыдущих терапевтических исследованиях in vivo мы лечили мышей одной дозой нанопрепарата (10 мг нанопрепарата Fe/кг массы тела мыши) еженедельно в течение нескольких недель ^3,7,8. Для этой демонстрации мы стре...

Обсуждение

Наночастицы обладают большим потенциалом для лечения рака. Здесь мы показали, что Cy5.5-конъюгированный носитель MNP может достигать раковых тканей для доставки терапевтических олигонуклеотидов в мышиной модели метастатического рака молочной железы. Возможность систе...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 5800 ICP-OES	Agilent	5800 ICP-OES	For ICP-OES
Ammonium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	458680025	For nanodrug synthesis
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	For tumor resection
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	For tumor resection
Crile Hemostats - Straight	F.S.T.	13004-14	For tumor resection
Cy5.5-NHS ester	Abcam	ab146455	For nanodrug synthesis
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	For cell culture of MDA-MB-231
Eclipse 50i Clinical Microscope	Nikon	50i-B	For imaging of cryosections
Epichlorohydrin	Thermo Fisher Scientific Inc	117780250	For nanodrug synthesis
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	For tumor resection and metastasis dissection
Fe standard	Inorganic Ventures	CGFE1-500ML	For ICP-OES
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	For cell culture of MDA-MB-231
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	For tumor resection and metastasis dissection
Flask (T-75)	Corning	430641U	For cell culture of MDA-MB-231
HNO3 nitric acid (70%, trace metal grade)	Fisher Chemical	A509P212	For ICP-OES
Insulin syringe 1 CC 29 G x 1/2"	Becton, Dickinson	324704	For tumor implant
Isoflurane	Covetrus	11695067772	For mouse anesthetization
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	For mouse anesthetization
Isopropyl alcohol (70%) wipe	Cardinal	MW-APL	For tumor resection
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	For bioluminescence imaging
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	For bioluminescence imaging
Ketofen (ketoprofen)	Zoetis	10004031	For tumor resection
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
MARS 6 microwave digestion system	CEM	MARS 6	For ICP-OES
Matrigel, growth factor-reduced	Corning	354230	For tumor implant of MDA-MB-231
MDA-MB-231-luc-D3H2LN	PerkinElmer/Revvity	119369	For mouse model of spontaneous metastasis
Metal-free polypropylene 15 mL conical tubes	Labcon	31343450019	For ICP-OES
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	DOT Scientific	RN1700-GMT	For metastasis sample collection
N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP)	Thermo Fisher Scientific Inc	21857	For nanodrug synthesis
PBS	Gibco	14190-144	For cell culture and tumor implant of MDA-MB-231
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture of MDA-MB-231
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	For tumor resection
Sodium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	3728-70	For nanodrug synthesis
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	For metastasis sample collection
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	For metastasis sample collection
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific Inc	T2556	For nanodrug synthesis
Trypsin, 0.25%	Gibco	25200-056	For cell culture of MDA-MB-231
Vicryl PLUS (Antibacterial) violet 27" RB-1 taper	Ethicon	VCP303H	For tumor resection