Monitoraggio dell'accumulo di nanofarmaci nelle metastasi del carcinoma mammario murino

Riepilogo

Qui, descriviamo il protocollo per la somministrazione in vivo di nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro che trasportano oligomeri di RNA al carcinoma mammario metastatico in modelli animali, fornendo un approccio clinicamente valido per il silenziamento terapeutico di acidi nucleici oncogenici.

Abstract

Il carcinoma mammario metastatico è una malattia devastante con opzioni terapeutiche molto limitate, che richiede nuove strategie terapeutiche. È stato dimostrato che i miRNA oncogeni sono associati al potenziale metastatico del cancro al seno e sono implicati nella migrazione, invasione e vitalità delle cellule tumorali. Tuttavia, può essere difficile fornire una molecola di RNA inibitoria al tessuto di interesse. Per superare questa sfida e fornire oligonucleotidi antisenso attivi ai tumori, abbiamo utilizzato nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro come piattaforma di consegna. Queste nanoparticelle prendono di mira i tessuti con una maggiore permeabilità vascolare, come i siti di infiammazione o cancro. La somministrazione di queste nanoparticelle può essere monitorata in vivo mediante risonanza magnetica (MRI) grazie alle loro proprietà magnetiche. La traduzione di questo approccio terapeutico in clinica sarà più accessibile grazie alla sua compatibilità con questa modalità di imaging rilevante. Possono anche essere etichettati con altri reporter di imaging, come un colorante ottico nel vicino infrarosso Cy5.5 per l'imaging ottico correlativo e la microscopia a fluorescenza. Qui, dimostriamo che le nanoparticelle marcate con Cy5.5 e coniugate a oligomeri terapeutici che hanno come bersaglio il miRNA-10b oncogenico (definito MN-anti-miR10b, o "nanofarmaco") somministrate per via endovenosa si accumulano nei siti metastatici, aprendo una possibilità per un intervento terapeutico del carcinoma mammario metastatico.

Introduzione

Nonostante i numerosi progressi nel trattamento del cancro al seno, le opzioni cliniche per la malattia metastatica rimangono limitate. I pazienti ricevono comunemente terapie mirate contro i driver identificati nel tumore primario, come gli estrogeni o HER2, ma questi driver non sono sempre conservati nelle metastasi, rendendo la terapia inefficace¹. Altre terapie sistemiche, come la chemioterapia, sono aspecifiche e note per i loro effetti collaterali. Per sviluppare opzioni efficaci per il trattamento del carcinoma mammario metastatico, è importante considerare i driver biologici che consentono alle cellule tumorali di diffondersi e colonizzare siti distanti. Uno di questi driver è il miR-10b, un microRNA oncogenico, implicato nella vitalità, invasione e migrazione delle cellule del cancro al seno, che ha dimostrato di essere sufficiente a conferire un potenziale metastatico in cellule di carcinoma mammario altrimenti non metastatiche ^2,3. È importante sottolineare che il miR-10b è anche espresso a livelli più elevati nelle metastasi rispetto ai tumori primari appaiati⁴, rendendolo un bersaglio promettente per il trattamento delle metastasi esistenti.

Sebbene i miRNA come il miR-10b abbiano un grande potenziale come bersagli terapeutici per la malattia metastatica, la progettazione di metodi terapeuticamente validi per il silenziamento dei miRNA presenta sfide uniche. Gli oligonucleotidi antisenso (ASO) che legano la loro sequenza complementare di miRNA sono comunemente trasferiti alle cellule in vitro utilizzando la lipofezione, ma non possono raggiungere facilmente le cellule tumorali in vivo a causa dell'instabilità intrinseca, del rischio di distruzione da parte delle nucleasi, della breve emivita del sangue e dell'incapacità di entrare nelle cellule a causa della repulsione carica-carica⁵. Per combattere queste sfide, abbiamo sviluppato un vettore clinicamente applicabile per le biomolecole utilizzando nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro (MNP⁾ rivestite di destrano6. I gruppi amminici sulla nanoparticella consentono la coniugazione di oligonucleotidi, coloranti fluorescenti (ad esempio, Cy5.5) e porzioni mirate. Inoltre, il nucleo in ossido di ferro consente il monitoraggio in vivo della consegna del veicolo utilizzando la risonanza magnetica (MRI). Abbiamo coniugato l'acido nucleico bloccato anti-miR-10b ASO e Cy5.5 a MNP per creare un "nanofarmaco" denominato MN-anti-miR10b, illustrato nella Figura 1⁷.

Nei nostri studi precedenti, abbiamo dimostrato che il nanofarmaco provoca efficacemente la sottoregolazione del miR-10b e inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule di carcinoma mammario triplo negativo in vitro⁷. Nei modelli murini di carcinoma mammario metastatico, la somministrazione endovenosa del nanofarmaco ha impedito lo sviluppo di metastasi linfonodali o, se somministrato dopo la formazione di metastasi linfonodali, ne ha arrestato la crescita⁷. In particolare, è stato osservato che il nanofarmaco si accumula facilmente nei tessuti tumorali. Sebbene il nanofarmaco non abbia eliminato le metastasi da solo, in studi successivi, abbiamo dimostrato che il trattamento combinato con doxorubicina adiuvante era curativo sia in modelli murini immunocompromessi che immunocompetenti ^3,8. Gli effetti dell'inibizione del miR-10b da parte del nanofarmaco sono stati osservati anche nel carcinoma mammario felino⁹.

Per trattare efficacemente il cancro al seno, è imperativo dimostrare che il farmaco si accumula nei tessuti di interesse. Qui, presentiamo un protocollo per dimostrare l'accumulo del vettore di nanoparticelle magnetiche utilizzato per somministrare ASO terapeutici anti-miR-10b ai tessuti tumorali utilizzando molteplici modalità in modelli murini di carcinoma mammario metastatico.

Protocollo

Il Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ha approvato tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali. I valori per i calcoli sono riassunti nella Tabella 1.

1. Passaggi chiave della sintesi di MN-anti-miR10b

NOTA: I dettagli della sintesi di MN-anti-miR10b sono stati descritti in precedenza ^9,10,11.

1. Preparare il nucleo di nanoparticelle magnetiche (MN) con il metodo della co-precipitazione.
2. Reticolare e amminare le nanoparticelle preparate utilizzando idrossido di sodio, epicloridrina e idrossido di ammonio.
3. Coniugare un estere Cy5.5-NHS a MN attraverso il reticolante eterobifunzionale N-succinimidil 3-[2-piridilditio]-propionato (SPDP) per ottenere MN-Cy5.5 per consentire l'imaging a fluorescenza e la microscopia.
4. Attivare l'acido nucleico bloccato anti-miR-10b con il 3% di tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) e coniugarlo a MN-Cy5.5 per produrre il MN-anti-miR10b.
5. Eseguire la caratterizzazione del coniugato per determinare il contenuto di ferro (mediante saggio del ferro), il numero di molecole Cy5.5 per nanoparticella (mediante spettrofotometria) e la quantità di LNA coniugato (mediante elettroforesi su gel di agarosio).

2. Acquisisci gli animali oggetto di studio

1. Delineare lo studio in anticipo per pianificare i gruppi sperimentali e il numero di animali per gruppo. Ospita fino a 5 topi per gabbia. Se durante il trattamento vengono utilizzate più gabbie di 5 topi, assicurarsi di avere topi di controllo e sperimentali all'interno di ciascuna gabbia per rimuovere la gabbia come variabile confondente.
2. Ottenere topi a 6-7 settimane di età. Consentire almeno 1 settimana di acclimatazione alle condizioni di stabulazione prima dell'induzione di tumori ortotopici.
   NOTA: Di seguito sono descritte le procedure che utilizzano il modello MDA-MB-231 (linea cellulare di derivazione umana) di metastasi spontanee del cancro al seno. Per questo modello, i topi nudi atimici (Foxn1^nu/Foxn1^nu) sono comunemente usati. Possono essere utilizzati altri ceppi di topi immunocompromessi compatibili e le procedure sono applicabili anche a modelli di allotrapianto in topi immunocompetenti (ad esempio, cellule di carcinoma mammario 4T1 in topi BALB/c).

3. Cellule di coltura

1. Integrare il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina (terreno di crescita completo) per far crescere le cellule MDA-MB-231 che esprimono luciferasi (ad esempio, MDA-MB-231-luc-D3H2LN). Far crescere le cellule in condizioni asettiche a 37 °C con il 5% di CO₂ e il 95% di umidità, generalmente in un pallone T75. Se congelate, scongelare le cellule e il passaggio almeno una volta prima dell'impianto del tumore. Annotare il numero di passaggio sul pallone.
   NOTA: In questo studio, una fiala precedentemente congelata di 1 × 10⁶ cellule è stata scongelata e fatta passare due volte prima dell'uso.
   1. Per il passaggio, applicare tripsina allo 0,25% per 3 minuti a 37 °C per tripsinizzare le cellule a una confluenza del <80%. Aggiungere un volume 4x di terreno di coltura completo per neutralizzare la tripsina.
   2. Centrifugare la sospensione a 200 × g per 5 minuti in un tubo conico. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno di crescita completo dopo aver travasato il surnatante. Aliquotare una parte delle cellule in un nuovo pallone e aggiungere ulteriore terreno di crescita completo in base al volume del nuovo pallone. Aggiorna il numero di passaggio sulla nuova borraccia.
2. Scongelare nuove cellule dopo 10 passaggi per ridurre al minimo la deriva genetica tra gli studi.

4. Preparazione delle cellule per l'induzione di tumori ortotopici

1. Porre Matrigel congelato (estratto della matrice della membrana basale) a 4 °C per 24 ore prima della preparazione per consentire la liquefazione dell'estratto della matrice.
2. Determinare la concentrazione e il volume delle cellule necessarie per lo studio. Impiantare i topi con 1 × 10⁶ cellule per topo in un volume di 50 μL, composto da 1 parte di PBS refrigerato e 1 parte di estratto della matrice.
3. Pellettare le celle tripsinizzate come descritto al punto 3.1.2. Risospendere il pellet di cellule in almeno 10 mL di PBS per lavare le cellule, quindi centrifugare nuovamente a 200 × g per 5 minuti. Risospendere il pellet in 500 μl di PBS refrigerato (stock di cellule).
4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Poiché le cellule saranno ad alta concentrazione, diluire una piccola aliquota (ad esempio, 10 μL) secondo necessità, tenendo traccia del fattore di diluizione fino a quando non è possibile effettuare misurazioni accurate.
5. Diluire il numero totale richiesto di cellule a 40 × 10⁶ cellule/mL, quindi aggiungere un volume uguale di estratto di matrice refrigerata per ottenere una concentrazione finale di 1 × 10⁶ cellule per 50 μL. Tenere in ghiaccio per evitare che l'estratto si solidifichi prima dell'impianto.
   NOTA: Le concentrazioni cellulari sono riassunte nella Tabella 1.

5. Induzione di tumori ortotopici

1. Anestetizzare un topo usando isoflurano al 2% e poi trasferirlo su un cono nasale, mantenendo il piano chirurgico dell'anestesia utilizzando isoflurano allo 0-3% su un termoforo. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia in base alla mancanza di riflesso corneale e/o alla risposta al pizzicamento delle dita dei piedi. Proteggere dall'essiccazione corneale applicando un unguento oftalmico sugli occhi.
2. Pulisca la pelle vicino al sito di iniezione con una salvietta imbevuta di alcol al 70% e lasci asciugare l'alcol per alcuni secondi. Indurre alla ghiandola mammaria #4 per ridurre il rischio di sovrapposizione dei segnali di imaging a bioluminescenza tra il tumore primario e i siti più comuni di metastasi (polmone e linfonodi ascellari).
   NOTA: La numerazione della ghiandola mammaria è stata descritta in precedenza¹². In breve, un topo in posizione supina con la testa orientata verso l'alto avrà ghiandole da 1 a 5 sul lato destro dell'iniettore (sinistra del topo) a partire dalla più vicina alla testa (cervicale - ghiandola 1) e scendendo fino alla più caudale (inguinale - ghiandola 5). Le ghiandole da 6 a 10 sono orientate in modo simile sul lato opposto dell'animale.
3. Pipettare il materiale cellulare su e giù per risospendere le cellule. Aspirare 50 μl di sospensione cellulare ghiacciata in una siringa da insulina con un ago da 29 G e iniettare immediatamente le cellule. Tenere la siringa sul ghiaccio se non è possibile iniettarla immediatamente.
   NOTA: Puntate su e giù tra ogni estrazione di celle per evitare che le celle si depositino.
4. Inserire lo smusso direttamente sotto il capezzolo della ghiandola mammaria desiderata parallelamente al corpo del topo in quella posizione e iniettare le cellule a una velocità costante e lenta. Lasciare l'ago all'interno della pelle per almeno 5 s dopo il completamento dell'iniezione per consentire al Matrigel di solidificarsi e prevenire perdite.
5. Spostare il mouse in una gabbia pulita su un cuscinetto riscaldante per il recupero e supervisionare fino a quando non è completamente deambulante e in grado di mantenere la decubito sternale. Non lasciare il mouse incustodito. Rimetti il topo nella sua gabbia con altri topi solo dopo che si è ripreso.

6. Monitoraggio della crescita tumorale e dello sviluppo di metastasi con l'imaging a bioluminescenza (BLI)

NOTA: Poiché le cellule MDA-MB-231 utilizzate qui esprimono luciferasi, l'iniezione di substrato di luciferina nei topi produrrà un segnale ottico rilevato dallo scanner del sistema di imaging. In questo modello, ci si può aspettare metastasi a 5-7 settimane dopo l'induzione del tumore. Si consiglia di visualizzare i topi 1-3 volte a settimana, a seconda dell'importanza di identificare il momento esatto in cui vengono visualizzate le metastasi.

1. Anestetizzare i topi usando isoflurano al 2% per ridurre al minimo il rischio di lesioni al topo durante la somministrazione di luciferina. Proteggere dall'essiccazione corneale applicando un unguento oftalmico sugli occhi.
2. Iniettare 150 mg/kg di peso corporeo di luciferina per via intraperitoneale in ciascun topo e riportare i topi nella loro gabbia su un cuscinetto riscaldante per consentire ai topi di risvegliarsi e metabolizzare la luciferina. Supervisionare e non lasciare i topi incustoditi fino a quando non sono completamente deambulanti e in grado di mantenere la decubito sternale.
   NOTA: I valori utilizzati per i calcoli del dosaggio sono riassunti nella Tabella 1.
3. Visualizzare i topi utilizzando lo scanner del sistema di imaging a partire da circa 10 minuti dopo l'iniezione di luciferina, anestetizzando nuovamente i topi quando necessario per consentire il tempo per il trasferimento all'IVIS.
   1. Riprendi fino a 5 topi insieme in posizione supina, facendo attenzione a garantire che tutto il loro corpo sia incluso nelle marcature della guida del campo visivo e orientato il più dritto possibile. Usa del nastro adesivo trasparente per fissare le braccia per una migliore visualizzazione dei linfonodi ascellari. Se si esegue l'imaging di più topi contemporaneamente, utilizzare divisori multipli per separare i topi per evitare che i segnali si irradino su altri topi. Se i divisori non sono disponibili, utilizzare al loro posto strisce di carta che assorbono la luce (ad esempio, cartoncino spesso e nero).
      NOTA: I tassi di metabolismo della luciferina variano tra i modelli murini e cellulari e l'acquisizione delle immagini a partire da 10 minuti dopo l'iniezione potrebbe non produrre il segnale più forte. Si raccomanda che, all'inizio di un nuovo studio, vengano eseguite acquisizioni in diversi punti temporali per determinare la tempistica per l'intensità del segnale di picco.
   2. Preparare il software del sistema di imaging per l'acquisizione delle immagini con le seguenti impostazioni per BLI: Esposizione = Auto, Binning = Medio, FStop = 1, Eccitazione = Blocco, Emissione = Aperto, FOV = D, Altezza = 1,50.
   3. Generalmente, i segnali del tumore primario produrranno un segnale relativamente forte a causa della loro posizione superficiale utilizzando l'impostazione Esposizione = Auto. Se si monitorano le metastasi, utilizzare del nastro isolante nero per coprire accuratamente il tumore primario e impostare manualmente l'esposizione = 300 s (o più) per acquisire segnali deboli se presenti.
      NOTA: In questo modello, un segnale separato dal tumore primario che è visibile in più sessioni di imaging quando la soglia inferiore è impostata su 5 × 10³ radianza è considerato indicativo di metastasi.

7. Resezione dei tumori primari

NOTA: La resezione dei tumori primari è importante per gli studi longitudinali (ad esempio, terapeutici) sulle metastasi; In caso contrario, i topi potrebbero soccombere alla morbilità correlata alla crescita illimitata del tumore primario. Considerare le dimensioni del tumore primario (rischio di perdita di sangue durante la resezione) e l'ulcerazione (rischio di infezione) nel determinare il tempo di resezione.

1. Se si considera l'assenza di segnale BLI per verificare il successo della resezione del tumore primario, eseguire l'imaging pre-operatorio come descritto nel paragrafo 6 e confermare che non vi sia alcun segnale dopo l'intervento chirurgico. Confermare l'esito positivo della resezione entro i prossimi 1-2 giorni utilizzando la luciferina appena somministrata.
   NOTA: La risomministrazione immediata di luciferina non è raccomandata per evitare stress inutili all'animale. La luciferina iniettata prima della resezione primaria del tumore dovrebbe essere sufficiente per rilevare il segnale se la resezione non era completa.
2. Anestetizzare il topo con isoflurano al 2% e poi trasferirlo su un cono nasale, mantenendo il piano chirurgico dell'anestesia utilizzando isoflurano allo 0-3% su un termoforo. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia in base alla mancanza di riflesso corneale e/o alla risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
3. Proteggere dall'essiccazione corneale applicando un unguento oftalmico sugli occhi
4. Iniettare 5 mg/kg di ketoprofene per via sottocutanea come analgesia per la procedura.
   NOTA: I valori utilizzati per i calcoli del dosaggio sono riassunti nella Tabella 1.
5. Preparare l'area chirurgica alternando scrub di alcol al 70% e betadina 3x. Lasciare asciugare lo scrub finale con betadine prima di procedere.
6. Utilizzare forbici chirurgiche sterili per aprire verticalmente la pelle sopra il tumore primario (rostrale-caudale). In caso di pelle ulcerata, iniziare ad aprirsi lateralmente all'ulcerazione per evitare di lasciare il tumore primario e per rimuovere completamente la pelle ulcerata.
7. Continua a usare forbici e pinze per sezionare con cura il tessuto connettivo attorno al tumore incapsulato per rimuovere completamente la massa dalla pelle, così come i tessuti corporei sottostanti poiché qualsiasi tumore rimanente può ricrescere.
8. Se presente, controllare l'emorragia applicando pressione con un applicatore con punta di cotone.
9. Chiudere l'apertura chirurgica con sutura Vicryl 5-0.
   NOTA: La sutura interrotta può comportare una migliore pervietà della ferita poiché i topi tendono a disturbare il sito chirurgico.
10. Lasciare che l'animale si riprenda in una gabbia pulita su un tappetino riscaldante fino a quando non è completamente deambulante. Posizionare il cibo inumidito sul fondo della gabbia domestica quando si riporta l'animale nella gabbia.
11. Iniettare 5 mg/kg di ketoprofene per via sottocutanea una volta al giorno per almeno 2 giorni dopo l'intervento chirurgico. Controlla lo stato di salute della ferita in questi momenti.

8. Consegna di nanofarmaci

1. Pesare i topi poiché il dosaggio dei nanofarmaci si basa sul peso corporeo.
2. Anestetizzare il topo con isoflurano al 2% e poi trasferirlo su un cono nasale, mantenendo il piano chirurgico dell'anestesia utilizzando isoflurano allo 0-3% su un termoforo. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia in base alla mancanza di riflesso corneale e/o alla risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
   NOTA: In alternativa, il nanofarmaco può essere somministrato a un topo sveglio trattenuto. Tutti i passaggi successivi sarebbero gli stessi.
3. Preparare una siringa da insulina con ago da 29 G con 10 mg di nanofarmaco Fe/kg di peso corporeo del topo.
4. Immergere la coda dell'animale in acqua tiepida (30-35 °C) per 30 s per dilatare le vene della coda.
5. Asciugare l'acqua in eccesso dalla coda e pulire il sito di iniezione con una salvietta imbevuta di alcol al 70%.
6. Inserire lo smusso dell'ago nella vena laterale della coda a circa metà della coda e tirare leggermente indietro lo stantuffo per confermare il posizionamento con ritorno di sangue nell'ago. Se necessario, spostare l'ago leggermente in avanti o a una profondità più superficiale per ottenere un posizionamento corretto.
7. Dopo l'inserimento riuscito, iniettare il nanofarmaco costantemente a una velocità lenta di circa 5-10 s per un'iniezione di 40 μL. Confermare l'avvenuta iniezione per mancanza di ristagno di soluzione sotto la pelle della coda vicino al sito di iniezione e per scurimento della vena (dalla soluzione di nanoparticelle scure).
   NOTA: I valori utilizzati per i calcoli del dosaggio sono riassunti nella Tabella 1. Le formulazioni di nanoparticelle agglomerate possono embolizzare il polmone. Se si osserva distress respiratorio poco dopo l'iniezione, eseguire delicatamente le compressioni toraciche sul topo. Un'azione immediata si traduce sempre nel successo del recupero dell'animale da questo possibile problema.
8. Mantenere la pressione sul sito di iniezione con una garza e rimuovere l'ago, mantenendo la pressione per circa 30 secondi fino a quando l'emorragia non si ferma.
9. Lasciare che l'animale si riprenda in una gabbia pulita su un tappetino riscaldante fino a quando non è completamente deambulante.

9. Raccolta di metastasi per l'analisi

1. Immagine dei topi con BLI come descritto nella sezione 6.
   NOTA: In questo studio, la radianza 5 × 10³ è considerata indicativa di metastasi e si osserva generalmente a 5-7 settimane. Ci si può aspettare una leggera variazione nel tempo di metastasi tra i topi.
2. Immediatamente dopo l'imaging, sacrificare i topi mediante lussazione cervicale sotto isoflurano pesante (5%). Prima della dissezione, confermare la morte per mancanza di riflesso corneale e/o risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
3. Raccogli con cura le metastasi. Le metastasi linfonodali si presentano come una massa ingrandita e incapsulata. Le metastasi polmonari saranno generalmente distribuite in tutto il parenchima polmonare; Quindi, raccogli l'intero polmone.
4. Posizionare i tessuti raccolti in una capsula di Petri e creare un'immagine utilizzando il sistema di imaging per confermare la bioluminescenza (che indica la presenza di cellule tumorali che esprimono luciferasi) e la fluorescenza (che indica l'accumulo di nanofarmaci). Utilizzare le stesse impostazioni di acquisizione BLI descritte nel passaggio 6.3.2. Le impostazioni di acquisizione FLI sono Esposizione = Auto, Binning = Medio, FStop = 1, Eccitazione = 675 ed Emissione = 720 (programma predefinito per il colorante Cy5.5), Livello lampada = Alto, FOV = D, Altezza 1,50. Immagina la carcassa del topo per determinare se c'è tessuto tumorale rimanente che vale la pena raccogliere.
5. Sciacquare i tessuti tumorali in PBS.
6. Per raccogliere i tessuti per la microscopia o la qRT-PCR, incorporarli nell'OCT e conservarli a -80 °C fino al momento dell'elaborazione.
7. Per raccogliere i tessuti per la spettroscopia di emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES), tarare una bilancia utilizzando una provetta vuota da 1,7 mL, posizionare il tessuto nella provetta e registrarne il peso. Congelare il fazzoletto e conservarlo a -80 °C fino al momento della lavorazione.

10. Validazione del rilascio di nanofarmaci mediante microscopia a fluorescenza

1. Criosezionare i campioni freschi congelati inclusi nell'OCT su vetrini per microscopia a uno spessore di 10 μm. Regolare le temperature della camera e del portacampioni in base al tipo di tessuto. Le impostazioni comprese tra -20 °C e -15 °C sono appropriate sia per il tessuto polmonare che per quello linfatico.
2. Fissare le sezioni di tessuto sui vetrini immergendo le sezioni o i vetrini interi in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 15 minuti. Risciacquare accuratamente con PBS.
3. Montare i vetrini coprioggetti sui vetrini. Utilizzare un terreno con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per la visualizzazione dell'architettura tissutale.
4. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per esaminare le sezioni per Cy5.5 (eccitazione 683 nm/emissione 703 nm), che indica la somministrazione di nanofarmaci. Verificare che il segnale non sia di fondo utilizzando un campione di controllo negativo (tessuto di un animale non iniettato).

11. Validazione del rilascio di nanofarmaci mediante spettroscopia di emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES)

1. Trasferire i campioni conservati a -80 °C in una provetta conica da 15 mL e incubarla in forno con il tappo rimosso a 37 °C per asciugare.
   NOTA: Questo processo ha richiesto 24 ore per i campioni di metastasi MDA-MB-231, ma può richiedere diversi giorni a seconda delle dimensioni e del contenuto di umidità del campione.
2. Registrare il peso a secco utilizzando una bilancia.
3. Aggiungere 2 mL di traccia HNO₃ al 70% al recipiente e digerire il campione in microonde. I parametri utilizzati in questo studio sono i seguenti: Potenza = 1030 - 1800 W, Tempo di rampa = 20:00 - 25:00, Tempo di mantenimento = 15:00, Temperatura = 200 °C, Raffreddamento = 30 min.
   ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si lavora con l'acido nitrico poiché esso e i fumi generati durante il riscaldamento sono altamente corrosivi. Il lavoro deve essere completato in uno spazio ben ventilato con dispositivi di protezione individuale completi, come camice da laboratorio, occhiali/visiera e guanti compatibili con il lavoro acido. I piccoli volumi e il lungo raffreddamento utilizzati riducono al minimo i rischi, ma bisogna sempre prestare attenzione.
4. Trasferire i campioni digeriti in provette coniche prive di metallo; quindi, trasferire 300 μl in una nuova provetta. Diluire a 10 mL utilizzando 9,7 mL di acqua ultrapura, ottenendo una concentrazione di HNO₃ del 3% (v/v).
5. Preparare standard di Fe per singoli elementi a concentrazioni di 1000, 100, 10, 1, 0,1 e 0 μg Fe/mL in HNO₃ al 3% (v/v) e acqua ultrapura. Preparare il singolo elemento Y standard interno a una concentrazione di 1 μg/mL in HNO₃ % (v/v) al 3% in acqua ultrapura.
6. Analizza i campioni utilizzando ICP-OES. Sia per la modalità assiale che per quella radiale, selezionare le seguenti linee di emissione per l'analisi del contenuto di ferro. Fe (234,350 nm), Fe (238,204 nm), Fe (259,940 nm) e Y (371,029 nm) utilizzati per la standardizzazione interna.
7. Normalizzare i risultati in base alla quantità di campione utilizzata per l'input per calcolare μg di Fe/g di tessuto.

Risultati

Nei nostri precedenti studi terapeutici in vivo, abbiamo trattato topi con una dose di nanofarmaco (10 mg di nanofarmaco Fe/kg di peso corporeo del topo) alla settimana per diverse settimane ^3,7,8. Per questa dimostrazione, abbiamo cercato di determinare se l'accumulo di nanofarmaco potesse essere osservato nelle metastasi polmonari dopo una dose, 1 settimana dopo. I risultati di questo...

Discussione

Le nanoparticelle hanno un grande potenziale per il trattamento del cancro. Qui, abbiamo dimostrato che un portatore di MNP coniugato con Cy5.5 può raggiungere i tessuti tumorali per veicolare oligonucleotidi terapeutici in un modello murino di carcinoma mammario metastatico. La capacità di somministrare il nanofarmaco per via sistemica, pur ottenendo un notevole accumulo nei tessuti tumorali, offre enormi vantaggi rispetto a molti metodi di somministrazione ASO esistenti, che richiedo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 5800 ICP-OES	Agilent	5800 ICP-OES	For ICP-OES
Ammonium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	458680025	For nanodrug synthesis
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	For tumor resection
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	For tumor resection
Crile Hemostats - Straight	F.S.T.	13004-14	For tumor resection
Cy5.5-NHS ester	Abcam	ab146455	For nanodrug synthesis
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	For cell culture of MDA-MB-231
Eclipse 50i Clinical Microscope	Nikon	50i-B	For imaging of cryosections
Epichlorohydrin	Thermo Fisher Scientific Inc	117780250	For nanodrug synthesis
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	For tumor resection and metastasis dissection
Fe standard	Inorganic Ventures	CGFE1-500ML	For ICP-OES
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	For cell culture of MDA-MB-231
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	For tumor resection and metastasis dissection
Flask (T-75)	Corning	430641U	For cell culture of MDA-MB-231
HNO3 nitric acid (70%, trace metal grade)	Fisher Chemical	A509P212	For ICP-OES
Insulin syringe 1 CC 29 G x 1/2"	Becton, Dickinson	324704	For tumor implant
Isoflurane	Covetrus	11695067772	For mouse anesthetization
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	For mouse anesthetization
Isopropyl alcohol (70%) wipe	Cardinal	MW-APL	For tumor resection
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	For bioluminescence imaging
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	For bioluminescence imaging
Ketofen (ketoprofen)	Zoetis	10004031	For tumor resection
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
MARS 6 microwave digestion system	CEM	MARS 6	For ICP-OES
Matrigel, growth factor-reduced	Corning	354230	For tumor implant of MDA-MB-231
MDA-MB-231-luc-D3H2LN	PerkinElmer/Revvity	119369	For mouse model of spontaneous metastasis
Metal-free polypropylene 15 mL conical tubes	Labcon	31343450019	For ICP-OES
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	DOT Scientific	RN1700-GMT	For metastasis sample collection
N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP)	Thermo Fisher Scientific Inc	21857	For nanodrug synthesis
PBS	Gibco	14190-144	For cell culture and tumor implant of MDA-MB-231
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture of MDA-MB-231
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	For tumor resection
Sodium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	3728-70	For nanodrug synthesis
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	For metastasis sample collection
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	For metastasis sample collection
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific Inc	T2556	For nanodrug synthesis
Trypsin, 0.25%	Gibco	25200-056	For cell culture of MDA-MB-231
Vicryl PLUS (Antibacterial) violet 27" RB-1 taper	Ethicon	VCP303H	For tumor resection