监测小鼠乳腺癌转移灶中纳米药物的积累

摘要

在这里，我们描述了在动物模型中将携带 RNA 寡聚体的磁性氧化铁纳米 颗粒体内递送 至转移性乳腺癌的方案，为致癌核酸的治疗沉默提供了一种临床可行的方法。

摘要

转移性乳腺癌是一种毁灭性的疾病，治疗选择非常有限，需要新的治疗策略。致癌 miRNA 已被证明与乳腺癌的转移潜力有关，并与肿瘤细胞迁移、侵袭和活力有关。然而，将抑制性 RNA 分子递送到目标组织可能很困难。为了克服这一挑战并将活性反义寡核苷酸递送到肿瘤，我们利用磁性氧化铁纳米颗粒作为递送平台。这些纳米颗粒靶向血管通透性增加的组织，例如炎症或癌症部位。由于这些纳米颗粒的磁性，可以通过磁共振成像 （MRI） 在 体内 监测这些纳米颗粒的递送。由于这种治疗方法与这种相关的成像方式兼容，因此将更容易将这种治疗方法转化为临床。它们也可以用其他成像报告基因进行标记，例如用于相关光学成像和荧光显微镜的 Cy5.5 近红外光学染料。在这里，我们证明用 Cy5.5 标记并与靶向致癌 miRNA-10b（称为 MN-抗 miR10b，或"纳米药物"）的治疗性寡聚体偶联的纳米颗粒在转移部位积聚，为转移性乳腺癌的治疗干预提供了可能性。

引言

尽管乳腺癌的治疗取得了许多进展，但转移性疾病的临床选择仍然有限。患者通常接受针对原发肿瘤中确定的驱动因素（例如雌激素或 HER2）的治疗，但这些驱动因素在转移中并不总是保守的，因此治疗无效¹。其他全身疗法，例如化疗，是非特异性的，并且以其副作用而闻名。为了开发治疗转移性乳腺癌的有效选择，重要的是要考虑允许癌细胞扩散和定植远处部位的生物驱动因素。这些驱动因素之一是 miR-10b，这是一种致癌 microRNA，与乳腺癌细胞活力、侵袭和迁移有关，已被证明足以在其他非转移性乳腺癌细胞中赋予转移潜力 ^2,3。重要的是，与匹配的原发性肿瘤相比，miR-10b 在转移瘤中的表达水平也更高⁴，使其成为治疗现有转移的有前途的靶点。

尽管 miR-10b 等 miRNA 作为转移性疾病的治疗靶点具有巨大潜力，但 miRNA 沉默的治疗可行方法的设计带来了独特的挑战。结合其互补 miRNA 序列的反义寡核苷酸 （ASO） 通常使用脂质转染在 体外转移到细胞 中，但由于固有的不稳定性、核酸酶破坏的风险、短血半衰期以及由于电荷排斥而无法进入细胞，因此不容易到达 体内 肿瘤细胞⁵.为了应对这些挑战，我们使用葡聚糖包被的磁性氧化铁纳米颗粒 （MNP^{） 6} 开发了一种临床适用的生物分子载体。纳米颗粒上的胺基允许寡核苷酸、荧光染料（例如 Cy5.5）和靶向部分的偶联。此外，氧化铁芯允许使用磁共振成像 （MRI） 对车辆输送进行 体内 监测。我们将抗 miR-10b 锁定的核酸 ASO 和 Cy5.5 与 MNP 偶联，以产生一种称为 MN-抗 miR10b 的"纳米药物"，如图 1⁷ 所示。

在我们之前的研究中，我们表明纳米药物在体外有效导致 miR-10b 的下调并抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭 ⁷。在转移性乳腺癌的小鼠模型中，纳米药物的静脉内递送可防止淋巴结转移的发展，或者如果在淋巴结转移形成后给药，则会阻止其生长⁷。值得注意的是，观察到纳米药物很容易在癌组织中积累。虽然纳米药物不能自行根除转移，但在随后的研究中，我们表明与辅助阿霉素的联合治疗在免疫功能低下和免疫功能正常的小鼠模型中都是治愈的 ^3,8。纳米药物抑制 miR-10b 的作用也见于猫乳腺癌⁹。

为了有效治疗乳腺癌，必须证明药物在目标组织中积累。在这里，我们提出了一种方案，用于证明磁性纳米粒子载体的积累，该载体在转移性乳腺癌的小鼠模型中使用多种方式将治疗性抗 miR-10b ASO 递送到癌组织。

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研究方案

密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 已批准所有涉及动物受试者的程序。 表 1 总结了计算值。

1. MN 抗 miR10b 合成的关键步骤

注:MN 抗 miR10b 合成的细节已在前面描述^{过 9,10,11}。

1. 通过共沉淀法制备磁性纳米颗粒 （MN） 核心。
2. 使用氢氧化钠、环氧氯丙烷和氢氧化铵交联和调节制备的纳米颗粒。
3. 通过异双功能交联剂 N-琥珀酰亚胺基 3-[2-吡啶基二硫代]-丙酸酯 （SPDP） 将 Cy5.5-NHS 酯与 MN 偶联，得到 MN-Cy5.5，以便进行荧光成像和显微镜检查。
4. 用 3% 三（2-羧乙基）膦 （TCEP） 激活抗 miR-10b 锁定核酸，并与 MN-Cy5.5 偶联产生 MN-抗 miR10b。
5. 对偶联物进行表征以确定铁含量（通过铁测定）、每个纳米颗粒的 Cy5.5 分子数（通过分光光度法）和共轭 LNA 的量（通过琼脂糖凝胶电泳）。

2. 获取研究动物

1. 提前概述研究以规划实验组和每组的动物数量。每个笼子最多可容纳 5 只小鼠。如果在治疗期间使用多个 5 只小鼠的笼子，请确保每个笼内都有对照和实验小鼠，以去除笼子作为混杂变量。
2. 在 6-7 周龄时获得小鼠。在诱导原位肿瘤之前，允许至少 1 周适应住房条件。
   注:使用自发性乳腺癌转移的 MDA-MB-231（人源细胞系）模型的程序如下所述。对于该模型，通常使用无胸腺裸鼠 （Foxn1^nu/Foxn1^nu）。可以使用其他相容的免疫功能低下的小鼠品系，并且这些程序也适用于免疫功能正常的小鼠（例如，BALB/c 小鼠中的 4T1 乳腺癌细胞）中的同种异体移植模型。

3. 培养细胞

1. 用 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素（完全生长培养基）补充 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），以培养表达荧光素酶（例如 MDA-MB-231-luc-D3H2LN）的 MDA-MB-231 细胞。通常在 T75 培养瓶中，在 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度的无菌条件下培养细胞。如果冷冻，则在肿瘤植入前至少解冻细胞并传代一次。记录培养瓶上的传代编号。
   注:在本研究中，将先前冷冻的 1 × 10⁶ 个细胞的小瓶解冻并在使用前传代两次。
   1. 传代时，在 37 °C 下施用 0.25% 胰蛋白酶 3 分钟，以 <80% 的汇合度对细胞进行胰蛋白酶消化。加入 4 倍体积的完全生长培养基以中和胰蛋白酶。
   2. 将悬浮液在 200 × g 离心于锥形管中 5 分钟。倾析上清液后，将细胞沉淀重悬于 5 mL 完全生长培养基中。将一部分细胞分装到新培养瓶中，并根据新培养瓶体积添加额外的完全生长培养基。更新新培养瓶上的传代编号。
2. 在 10 次传代后解冻新细胞，以最大限度地减少研究之间的遗传漂变。

4. 用于诱导原位肿瘤的细胞的制备

1. 制备前将冷冻的基质胶（基底膜基质提取物）在 4 °C 下放置 24 小时，以使基质提取物液化。
2. 确定研究所需的细胞浓度和体积。将每只小鼠的 1 ×^{10 个 6} 个细胞植入小鼠，体积为 50 μL，由 1 份冷冻 PBS 和 1 份基质提取物组成。
3. 如步骤 3.1.2 中所述，沉淀胰蛋白酶消化细胞。将细胞沉淀重悬于至少 10 mL 的 PBS 中以洗涤细胞，然后再次以 200 × g 离心 5 分钟。将沉淀重悬于 500 μL 冷冻的 PBS（细胞原液）中。
4. 使用血细胞计数器计数细胞。由于细胞浓度较高，因此根据需要稀释小份等分试样（例如 10 μL），同时跟踪稀释因子，直到可以进行准确测量。
5. 将所需的细胞总数稀释至 40 × 10⁶ 个细胞/mL，然后加入等体积的冷冻基质提取物，以达到每 50 μL 1 ×^{10 6} 个细胞的最终浓度。保持冰上以防止提取物在植入前凝固。
   注:细胞浓度总结于 表 1 中。

5. 原位肿瘤的诱导

1. 使用 2% 异氟醚麻醉小鼠，然后将其转移到鼻锥上，在加热垫上使用 0-3% 异氟醚维持手术麻醉平面。通过缺乏角膜反射和/或脚趾捏反应来确认手术麻醉平面。通过在眼睛上涂抹眼药膏来防止角膜干燥。
2. 用 70% 酒精湿巾清洁注射部位附近的皮肤，并等待几秒钟让酒精干燥。在乳腺 #4 诱导，以降低原发肿瘤和最常见的转移部位（肺和腋窝淋巴结）之间生物发光成像信号重叠的风险。
   注意:乳腺编号之前已经描述过¹²。简而言之，仰卧位、头部朝上的小鼠在注射器的右侧（小鼠的左侧）将有腺体 1 到 5，从最靠近头部的（颈椎 - 腺体 1）开始，下降到最尾部的腺体（腹股沟 - 腺体 5）。腺体 6 到 10 在动物的另一侧方向相似。
3. 上下吹打细胞原液以重悬细胞。用 29 G 针头将 50 μL 冰冷的细胞悬液吸入胰岛素注射器中，并立即注射细胞。如果不能立即注射，请将注射器放在冰上。
   注意:在每次抽取细胞之间上下吹打，以防止细胞沉淀。
4. 将斜面直接插入与小鼠身体平行的所需乳腺下方，然后以稳定、缓慢的速度注射细胞。注射完成后，将针头留在皮肤内至少 5 秒，以使 Matrigel 凝固并防止泄漏。
5. 将鼠标移至加热垫上的干净笼子上进行恢复和监督，直到完全可以走动并能够保持胸骨卧位。不要让鼠标无人看管。只有在鼠标恢复后，才能将鼠标与其他鼠标一起放回笼子中。

6. 使用生物发光成像 （BLI） 监测肿瘤生长和转移发展

注:由于此处使用的 MDA-MB-231 细胞表达荧光素酶，因此将荧光素底物注射到小鼠中将产生成像系统扫描仪检测到的光信号。在该模型中，预计在肿瘤诱导后 5-7 周发生转移。建议每周对小鼠进行 1-3 次成像，具体取决于确定可视化转移的确切时刻的重要性。

1. 使用 2% 异氟醚麻醉小鼠，以在施用荧光素时尽量减少对小鼠受伤的风险。通过在眼睛上涂抹眼药膏来防止角膜干燥。
2. 将 150 mg/kg 体重的荧光素腹膜内注射到每只小鼠中，并将小鼠放回加热垫上的笼子中，让小鼠唤醒并代谢荧光素。监督并且不要让小鼠无人看管，直到完全走动并能够保持胸骨卧位。
   注:用于剂量计算的值总结在 表 1 中。
3. 在注射荧光素后约 10 分钟开始，使用成像系统扫描仪对小鼠进行成像，需要时重新麻醉小鼠，以便有时间转移到 IVIS。
   1. 最多 5 只小鼠一起仰卧位成像，注意确保它们的整个身体都包含在视野引导标记中并尽可能笔直。使用透明胶带固定他们的手臂，以便更好地观察腋窝淋巴结。如果一次对多只小鼠进行成像，请使用歧管分隔器将小鼠分开，以防止信号辐射到其他小鼠。如果没有分隔线，请使用吸光纸条代替（例如，厚的黑色卡片纸）。
      注:荧光素代谢速率因小鼠和细胞系模型而异，注射后 10 分钟开始的图像采集可能不会产生最强的信号。建议在开始新研究时，在不同时间点进行采集，以确定峰值信号强度的时间。
   2. 使用以下 BLI 设置准备用于图像采集的成像系统软件: 曝光 = 自动，像素合并 = 中等，FStop = 1，激发 = 块，发射 = 开放，FOV = D，高度 = 1.50。
   3. 通常，由于原发性肿瘤信号位于表面位置，使用设置 Exposure = Auto 会产生相对较强的信号。如果监测转移，请使用黑色电工胶带小心覆盖原发肿瘤，并手动设置 Exposure = 300 s （或更长时间）以获取微弱的信号（如果存在）。
      注意:在此模型中，当下限阈值设置为 5 × 10³ 辐射度时，在多次成像过程中可见的与原发肿瘤分开的信号被认为表明转移。

7. 原发性肿瘤的切除

注意:原发性肿瘤的切除对于转移的纵向（例如，治疗性）研究很重要;否则，小鼠可能会死于与不受限制的原发性肿瘤生长相关的发病率。在确定切除时间时，考虑原发肿瘤大小（切除时失血的风险）和溃疡（感染风险）。

1. 如果考虑没有 BLI 信号来测试原发性肿瘤切除是否成功，请按照第 6 节所述进行术前成像，并确认术后没有信号。在接下来的 1-2 天内使用新鲜给药的荧光素确认切除成功。
   注意:不建议立即重新施用荧光素，以避免对动物造成不必要的压力。如果切除未完全，在原发性肿瘤切除前注射荧光素应足以检测信号。
2. 使用 2% 异氟醚麻醉小鼠，然后将其转移到鼻锥上，在加热垫上使用 0-3% 异氟醚维持麻醉手术平面。通过缺乏角膜反射和/或脚趾捏反应来确认手术麻醉平面。
3. 通过在眼睛上涂抹眼药膏来防止角膜干燥
4. 皮下注射 5 mg/kg 酮洛芬作为手术的镇痛剂。
   注:用于剂量计算的值总结在 表 1 中。
5. 通过交替使用 70% 酒精和 3 倍优碘磨砂膏来准备手术区域。在继续之前，让最后的 betadine 磨砂膏干燥。
6. 使用无菌手术剪刀垂直打开原发肿瘤上方（喙尾）上方的皮肤。在溃疡皮肤的情况下，开始向溃疡的一侧开放，以避免留下原发肿瘤并完全去除溃疡的皮肤。
7. 继续使用剪刀和镊子仔细解剖包膜肿瘤周围的结缔组织，以完全去除皮肤上的肿块以及下面的身体组织，因为任何剩余的肿瘤都可能重新生长。
8. 如果存在，请使用棉签涂抹器按压来控制出血。
9. 用 5-0 薇乔线缝合闭合手术口。
   注意:中断缝合可能会导致更好的伤口通畅性，因为小鼠容易打扰手术部位。
10. 让动物在温暖垫上的干净笼子中恢复，直到完全可以走动。将动物放回笼子时，将湿润的食物放在家笼底部。
11. 手术后至少 2 天皮下注射 5 mg/kg 酮洛芬，每天一次。在这些时间检查伤口健康状况。

8. 纳米药物的递送

1. 称量小鼠，因为纳米药物剂量基于体重。
2. 使用 2% 异氟醚麻醉小鼠，然后将其转移到鼻锥上，在加热垫上使用 0-3% 异氟醚维持麻醉手术平面。通过缺乏角膜反射和/或脚趾捏反应来确认手术麻醉平面。
   注意:或者，可以将纳米药物施用于受约束的清醒小鼠。所有后续步骤都将相同。
3. 准备一个带有 29 G 针头的胰岛素注射器，其中含有 10 mg Fe 纳米药物/kg 小鼠体重。
4. 将动物的尾巴浸入温水 （30-35 °C） 中 30 秒以扩张尾静脉。
5. 擦去尾部多余的水，并用 70% 的酒精湿巾清洁注射部位。
6. 将针头斜向上插入尾部外侧静脉中，大约在尾部一半处，然后稍微向后拉柱塞以确认位置，血液回流到针头中。如果需要，将针头稍微向前移动或移动到更浅的深度以实现成功放置。
7. 成功插入后，以大约 5-10 秒的缓慢速度稳定注射纳米药物，注射 40 μL。通过注射部位附近尾部皮肤下缺乏溶液积聚和静脉变暗（来自深色纳米颗粒溶液）来确认注射成功。
   注:用于剂量计算的值总结在 表 1 中。成团的纳米颗粒制剂可能会栓塞到肺部。如果在注射后不久观察到呼吸窘迫，请轻轻地对小鼠进行胸外按压。立即采取行动总是可以使动物从这个可能的问题中成功恢复过来。
8. 用纱布在注射部位保持压力并取下针头，保持压力约 30 秒，直到出血停止。
9. 让动物在温暖垫上的干净笼子中恢复，直到完全可以走动。

9. 收集转移瘤进行分析

1. 如第 6 节所述，通过 BLI 对小鼠进行成像。
   注意:在这项研究中，5 × 10³ 辐射被认为是转移的标志，通常在 5-7 周观察到。预计不同小鼠的转移时间会略有不同。
2. 成像后，立即在重 （5%） 异氟醚下通过颈椎脱位处死小鼠。在夹层术前，通过缺乏角膜反射和/或脚趾捏合反应来确认死亡。
3. 仔细收集转移灶。淋巴结转移表现为扩大的包膜肿块。肺转移通常分布在整个肺实质;因此，收集整个肺。
4. 将收集的组织放入培养皿中，并使用成像系统进行成像，以确认生物发光（表明存在表达荧光素酶的癌细胞）和荧光（表明纳米药物积累）。使用与步骤 6.3.2 中所述相同的 BLI 采集设置。FLI 采集设置为 曝光 = 自动、像素合并 = 中等、FStop = 1、激发 = 675 和发射 = 720（Cy5.5 染料的默认程序）、灯电平 = 高、FOV = D、高度 1.50。对小鼠尸体进行成像，以确定是否有剩余的癌组织值得收集。
5. 用 PBS 冲洗癌组织。
6. 要收集组织用于显微镜检查或 qRT-PCR，请包埋在 OCT 中并储存在 -80 °C 直至准备好进行处理。
7. 要收集组织用于电感耦合等离子体发射光谱 （ICP-OES），请使用 1.7 mL 空试管去皮，将组织放入试管中，并记录其重量。冷冻组织并储存在 -80 °C 直至准备好进行处理。

10. 通过荧光显微镜验证纳米药物递送

1. 将 OCT 包埋的新鲜冷冻样品冷冻切片到 10 μm 厚的显微镜载玻片上。根据组织类型调整腔室和标本架温度。-20 °C 和 -15 °C 之间的设置适用于肺组织和淋巴组织。
2. 通过将切片或整个玻片浸入 4% 多聚甲醛溶液中 15 分钟，将组织切片固定在载玻片上。用 PBS 小心冲洗。
3. 将盖玻片安装到载玻片上。使用含有 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的培养基进行组织结构的可视化。
4. 使用荧光显微镜检查 Cy5.5 （激发 683 nm/发射 703 nm） 切片，表明纳米药物递送。使用阴性对照样品（来自未注射动物的组织）确认信号不是背景。

11. 通过电感耦合等离子体发射光谱 （ICP-OES） 验证纳米药物递送

1. 将储存在 -80 °C 的样品转移到 15 mL 锥形管中，并在 37 °C 下取下盖子在烘箱中孵育以干燥。
   注意:对于 MDA-MB-231 转移样本，此过程需要 24 小时，但可能需要几天时间，具体取决于样本的大小和水分含量。
2. 使用天平记录干重。
3. 向容器中加入 2 mL 70% 痕量 HNO₃ 并微波消解样品。本研究中使用的参数如下: 功率 = 1030 - 1800 W，升温时间 = 20:00 - 25:00，保持时间 = 15:00，温度 = 200 °C，冷却 = 30 分钟。
   注意: 使用硝酸时要小心，因为它和加热时产生的烟雾具有很强的腐蚀性。工作应在通风良好的空间内完成，并配备全套个人防护设备，例如实验室外套、护目镜/面罩和与酸性工作兼容的手套。此处使用的小体积和长时间的冷却在一定程度上降低了风险，但应始终小心。
4. 将消解的样品转移到无金属锥形管中;然后，将 300 μL 转移到新试管中。使用 9.7 mL 超纯水稀释至 10 mL，得到 HNO₃ 浓度为 3% （v/v）。
5. 在 3% HNO₃ （v/v） 和超纯水中制备浓度为 1000、100、10、1、0.1 和 0 μg Fe/mL 的单个元素 Fe/mL 标准品。在3% HNO₃ （v/v）的超纯水溶液中制备浓度为1 μg/mL的单个元素Y内标。
6. 使用 ICP-OES 分析样品。对于轴向和径向模式，请选择以下排放线来分析铁含量。Fe （234.350 nm）、Fe （238.204 nm）、Fe （259.940 nm） 和 Y （371.029 nm） 用于内部标准化。
7. 将结果归一化为用于输入的样品量，以计算 μg Fe/g 组织。

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结果

在我们之前的体内治疗性研究中，我们每周用一剂纳米药物（10 mg Fe 纳米药物/kg 小鼠体重）治疗小鼠，持续数周 ^3,7,8。对于这个演示，我们试图确定 1 周后一剂后是否可以在肺转移中观察到纳米药物的积累。这项研究的结果将指导未来纵向研究中监测纳米药物积累的时间表。最终，它也可以作?...

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讨论

纳米颗粒在癌症治疗方面具有巨大潜力。在这里，我们表明 Cy5.5 偶联的 MNP 载体可以到达癌组织，在转移性乳腺癌的小鼠模型中递送治疗性寡核苷酸。与许多现有的 ASO 递送方法相比，纳米药物系统给药的能力仍然在癌组织中实现相当大的积累，这提供了巨大的优势，这些方法通常需要局部且通常是侵入性给药。由于靶标特异性对患者安全和药物疗效至关重要，因此这些?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 5800 ICP-OES	Agilent	5800 ICP-OES	For ICP-OES
Ammonium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	458680025	For nanodrug synthesis
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	For tumor resection
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	For tumor resection
Crile Hemostats - Straight	F.S.T.	13004-14	For tumor resection
Cy5.5-NHS ester	Abcam	ab146455	For nanodrug synthesis
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	For cell culture of MDA-MB-231
Eclipse 50i Clinical Microscope	Nikon	50i-B	For imaging of cryosections
Epichlorohydrin	Thermo Fisher Scientific Inc	117780250	For nanodrug synthesis
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	For tumor resection and metastasis dissection
Fe standard	Inorganic Ventures	CGFE1-500ML	For ICP-OES
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	For cell culture of MDA-MB-231
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	For tumor resection and metastasis dissection
Flask (T-75)	Corning	430641U	For cell culture of MDA-MB-231
HNO3 nitric acid (70%, trace metal grade)	Fisher Chemical	A509P212	For ICP-OES
Insulin syringe 1 CC 29 G x 1/2"	Becton, Dickinson	324704	For tumor implant
Isoflurane	Covetrus	11695067772	For mouse anesthetization
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	For mouse anesthetization
Isopropyl alcohol (70%) wipe	Cardinal	MW-APL	For tumor resection
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	For bioluminescence imaging
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	For bioluminescence imaging
Ketofen (ketoprofen)	Zoetis	10004031	For tumor resection
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
MARS 6 microwave digestion system	CEM	MARS 6	For ICP-OES
Matrigel, growth factor-reduced	Corning	354230	For tumor implant of MDA-MB-231
MDA-MB-231-luc-D3H2LN	PerkinElmer/Revvity	119369	For mouse model of spontaneous metastasis
Metal-free polypropylene 15 mL conical tubes	Labcon	31343450019	For ICP-OES
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	DOT Scientific	RN1700-GMT	For metastasis sample collection
N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP)	Thermo Fisher Scientific Inc	21857	For nanodrug synthesis
PBS	Gibco	14190-144	For cell culture and tumor implant of MDA-MB-231
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture of MDA-MB-231
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	For tumor resection
Sodium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	3728-70	For nanodrug synthesis
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	For metastasis sample collection
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	For metastasis sample collection
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific Inc	T2556	For nanodrug synthesis
Trypsin, 0.25%	Gibco	25200-056	For cell culture of MDA-MB-231
Vicryl PLUS (Antibacterial) violet 27" RB-1 taper	Ethicon	VCP303H	For tumor resection