التحليل الكمي لمستقلبات فيتامين أ الغذائية في أنسجة العين وغير العينية في الفئران باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء

Summary

هنا ، يتم وصف طريقة كروماتوغرافيا السائل ذات المرحلة العادية وعالية الأداء لاكتشاف وتحديد كمية الرتينويدات الحرجة المشاركة في تسهيل الوظيفة البصرية في كل من أنسجة العين والجهازية ، في سياق إمدادات فيتامين أ الجهازية لتوليد كروموفور رودوبسين الحساس للضوء 11-رابطة الدول المستقلة الشبكية.

Abstract

المستقبلات المقترنة ببروتين G (GPCRs) هي عائلة فائقة من البروتينات عبر الغشاء التي تبدأ شلالات الإشارات من خلال تنشيط بروتين G الخاص بها عند الارتباط بالترابط. في جميع رؤى الثدييات ، فإن رودوبسين هو GPCR المسؤول عن بدء سلسلة التنبيغ الضوئي. داخل المستقبلات الضوئية ، يرتبط رودوبسين بالكروموفور 11-cis-retinal ويتم تنشيطه من خلال الأيزومرة الحساسة للضوء من 11-cis-retinal إلى All-trans-retinal ، والتي تنشط بروتين Transducin G ، مما يؤدي إلى سلسلة النقل الضوئي.

في حين أن النقل الضوئي مفهوم جيدا ، فإن العمليات التي تشارك في توفير سلائف فيتامين أ الغذائية لتوليد 11-رابطة الدول المستقلة في العين ، وكذلك الأمراض التي تؤدي إلى تعطيل هذا الإمداد ، ليست مفهومة تماما بعد. بمجرد امتصاص سلائف فيتامين أ في الأمعاء ، يتم تخزينها في الكبد على شكل استرات الريتينيل ويتم إطلاقها في مجرى الدم كجميع الريتينول المرتبط بالبروتين 4 المرتبط بالريتينول (RBP4). سيتم امتصاص RBP4-retinol الدورة الدموية من قبل الأعضاء الجهازية ، مثل الكبد والرئتين والكلى والعين. ومن ثم ، فإن طريقة القياس الكمي لنواتج الأيض المختلفة لفيتامين أ الغذائي في العين والأعضاء الجهازية أمر بالغ الأهمية لدراسة وظيفة رودوبسين GPCR المناسبة.

في هذه الطريقة ، نقدم طريقة استخراج وتحليل شاملة لتحليل فيتامين أ في أنسجة الفئران. من خلال تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء في المرحلة العادية ، يمكن اكتشاف جميع الأيزومرات ذات الصلة من الريتينالديهايد والريتينول واسترات الريتينيل في وقت واحد من خلال تشغيل واحد ، مما يسمح بالاستخدام الفعال للعينات التجريبية ويزيد من الموثوقية الداخلية عبر مستقلبات فيتامين أ المختلفة داخل نفس العينة. باستخدام هذه الطريقة الشاملة ، سيتمكن الباحثون من تقييم إمدادات فيتامين أ الجهازية بشكل أفضل في وظيفة رودوبسين GPCR.

Introduction

تعد المستقبلات المقترنة ببروتين G (GPCRs) واحدة من أكثر فصيلة البروتينات المعروفة دراسة وتميزا. في وظيفتها الأكثر شهرة ، تعمل GPCRs كمستقبل لسطح الخلية في نقل الإشارة ، وتهيئة الاستجابات داخل الخلايا عند الارتباط برابط معين. تتميز GPCRs بسبعة مجالات حلزونية عبر الغشاء (TM) وستة مجالات حلقة إجمالية. من بين الحلقات الست ، يتم توجيه ثلاث حلقات خارج الخلية لتسهيل ربط الترابط ، بينما تقترن الحلقات الثلاث الأخرى داخل الخلايا ببروتين G غير متجانس يتكون من الوحدات الفرعية Gα و Gβ و Gγ^1،2.

تصنف GPCRs إلى عدة فئات ، بما في ذلك الفئة أ شبيهة بالرودوبسين ، وعائ....

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) بجامعة مينيسوتا (البروتوكول # 2312-41637A) وتم إجراؤها وفقا لبيان ARVO لاستخدام في أبحاث طب العيون والرؤية. قم بإجراء جميع عمليات الاستخراج في الظلام ، تحت ضوء أحمر خافت للإضاءة. كن على دراية بالضوء المتبقي المنبعث من شاشات العدادات ومصابيح LED الملحقة.

1. الجيل القياسي للريتينويد الطيفي وتوليد المنحنى القياسي الخارجي

ملاحظة: قم بإعداد وعاء ثلج جاف للتخزين المؤقت للريتينويدات قبل التحليل باستخدام HPLC.

1. قم بوزن كمية تعسفية ولكن مناسبة من الريتينويدات وحلها في مذيب م....

النتائج

هنا ، استخدمنا الطريقة الموضحة أعلاه لاكتشاف وتحديد الرتينويدات في أنسجة العين والجهازية للفئران وإنشاء مخططات كروماتوغرامية تمثيلية. سنقدم أيضا ملخصا للرتينويدات النموذجية التي يمكن اكتشافها في هذه الأنسجة.

في عمر 6 أشهر ، تم القتل الرحيم للفئران من خل.......

Discussion

في هذه الطريقة ، يتم استخدام HPLC في المرحلة العادية لاكتشاف وتحديد كمية الريتينويدات ذات الصلة ، بما في ذلك استرات الريتينيل والريتينالديهايد والريتينول. نظرا لأهمية 11-cis-retinal باعتباره الصبغة الحرجة في تنشيط رودوبسين GPCR ، فإن الطريقة التي يمكنها اكتشاف المستقلبات ا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	204-661-8
11-cis-retinal	National Eye Institute	N/A
11-cis-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252105
13-cis-retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R239900
13-cis-retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252110
All-trans-Retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R240000
All-trans-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	205-500-4
Hexane, HPLC Grade	Fisher Scientific, Spectrum Chemical	18-610-808
Methanol (HPLC)	Fisher Scienctific	A452SK-4
Retinyl Palmitate	Toronto Research Chemicals	TRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction Collector	Agilent	G1364F
1260 Infinity II Binary Pump	Agilent	G7112B
1260 Infinity II Diode Array Detector	Agilent	G7115A
1260 Infinity II Multicolumn Thermostat	Agilent	G7116A
1260 Infinity II Vialsampler	Agilent	G7129A
ST40R Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top Vials	Agilent	5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mm	Agilent	5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge Tubes	Millipore Sigma	CLS9950215
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feet	Agilent	5183-2088