JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، يتم وصف طريقة كروماتوغرافيا السائل ذات المرحلة العادية وعالية الأداء لاكتشاف وتحديد كمية الرتينويدات الحرجة المشاركة في تسهيل الوظيفة البصرية في كل من أنسجة العين والجهازية ، في سياق إمدادات فيتامين أ الجهازية لتوليد كروموفور رودوبسين الحساس للضوء 11-رابطة الدول المستقلة الشبكية.

Abstract

المستقبلات المقترنة ببروتين G (GPCRs) هي عائلة فائقة من البروتينات عبر الغشاء التي تبدأ شلالات الإشارات من خلال تنشيط بروتين G الخاص بها عند الارتباط بالترابط. في جميع رؤى الثدييات ، فإن رودوبسين هو GPCR المسؤول عن بدء سلسلة التنبيغ الضوئي. داخل المستقبلات الضوئية ، يرتبط رودوبسين بالكروموفور 11-cis-retinal ويتم تنشيطه من خلال الأيزومرة الحساسة للضوء من 11-cis-retinal إلى All-trans-retinal ، والتي تنشط بروتين Transducin G ، مما يؤدي إلى سلسلة النقل الضوئي.

في حين أن النقل الضوئي مفهوم جيدا ، فإن العمليات التي تشارك في توفير سلائف فيتامين أ الغذائية لتوليد 11-رابطة الدول المستقلة في العين ، وكذلك الأمراض التي تؤدي إلى تعطيل هذا الإمداد ، ليست مفهومة تماما بعد. بمجرد امتصاص سلائف فيتامين أ في الأمعاء ، يتم تخزينها في الكبد على شكل استرات الريتينيل ويتم إطلاقها في مجرى الدم كجميع الريتينول المرتبط بالبروتين 4 المرتبط بالريتينول (RBP4). سيتم امتصاص RBP4-retinol الدورة الدموية من قبل الأعضاء الجهازية ، مثل الكبد والرئتين والكلى والعين. ومن ثم ، فإن طريقة القياس الكمي لنواتج الأيض المختلفة لفيتامين أ الغذائي في العين والأعضاء الجهازية أمر بالغ الأهمية لدراسة وظيفة رودوبسين GPCR المناسبة.

في هذه الطريقة ، نقدم طريقة استخراج وتحليل شاملة لتحليل فيتامين أ في أنسجة الفئران. من خلال تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء في المرحلة العادية ، يمكن اكتشاف جميع الأيزومرات ذات الصلة من الريتينالديهايد والريتينول واسترات الريتينيل في وقت واحد من خلال تشغيل واحد ، مما يسمح بالاستخدام الفعال للعينات التجريبية ويزيد من الموثوقية الداخلية عبر مستقلبات فيتامين أ المختلفة داخل نفس العينة. باستخدام هذه الطريقة الشاملة ، سيتمكن الباحثون من تقييم إمدادات فيتامين أ الجهازية بشكل أفضل في وظيفة رودوبسين GPCR.

Introduction

تعد المستقبلات المقترنة ببروتين G (GPCRs) واحدة من أكثر فصيلة البروتينات المعروفة دراسة وتميزا. في وظيفتها الأكثر شهرة ، تعمل GPCRs كمستقبل لسطح الخلية في نقل الإشارة ، وتهيئة الاستجابات داخل الخلايا عند الارتباط برابط معين. تتميز GPCRs بسبعة مجالات حلزونية عبر الغشاء (TM) وستة مجالات حلقة إجمالية. من بين الحلقات الست ، يتم توجيه ثلاث حلقات خارج الخلية لتسهيل ربط الترابط ، بينما تقترن الحلقات الثلاث الأخرى داخل الخلايا ببروتين G غير متجانس يتكون من الوحدات الفرعية Gα و Gβ و Gγ1،2.

تصنف GPCRs إلى عدة فئات ، بما في ذلك الفئة أ شبيهة بالرودوبسين ، وعائلة مستقبلات سيكرتين من الفئة ب ، والغلوتامات من الفئة C ، ومستقبلات فرمون التزاوج الفطري من الفئة D ، ومستقبلات AMP الدورية من الفئة E ، والفئة F المجعد / المنعم3،4. كما يوحي اسمها ، تشتمل الفئة الفرعية من الفئة A الشبيهة بالرودوبسين GPCR على رودوبسين ، GPCR الحرج المسؤول عن النقل الضوئي والوظيفة البصرية. يحتوي رودوبسين على جميع الخصائص الرئيسية ذات الصلة والعناصر الهيكلية الموجودة في النموذج الكنسي ل GPCRs ، بما في ذلك المجالات الحلزونية السبعة المذكورة سابقا TM ، والحلقات الستة خارج الخلية وداخل الخلايا ، والارتباط ببروتين G غير المتجانس ، المعروف أيضا باسم transducin (Gt) في المستقبلات الضوئية1،5،6،7. داخل جيب ربط رودوبسين ، يرتبط 11-cis-retinal ، وهو رابط الكروموفور الحساس للضوء ، بالرودوبسين على ليسين 296 من خلال ارتباط قاعدة Schiff التساهمية ، وبالتالي تشكيل 11-cis-retinylidene1،8. عند امتصاص الفوتون ، يتحول 11-cis-retinylidene الضوئي إلى جميع الريتينيلدين ، مما يؤدي إلى تغيير توافقي داخل رودوبسين. لذلك ، فإن ترابط الشبكية 11-رابطة الدول المستقلة أمر بالغ الأهمية لوظيفة رودوبسين GPCR ، ويجب الحفاظ على إمدادات قوية وفعالة من 11-CIS-retinal بشكل مستمر للتغلب على معدل الدوران المرتفع داخل المستقبلات الضوئية.

تنتمي الريتينالديهايدات مثل 11-cis-retinal إلى مجموعة من الجزيئات تسمى مجتمعة الريتينويدات ، ويشار إلى الرتينويدات ذات الصلة بيولوجيا على نطاق واسع باسم فيتامين أ. تتميز الريتينويدات بمجموعة نهاية دورية متصلة بسلسلة بولين مترافقة ، مع مجموعة نهاية قطبية في الطرف الآخر. الريتينالديهايد والفيتامينات المرتبطة به من فيتامين أ ليست استثناء من هذا التوصيف ، والتي تحتوي على حلقة β-ionone كمجموعة نهاية دورية ، وسلسلة بولين ثنائي تيربين ، ومجموعة نهاية قطبية مختلفة اعتمادا على الفيتامين ، أي مجموعة الألدهيد للريتينالديهايد ، ومجموعة الهيدروكسيل للريتينول ، ومجموعة الكربوكسيل لأحماض الريتينويك ، ورابطة الإستر لاسترات الريتينيل ، إلخ (الشكل 1) 9،10.

لا تستطيع الثدييات تصنيع فيتامين أ دي نوفو ، لكن النباتات يمكنها ؛ لذلك ، يجب أن تنشأ جميع الرتينويدات داخل أنظمة الثدييات من النظام الغذائي للمنتجين النباتيين إلى المستهلكين في السلسلة الغذائية. في النموذج المتعارف عليه لعملية التمثيل الغذائي لفيتامين أ ، يتم امتصاص β-كاروتين ، وهو بروفيتامين أ النموذجي النموذجي ، في الخلايا المعوية المعوية من خلال مستقبلات الزبال من الفئة B ، العضو 1 (SCARB1) ، المنقسمة إلى جزيئين من جميع الشبكية عبر شبكية بواسطة β-كاروتين أوكسجيناز 1 (BCO1 / BCMO1) ، والذي يرتبط ببروتين ربط الريتينالديهايد 2 (RBP2) ويتم اختزاله إلى كل المتحولة- الريتينول بواسطة نازعة هيدروجين الريتينول (RDH) ، يتم تحويله إلى استرات الريتينيل بواسطة الليسيثين ريتينول أسيل ترانسفيراز (LRAT) ، ثم يتم إرساله إلى مجرى الدم في الكيلوميكرون11،12،13،14. من ناحية أخرى ، تعمل استرات الريتينيل ، مثل بالميتات الريتينيل ، كبروفيتامين أ السائد من مصادر حيوانية. يتم تحلل بالميتات الريتينيل من تجويف الأمعاء إلى الريتينول بالكامل بواسطة الكربوكسيل ستيراز 1 (CES1) وينتشر في الخلايا المعويةالمعوية 15. الكبد هو الجهاز الأساسي للتخزين والاستتباب لتوازن فيتامين أ ، والذي يمتص استرات الريتينيل داخل هذه الكيلومكرونات ، والتي يتم تحللها إلى جميع الريتينول المرتبط بالبروتين الخلوي المرتبط بالريتينول 1 (CRBP1) بواسطة هيدرولاز إستر الريتينيل ، ويدخل الخلايا النجمية الكبدية ويتم تحويله مرة أخرى إلى استرات الريتينيل بواسطة LRAT للتخزين13،16 ، 17. للحفاظ على مستوى التماثل لفيتامين أ في الكائن الحي ، يطلق الكبد فيتامين أ في شكل ريتينول متحول بالكامل مرتبط بمركب نقل المصل ، يتكون من بروتين مرتبط بالريتينول 4 (RBP4) وترانسثيريتين (TTR) 15،18،19. سيشار إلى هذا المجمع باسم holo-RBP4 في هذه المخطوطة.

لاستخدام هذا الإمداد الجهازي بفيتامين أ في الدم ، يجب أن يكون للأنسجة الجهازية ، بما في ذلك أنسجة العين حيث يتم الحفاظ على مصدر قوي لفيتامين أ ، طريقة لامتصاص holo-RBP4 في الأنسجة. داخل شبكية العين الغنية بالمستقبلات الضوئية في أنسجة العين ، فإن المستقبل الغشائي الذي يحفزه حمض الريتينويك 6 (STRA6) هو الناقل المتورط في هذه الوظيفة. في الدراسات الميكانيكية ، ثبت أن STRA6 قادر على تسهيل تناول الريتينول خارج الخلية من holo-RBP4 إلى RPE20. سيدخل هذا الريتينول المستورد بالكامل بعد ذلك في الدورة البصرية ، وهي العملية التي يتم من خلالها تحويل الريتينول المتحول بالكامل إلى شبكية 11-رابطة الدول المستقلة داخل RPE والجزء الخارجي للمستقبل الضوئي ، وبالتالي تسهيل الوظيفة البصرية عند ربطها بالرودوبسين9،21.

بمجرد أن يعبر الريتينول المتحول بالكامل من الدورة الدموية holo-RBP4 حاجز الشبكية الدموي إلى RPE داخل أنسجة العين من خلال STRA6 ، يتم استيرات الريتينول المتحول بالكامل في RPE أولا إلى استرات الريتينيل بواسطة LRAT ، ثم تحلل إلى 11-cis-retinol بواسطة بروتين 65 كيلو دالتون الخاص بظهارة الشبكية (RPE65). ثم يتم تحويل 11-CIS-retinol إلى 11-CIS-Retinal بواسطة نازعة هيدروجين الريتينول 5. ثم يتم نقل هذا الشبكية 11-رابطة الدول المستقلة إلى الجزء الخارجي للمستقبلات الضوئية (OS) بواسطة البروتين المرتبط بالريتينويد بين المستقبلات الضوئية (IRBP) 9،21. داخل الشبكة الإندوبلازمية التي تحيط بنواة المستقبلات الضوئية داخل الطبقة النووية الخارجية (ONL) ، يتم تصنيع opsin GPCRs ونقلها عبر الأهداب المتصلة (CC). البروتينات الحركية التي تشارك في هذا النقل عبر CC مثيرة للجدل ، لكن الفرضيات الحالية تورط في كينيسين والنقل داخل السوط القائم على الداينين (IFT) أو النقل القائم على الميوسين على أنه ميسر محتمل لهذه العملية14،22،23،24،25،26. بمجرد أن يلتقي هذان المكونان داخل الأقراص الغشائية داخل نظام التشغيل ، يتشكل 11-cis-retinal و opsin 11-cis-retinylidene من خلال الارتباط التساهمي الأساسي Schiff في lysine 196 على rhodopsin ، جاهز للنقل الضوئي8.

في حين أن التعبير عن STRA6 داخل RPE لشبكية العين يساعد في تسهيل تناول الريتينول المتحول بالكامل من holo-RBP4 ، لم يتم العثور على STRA6 يتم التعبير عنه في الكبد ، على الرغم من دوره كعضو استتبابي رئيسي لفيتامين أ وإظهار القدرات في تناول جميع الريتينول المتحولة من holo-RBP415،19،27،28 ، 29،30،31. في النهاية ، تم اكتشاف مستقبل مماثل يسمى مستقبلات البروتين المرتبط بالريتينول 4 2 (RBPR2) ، مما يدل على القدرة على تناول جميع الريتينول المتحول من holo-RBP4 ، مثل STRA6 ، ولكن يتم التعبير عنه في الأنسجة الكبدية32.

لذلك ، فإن الفهم الكامل لدور رودوبسين في الوظيفة البصرية يتطلب فهما للعمليات البيولوجية التي تبلغ ذروتها في تجديد الصبغة البصرية. وهذا بدوره يرتبط ارتباطا وثيقا بالعمليات الموصوفة سابقا ، بما في ذلك استقلاب سلائف بروفيتامين أ ، والتخزين داخل الكبد ، وإطلاق holo-RBP4 بواسطة الكبد ، والامتصاص النهائي ل holo-RBP4 من خلال مستقبلات غشاء STRA6 و RBPR2. كما ذكرنا أعلاه ، تظل النماذج الحيوانية مثل الفئران واحدة من النماذج الرئيسية في دراسة مثل هذه العمليات. ومن ثم ، نود أن نقدم طريقة استخراج للريتينويدات في أنسجة الفئران ، بالإضافة إلى طريقة اللونيات السائلة عالية الأداء (HPLC) ذات المرحلة العادية التي يمكنها اكتشاف هذه الريتينويدات وتحديدها. باستخدام هذه الطرق ، يمكن تحليل الرتينويدات المهمة الموضحة أعلاه ، مثل رابطة الرتينويد 11-رابطة الدول المستقلة رودوبسين أو الريتينويد الناقل الرئيسي لجميع الريتينول ، في الأعضاء العينية والكبدية والجهازية. من خلال تقييم إمدادات الريتينويد في أنسجة الفئران ، يمكن تطوير فهمنا لحالات المرض والأمراض المتعلقة بالإمداد اللوجستي للريتينويدات.

إلى جانب العمل ككروموفور في الوظيفة البصرية من خلال الارتباط ب opsin GPCRs ، تلعب الرتينويدات أيضا دورا رئيسيا في إشارات خلايا الثدييات من خلال إشارات حمض الريتينويك ، والتي تسهلها عائلتان من المستقبلات النووية ، مستقبلات حمض الريتينويك (RARs) ومستقبلات الريتينويد X (RXRs) ، التي ترتبط مباشرة بالحمض النووي والنسخ الجيني المنظم33. تستخدم هاتان العائلتان أو المستقبلات الرتينويدات في شكل أحماض الريتينويك مثل الترابط. لقد ثبت أن RARs لها تقارب مع كل من حمض الريتينويك المتنقل وحمض 9-cis-retinoic ، في حين أن RXRs تعبر عن تقارب مع حمض الريتينويك 9-CIS-34،35 فقط. أحماض الريتينويك بكميات غير خاضعة للرقابة مسخة ، ويجب التحكم في إشارات حمض الريتينويك بإحكامشديد 36. يجب أن يحدث إنتاج أحماض الريتينويك للإشارات محليا وفي نقاط زمنية محددة للغاية للتطور السليم للأنسجة ، كما هو الحال في نمو الدماغ الخلفي والأطراف ، ولكن هناك أمثلة أخرى لا حصر لها تستخدم إشارات حمض الريتينويك37،38. داخل الخلايا المشاركة في إشارات حمض الريتينويك ، يتم تصنيع أحماض الريتينويك بواسطة مجموعتين من الإنزيمات ، نازعة هيدروجين الكحول / الريتينول (ADHs / RDHs) التي تسهل أكسدة الريتينول التي يتم تناولها بواسطة STRA6 أو RBPR2 إلى الريتينالديهايد ، ونازعات هيدروجين الريتينالديهايد (RALDHs) التي تسهل أكسدة الريتينالديهايد إلى أحماض الريتينويك39. على الرغم من عدم المشاركة في إشارات GPCR في حد ذاتها ، إلا أن أحماض الريتينويك موجودة كريتينويد حاسم يعمل أيضا كرابط لمستقبلات الإشارات.

على الرغم من عدم وصفها بالتفصيل هنا ، نود أن نعترف بالطرق التي تم إنشاؤها مسبقا للكشف عن الريتينويد باستخدام HPLC عبر سياقات مختلفة ، مثل أبحاث الغذاء ودراسة رودوبسين الميكروبي. تستخدم هذه الطرق أهدافا ومناهج مختلفة للكشف عن الريتينويد ، بما في ذلك استخدام تقنيات المرحلة العكسية التي تتطلب مراحل متنقلة أقل تقلبا وخطورة40،41،42 ، والكشف عن أحماض الريتينويك والأيزومرات المرتبطة بها40،41 ، والتنقية والاستخراج من مصادر بيولوجيةمختلفة 43. تركز طريقتنا بشكل خاص على الكشف عن بالميتات الريتينيل وأيزومرات الريتينالديهايد وأيزومرات الريتينول من أنسجة الثدييات. يجب النظر في بروتوكولات مختلفة إذا كانت حالة الاستخدام المقصودة تختلف عن هذا التطبيق المحدد.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) بجامعة مينيسوتا (البروتوكول # 2312-41637A) وتم إجراؤها وفقا لبيان ARVO لاستخدام في أبحاث طب العيون والرؤية. قم بإجراء جميع عمليات الاستخراج في الظلام ، تحت ضوء أحمر خافت للإضاءة. كن على دراية بالضوء المتبقي المنبعث من شاشات العدادات ومصابيح LED الملحقة.

1. الجيل القياسي للريتينويد الطيفي وتوليد المنحنى القياسي الخارجي

ملاحظة: قم بإعداد وعاء ثلج جاف للتخزين المؤقت للريتينويدات قبل التحليل باستخدام HPLC.

  1. قم بوزن كمية تعسفية ولكن مناسبة من الريتينويدات وحلها في مذيب مناسب للقياس الكمي من خلال القياس الطيفي.
    ملاحظة: المذيب المفضل المستخدم في هذه الدراسة هو الإيثانول ، وقيم الامتصاصية المولية للريتينويد المذابة في الإيثانول مفصلة في الجدول 1. يجب استخدام الإيثانول اللامائي من الدرجة HPLC لإذابة المعايير والعينات. يشكل الإيثانول المنقى فقط من خلال التقطير خليطا أجيوتروبيا مع الماء ، يحتوي على ما يقرب من 4٪ من الماء من حيث الحجم. الماء غير قابل للامتزاج مع الطور المتحرك الهكسانوي وسيؤدي إلى ترطيب مرحلة السيليكا الثابتة ، مما يؤدي إلى تدهور العمود في نهاية المطاف.
  2. باستخدام قانون Beer-Lambert والامتصاصية المولية للريتينويد ذي الصلة ، حدد تركيز المعيار المتولد (الجدول 1).
    الامتصاص = الامتصاص المولي (ε) × تركيز المولار × طول المسار
  3. قم بإجراء التخفيفات التسلسلية لإنشاء تركيزات يمكن أن تولد منحنى قياسيا ضمن نطاق القياس الكمي للأنسجة المطلوبة.
    ملاحظة: كن على دراية بالقيود الأساسية لقانون Beer-Lambert ، مثل افتقاره إلى الصلاحية مع تركيزات عالية من التحليل. لتجنب هذه المشكلة ، يجب أن تتجنب معايير الريتينويد المخففة توليد قيم امتصاص أكبر من 1. بالنسبة لتطبيقاتنا في القياس الكمي للريتينول والريتينالديهايد في أعضاء الفئران ، وجدنا أن منحنى المعايرة الذي يتراوح بين 1-10 نانوغرام كان قادرا على تغطية الكميات النموذجية الموجودة. بالنسبة لقياس كمية بالميتات الريتينيل من كبد الفئران ، وجدنا أن منحنى المعايرة بنطاق 20-80 ميكروغرام كان قادرا على تغطية الكميات النموذجية الموجودة.
  4. من خلال التغيير التدريجي لحجم الحقن من محلول المخزون الذي تم إنشاؤه مسبقا ، وبالتالي تغيير الكمية المحقونة من الريتينويد بشكل تدريجي ، قم بدمج القمم لإنشاء منحنى قياسي خارجي مناسب لقياس كمية الريتينويد حيث يتناسب تكامل الذروة طرديا مع كمية الريتينويد المحقون.

2. حصاد الأنسجة وجمع العينات

ملاحظة: قم بإعداد وعاء ثلج جاف للتخزين المؤقت للأنسجة قبل تجانس الأنسجة واستخراج الريتينويد. يتم تفصيل كميات حصاد الأنسجة الموصى بها في الجدول 2. لحساب الاختلافات في الريتينويد بسبب الاختلافات في محتوى الدم لكل نسيج ، يجب أن يتم استخراج الأنسجة على الفئران المغمورة بالكامل ، ويجب إكمال استخراج الدم على فئران منفصلة.

  1. قتل الفئران باتباع الإرشادات التي وضعتها البروتوكول الذي تمليه اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) (اختناق ثاني أكسيد الكربون2 هنا).
  2. الدم: مباشرة بعد القتل الرحيم ، اقطع رأس الفئران بمقص ، واستنزاف الدم من الجذع الرئيسي للفئران في أنبوب سعة 1.5 مل.
  3. العين: باستخدام زوج من الملقط ، قم بإزالة العينين من الرأس المقطوع.
  4. الدماغ: باستخدام مقص صغير ، قم بقطع الرأس المقطوع وإزالة الدماغ باستخدام زوج من الملقط.
  5. الكلى والكبد والطحال والقلب والرئة: باستخدام مقص صغير ، قم بعمل شق في البطن ، واقطعه في الاتجاه العلوي على طول خط الوسط ، واقطع القص والقفص الصدري. قم بإزالة الأنسجة المكشوفة باستخدام زوج من الملقط.

3. تجانس الأنسجة

ملاحظة: إذا كان من المطلوب تحليل أقسام أصغر من الأعضاء ، كما هو الحال في الأعضاء الكبيرة (على سبيل المثال ، أنسجة الكبد أو الرئة) ، فيجب تجانس العضو بأكمله لتجنب الاختلافات في محتوى الريتينويد في أجزاء مختلفة من الأنسجة. بدلا من ذلك ، قم بتقسيم التجانس إذا كانت هناك رغبة في كميات أقل من الأنسجة. تم تفصيل مخطط للبروتوكول في الشكل 2. تم اقتباس هذا البروتوكول المعدل من كين ونابولي44.

  1. ضع الأنسجة في أنبوب طاحونة الأنسجة ، جنبا إلى جنب مع 50٪ محلول ملحي مثلج (0.9٪) و 50٪ ميثانول. انظر الجدول 2 لمعرفة الحجم المستخدم لكل نوع من أنواع الأنسجة.
  2. ضع المدقة في أنبوب المطحنة ، وقم بإجراء خمس دورات كاملة ببطء وبرفق مع المدقة للحصول على تجانس.
  3. نقل العينات إلى أنابيب 15 مل مباشرة بعد التجانس.
  4. أضف 2 مل من الميثانول واتركه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: إذا كان تحليل مشتقات أوكسيم الريتينالديهايد مطلوبا ، أضف 1 مل من 0.1 M هيدروكسيلامين هيدروكلوريد في 0.1 M HEPES (الرقم الهيدروجيني 6.5) (الشكل 1).

4. استخراج الريتينويد

تنبيه: الهكسان شديد الاشتعال وشديد التقلب وشديد السمية. يجب استخدام أجهزة التنفس المعتمدة من المعهد الوطني للسلامة والصحة المهنية (NIOSH) ، وحماية العين ، وقفازات البوتيل ، وغطاء الدخان عند التعامل مع الهكسان. عند تبخير الهكسان من العينات ، يوصى باستخدام شكل من أشكال جهاز دوران الهواء المحسن لمنع تراكم أبخرة المذيبات ، على سبيل المثال ، جهاز شفط الغطس.

  1. أضف 10 مل من الهكسان إلى الدوامة وخلط الأنبوب أفقيا لمدة 10 ثوان على الأقل.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان أن تختلط المراحل بالكامل.
  2. الطرد المركزي خليط المتجانس / الهكسان لمدة 3 دقائق عند 1,000 × جم لتسهيل فصل الطور.
  3. قم بإجراء الاستخراج 2x لضمان الاستخراج الكلي للريتينويدات من المتجانس. كرر الخطوتين 4.1 و 4.2.
  4. اسحب طبقة الهكسان باستخدام ماصة وضع طبقة الهكسان في مجموعة منفصلة من الأنابيب الزجاجية سعة 15 مل للتبخر الفراغي.
    ملاحظة: للتبخر ، استخدم أنابيب زجاجية سعة 15 مل لتجنب التصاق الرتينويدات بجدران الأنبوب.
  5. باستخدام جهاز طرد مركزي فراغ ، تبخر الهكسان تماما.

5. إعادة التعليق وتحليل HPLC

ملاحظة: نظرا لأن نظام HPLC المستخدم في هذه المخطوطة كان نظام مضخة ثنائي ، فقد تم خلط المرحلة المتنقلة المكونة من أربعة مكونات مسبقا في زجاجة مفردة قبل التشغيل.

تنبيه: جميع المذيبات العضوية الأربعة المستخدمة في هذه الطريقة شديدة الاشتعال وشديدة التقلب وشديدة السمية. 1،4-ديوكسان عرضة لتكوين بيروكسيد متفجر عند التعرض للأكسجين. احتفظ بجميع الأوعية التي تحتوي على 1،4-ديوكسان مغلقة عندما لا تكون قيد الاستخدام. يجب استخدام أجهزة التنفس المعتمدة من المعهد الوطني للسلامة والصحة المهنية (NIOSH) ، وحماية العين ، وقفازات البوتيل ، وغطاء الدخان عند التعامل مع هذه المذيبات. أثناء تشغيل هذه المذيبات في HPLC ، يوصى باستخدام شكل من أشكال جهاز دوران الهواء المحسن لمنع تراكم أبخرة المذيبات ، على سبيل المثال ، جهاز شفط الغطس.

  1. أعد تعليق الأنبوب المجفف سعة 15 مل مع 100 ميكرولتر من الهكسان ؛ دوامة جيدا للتأكد من إذابة جميع الرتينويدات.
  2. ماصة كل 100 ميكرولتر من الهكسان في ملحق زجاجي واحد لتحليل HPLC.
  3. إعداد تشغيل HPLC (مقتبس من Landers and Olson45): المرحلة المتنقلة: 85.4٪ هكسان (حجم / حجم) ، 11.2٪ أسيتات إيثيل (حجم / حجم) ، 2٪ ديوكسان (حجم / حجم) ، 1.4٪ 1-أوكتانول (حجم / حجم) ؛ العمود: عمودان 4.6 مم × 250 نانومتر ، 5 ميكرومتر ، متصلان في سلسلة ؛ درجة حرارة ترموستات متعدد الأعمدة: 25 درجة مئوية ؛ حجم الحقن: 100 ميكرولتر ؛ معدل التدفق: 1 مل / دقيقة ؛ وقت التشغيل: 40 دقيقة. استخدام الكشف عن امتصاص طيف الأشعة فوق البنفسجية. احتفظ بالخيار المحدد للحصول على طيف الأشعة فوق البنفسجية من 200 نانومتر إلى 400 نانومتر.

6. تحديد الذروة والتكامل

  1. حدد القمم باستخدام وقت الاستبقاء وأطياف الأشعة فوق البنفسجية لكل ريتينويد ذي أهمية كما لوحظ من تحليل معايير الريتينويد (الشكل 3 والجدول 3 والجدول 4).
  2. باستخدام نظام البيانات الكروماتوغرافية لنظام HPLC المختار ، قم بدمج القمم المحددة. يتناسب التكامل أو المساحة الموجودة أسفل المنحنى طرديا مع كمية المادة التحليلية. راجع المنحنى القياسي الخارجي الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1 لتحديد كمية المادة التحليلية.
    1. لتحليل الكروماتوغرامات الناتجة عن الأنسجة البيولوجية ، استخدم التكامل اليدوي على التكامل التلقائي الذي توفره أنظمة البيانات الكروماتوغرافية النموذجية ، حيث غالبا ما يتم ملاحظة التغيرات في المعلمات مثل وقت الاحتفاظ في مثل هذه العينات.
    2. تأكد من أن الكروماتوغرامات لا تظهر مخالفات قد تشير إلى مشكلات أثناء التشغيل ، مثل خطوط الأساس الصاخبة أو القمم غير الغوسية. تشير هذه المشكلات إلى وجود ملوثات في HPLC أو تآكل الأعمدة ويجب تصحيحها لتحليلها بشكل صحيح.

النتائج

هنا ، استخدمنا الطريقة الموضحة أعلاه لاكتشاف وتحديد الرتينويدات في أنسجة العين والجهازية للفئران وإنشاء مخططات كروماتوغرامية تمثيلية. سنقدم أيضا ملخصا للرتينويدات النموذجية التي يمكن اكتشافها في هذه الأنسجة.

في عمر 6 أشهر ، تم القتل الرحيم للفئران من خل...

Discussion

في هذه الطريقة ، يتم استخدام HPLC في المرحلة العادية لاكتشاف وتحديد كمية الريتينويدات ذات الصلة ، بما في ذلك استرات الريتينيل والريتينالديهايد والريتينول. نظرا لأهمية 11-cis-retinal باعتباره الصبغة الحرجة في تنشيط رودوبسين GPCR ، فإن الطريقة التي يمكنها اكتشاف المستقلبات ا?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح NIH-NEI (EY030889 و 3R01EY030889-03S1) وجزئيا من خلال صناديق بدء تشغيل جامعة مينيسوتا إلى GPL. نود أيضا أن نشكر المعهد الوطني للعيون على تزويدنا بمعيار 11-cis-retinal المستخدم في هذه المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma204-661-8
11-cis-retinalNational Eye InstituteN/A
11-cis-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252105
13-cis-retinalToronto Research ChemicalsTRC-R239900
13-cis-retinolToronto Research ChemicalsTRC-R252110
All-trans-RetinalToronto Research ChemicalsTRC-R240000
All-trans-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma205-500-4
Hexane, HPLC GradeFisher Scientific, Spectrum Chemical18-610-808
Methanol (HPLC)Fisher ScienctificA452SK-4
Retinyl PalmitateToronto Research ChemicalsTRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction CollectorAgilentG1364F
1260 Infinity II Binary PumpAgilentG7112B
1260 Infinity II Diode Array DetectorAgilentG7115A
1260 Infinity II Multicolumn ThermostatAgilentG7116A
1260 Infinity II VialsamplerAgilentG7129A
ST40R Refrigerated CentrifugeThermo ScientificTSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge ConcentratorEppendorf22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top VialsAgilent5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mmAgilent5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge TubesMillipore SigmaCLS9950215
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feetAgilent5183-2088

References

  1. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
  2. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G. F., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459 (7245), 356-363 (2009).
  3. Alhosaini, K., Azhar, A., Alonazi, A., Al-Zoghaibi, F. GPCRs: The most promiscuous druggable receptor of the mankind. Saudi Pharm J. 29 (6), 539-551 (2021).
  4. Hu, G. -. M., Mai, T. -. L., Chen, C. -. M. Visualizing the GPCR network: Classification and evolution. Sci Rep. 7 (1), 15495 (2017).
  5. Lerea, C. L., Somers, D. E., Hurley, J. B., Klock, I. B., Bunt-Milam, A. H. Identification of specific transducin α subunits in retinal rod and cone photoreceptors. Science. 234 (4772), 77-80 (1986).
  6. Gao, Y., Hu, H., Ramachandran, S., Erickson, J. W., Cerione, R. A., Skiniotis, G. Structures of the rhodopsin-transducin complex: Insights into G protein activation. Mol Cell. 75 (4), 781-790.e3 (2019).
  7. Zhou, X. E., Melcher, K., Xu, H. E. Structure and activation of rhodopsin. Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 291-299 (2012).
  8. Robinson, P. R., Cohen, G. B., Zhukovsky, E. A., Oprian, D. D. Constitutively active mutants of rhodopsin. Neuron. 9 (4), 719-725 (1992).
  9. Kiser, P. D., Golczak, M., Palczewski, K. Chemistry of the retinoid (visual) cycle. Chem Rev. 114 (1), 194-232 (2014).
  10. Sani, B. P., Hill, D. L. [3] Structural characteristics of synthetic retinoids. Methods Enzymol. 189, 43-50 (1990).
  11. Lobo, G. P., Amengual, J., Palczewski, G., Babino, D., von Lintig, J. Carotenoid-oxygenases: Key players for carotenoid function and homeostasis in mammalian biology. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 78-87 (2012).
  12. Amengual, J., et al. Two carotenoid oxygenases contribute to mammalian provitamin A metabolism. J Biol Chem. 288 (47), 34081-34096 (2013).
  13. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  14. Leung, M., et al. The logistical backbone of photoreceptor cell function: Complementary mechanisms of dietary vitamin A receptors and rhodopsin transporters. Int J Mol Sci. 25 (8), 4278 (2024).
  15. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987 (2021).
  16. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: The long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411 (2022).
  17. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  18. D'Ambrosio, D. N., Clugston, R. D., Blaner, W. S. Vitamin A metabolism: An update. Nutrients. 3 (1), 63-103 (2011).
  19. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  20. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  21. Kiser, P. D., Golczak, M., Maeda, A., Palczewski, K. Key enzymes of the retinoid (visual) cycle in vertebrate retina. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 137-151 (2012).
  22. Radhakrishnan, R., et al. The role of motor proteins in photoreceptor protein transport and visual function. Ophthalmic Genet. 43 (3), 285-300 (2022).
  23. Solanki, A. K., et al. Loss of motor protein MYO1C causes rhodopsin mislocalization and results in impaired visual function. Cells. 10 (6), 1322 (2021).
  24. Liu, X., Udovichenko, I. P., Brown, S. D. M., Steel, K. P., Williams, D. S. Myosin VIIa participates in opsin transport through the photoreceptor cilium. J Neurosci. 19 (15), 6267-6274 (1999).
  25. Insinna, C., Besharse, J. C. Intraflagellar transport and the sensory outer segment of vertebrate photoreceptors. Dev Dyn. 237 (8), 1982-1992 (2008).
  26. Krock, B. L., Mills-Henry, I., Perkins, B. D. Retrograde intraflagellar transport by cytoplasmic dynein-2 is required for outer segment extension in vertebrate photoreceptors but not arrestin translocation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (11), 5463-5471 (2009).
  27. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  28. Bouillet, P., et al. Developmental expression pattern of Stra6, a retinoic acid-responsive gene encoding a new type of membrane protein. Mech Dev. 63 (2), 173-186 (1997).
  29. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  30. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229-242 (2015).
  31. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J. Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  32. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  33. Chawla, A., Repa, J. J., Evans, R. M., Mangelsdorf, D. J. Nuclear receptors and lipid physiology: Opening the X-files. Science. 294 (5548), 1866-1870 (2001).
  34. Heyman, R. A., et al. 9-cis retinoic acid is a high affinity ligand for the retinoid X receptor. Cell. 68 (2), 397-406 (1992).
  35. Allenby, G., et al. Retinoic acid receptors and retinoid X receptors: interactions with endogenous retinoic acids. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (1), 30-34 (1993).
  36. Das, B. C., et al. Retinoic acid signaling pathways in development and diseases. Bioorg Med Chem. 22 (2), 673-683 (2014).
  37. Hernandez, R. E., Putzke, A. P., Myers, J. P., Margaretha, L., Moens, C. B. Cyp26 enzymes generate the retinoic acid response pattern necessary for hindbrain development. Development. 134 (1), 177-187 (2007).
  38. Yashiro, K., et al. Regulation of retinoic acid distribution is required for proximodistal patterning and outgrowth of the developing mouse limb. Dev Cell. 6 (3), 411-422 (2004).
  39. Duester, G. Families of retinoid dehydrogenases regulating vitamin A function. Eur J Biochem. 267 (14), 4315-4324 (2000).
  40. Tatum, V., Chow, C. K. Rapid measurement of retinol, retinal, 13-cis-retinoic acid and all-trans-retinoic acid by high performance liquid chromatography. J Food Drug Anal. 13 (3), (2020).
  41. Teerlink, T., Copper, M. P., Klaassen, I., Braakhuis, B. J. M. Simultaneous analysis of retinol, all-trans- and 13-cis-retinoic acid and 13-cis-4-oxoretinoic acid in plasma by liquid chromatography using on-column concentration after single-phase fluid extraction. J Chromatogr B. Biomed Sci App. 694 (1), 83-92 (1997).
  42. Egberg, D. C., Heroff, J. C., Potter, R. H. Determination of all-trans and 13-cis vitamin A in food products by high-pressure liquid chromatography. J Agric Food Chem. 25 (5), 1127-1132 (1977).
  43. Sudo, Y., et al. A microbial rhodopsin with a unique retinal composition shows both sensory rhodopsin II and bacteriorhodopsin-like properties. J Biol Chem. 286 (8), 5967-5976 (2011).
  44. Kane, M. A., Napoli, J. L. Quantification of endogenous retinoids. Methods Mol Biol. 652, 1-54 (2010).
  45. Landers, G. M., Olson, J. A. Rapid, simultaneous determination of isomers of retinal, retinal oxime and retinol by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A. 438, 383-392 (1988).
  46. Hubbard, R., Brown, P. K., Bownds, D. [243] Methodology of vitamin A and visual pigments. Methods Enzymol. 18, 615-653 (1971).
  47. Robeson, C. D., et al. Chemistry of vitamin A. XXIV. The synthesis of geometric isomers of vitamin A via methyl β-methylglutaconate1. J Am Chem Soc. 77 (15), 4111-4119 (1955).
  48. Robeson, C. D., Blum, W. P., Dieterle, J. M., Cawley, J. D., Baxter, J. G. Chemistry of vitamin A. XXV. Geometrical isomers of vitamin A aldehyde and an isomer of its α-ionone analog1. J Am Chem Soc. 77 (15), 4120-4125 (1955).
  49. Hubinger, J. C. Determination of retinol, retinyl palmitate, and retinoic acid in consumer cosmetic products. J Cosmet Sci. 60 (5), 485-500 (2009).
  50. Bhat, P. V., Co, H. T., Lacroix, A. Effect of 2-alkanols on the separation of geometric isomers of retinol in non-aqueous high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A. 260, 129-136 (1983).
  51. Stancher, B., Zonta, F. Quantitative high-performance liquid chromatographic method for determining the isomer distribution of retinol (vitamin A1) and 3-dehydroretinol (vitamin A2) in fish oils. J Chromatogr. 312, 423-434 (1984).
  52. Zonta, F., Stancher, B. High-performance liquid chromatography of retinals, retinols (vitamin A1) and their dehydro homologues (vitamin A2): improvements in resolution and spectroscopic characterization of the stereoisomers. J Chromatogr A. 301, 65-75 (1984).
  53. van Kuijk, F. J., Handelman, G. J., Dratz, E. A. Rapid analysis of the major classes of retinoids by step gradient reversed-phase high-performance liquid chromatography using retinal (O-ethyl) oxime derivatives. J Chromatogr. 348 (1), 241-251 (1985).
  54. Kane, M. A., Folias, A. E., Napoli, J. L. HPLC/UV quantitation of retinal, retinol, and retinyl esters in serum and tissues. Anal Biochem. 378 (1), 71-79 (2008).
  55. Widjaja-Adhi, M. A. K., Ramkumar, S., von Lintig, J. Protective role of carotenoids in the visual cycle. FASEB J. 32 (11), 6305-6315 (2018).
  56. Ramkumar, S., Jastrzebska, B., Montenegro, D., Sparrow, J. R., von Lintig, J. Unraveling the mystery of ocular retinoid turnover: Insights from albino mice and the role of STRA6. J Biol Chem. 300 (3), 105781 (2024).
  57. de Grip, W. J., Lugtenburg, J. Isorhodopsin: An undervalued visual pigment analog. Colorants. 1 (3), 256-279 (2022).
  58. Fan, J., Rohrer, B., Moiseyev, G., Ma, J., Crouch, R. K. Isorhodopsin rather than rhodopsin mediates rod function in RPE65 knock-out mice. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13662-13667 (2003).
  59. Sparrow, J. R. Bisretinoids of RPE lipofuscin: Trigger for complement activation in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol. 703, 63-74 (2010).
  60. Różanowska, M., Handzel, K., Boulton, M. E., Różanowski, B. Cytotoxicity of all-trans-retinal increases upon photodegradation. Photochem Photobiol. 88 (6), 1362-1372 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

GPCR 4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved