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  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, se describe un método de cromatografía líquida de alta resolución en fase normal para detectar y cuantificar los retinoides críticos involucrados en la facilitación de la función visual tanto en el tejido ocular como en el sistémico, en el contexto del suministro sistémico de vitamina A para generar el cromóforo de rodopsina 11-cis-retinal fotosensible esencial.

Resumen

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son una superfamilia de proteínas transmembrana que inician cascadas de señalización a través de la activación de su proteína G al asociarse con su ligando. En toda la visión de los mamíferos, la rodopsina es el GPCR responsable del inicio de la cascada de fototransducción. Dentro de los fotorreceptores, la rodopsina se une a su cromóforo 11-cis-retinal y se activa a través de la isomerización sensible a la luz de 11-cis-retinal a todo trans-retinal, que activa la proteína G de la transducina, lo que da lugar a la cascada de fototransducción.

Si bien la fototransducción se conoce bien, los procesos que están involucrados en el suministro de precursores de vitamina A en la dieta para la generación de 11-cis-retinal en el ojo, así como las enfermedades que resultan en la interrupción de este suministro, aún no se comprenden completamente. Una vez que los precursores de la vitamina A se absorben en el intestino, se almacenan en el hígado como ésteres de retinilo y se liberan en el torrente sanguíneo como todo trans-retinol unido a la proteína de unión al retinol 4 (RBP4). Este RBP4-retinol circulatorio será absorbido por los órganos sistémicos, como el hígado, los pulmones, el riñón y los ojos. Por lo tanto, un método para la cuantificación de los diversos metabolitos de la vitamina A dietética en los ojos y los órganos sistémicos es fundamental para el estudio de la función adecuada de la rodopsina GPCR.

En este método, presentamos un método analítico y de extracción integral para el análisis de vitamina A en tejido murino. A través del análisis de cromatografía líquida de alta resolución en fase normal, todos los isómeros relevantes de retinaldehídos, retinoles y ésteres de retinilo se pueden detectar simultáneamente a través de una sola ejecución, lo que permite el uso eficiente de muestras experimentales y aumenta la confiabilidad interna entre diferentes metabolitos de vitamina A dentro de la misma muestra. Con este método integral, los investigadores podrán evaluar mejor el suministro sistémico de vitamina A en la función de GPCR de rodopsina.

Introducción

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) son una de las superfamilias de proteínas más estudiadas y caracterizadas que se conocen. En su función más conocida, los GPCR sirven como un receptor de superficie celular en la transducción de señales, inicializando respuestas intracelulares al unirse con un ligando específico. Los GPCR se caracterizan por siete dominios helicoidales transmembrana (TM) y seis dominios de bucle total. De los seis bucles, tres están orientados extracelularmente para facilitar la unión del ligando, mientras que los otros tres bucles intracelulares están acoplados a una proteína G heterotrimérica que consta de las subunidades Gα, Gβ y Gγ 1,2.

Los GPCR se clasifican en varias clases, incluyendo Clase A similar a la rodopsina, familia de receptores de secretina de clase B, glutamato de clase C, receptores de feromonas de apareamiento fúngico de clase D, receptores de AMP cíclico de clase E y clase F Frizzled/Smoothened 3,4. Como su nombre indica, la subclase de clase A similar a la rodopsina GPCR incluye la rodopsina, el GPCR crítico responsable de la fototransducción y la función visual. La rodopsina contiene todas las características clave pertinentes y los elementos estructurales que se encuentran en el modelo canónico de GPCR, incluidos los siete dominios helicoidales TM mencionados anteriormente, los seis bucles extracelulares e intracelulares, y la asociación con una proteína G heterotrimérica, también conocida como transducina (Gt) en los fotorreceptores 1,5,6,7. Dentro del bolsillo de unión de la rodopsina, el 11-cis-retinal, el ligando cromóforo sensible a la luz, se une a la rodopsina en la lisina 296 a través de un enlace covalente de la base de Schiff, formando así 11-cis-retinilideno 1,8. Tras la absorción de un fotón, el 11-cis-retinilideno se fotoisomeriza en todo trans-retinilideno, induciendo un cambio conformacional dentro de la rodopsina. Por lo tanto, el ligando 11-cis-retinal es fundamental para la función de la rodopsina GPCR, y se debe mantener continuamente un suministro robusto y eficiente de 11-cis-retinal para superar la alta tasa de recambio dentro de los fotorreceptores.

Los retinaldehídos, como el 11-cis-retinal, pertenecen a un grupo de moléculas llamadas colectivamente retinoides, y los retinoides biológicamente relevantes se conocen más ampliamente como vitamina A. Los retinoides se caracterizan por un grupo extremo cíclico conectado a una cadena de polieno conjugada, con un grupo extremo polar en el otro extremo. Los retinaldehídos y las vitaminas asociadas a la vitamina A no son una excepción a esta caracterización, ya que contienen el anillo de β-ionona como grupo final cíclico, una cadena de polieno diterpénico y un grupo terminal polar diferente según el vitámero, es decir, grupo aldehído para los retinaldehídos, grupo hidroxilo para los retinoles, grupo carboxilo para los ácidos retinoicos, enlace éster para los ésteres de retinilo, etc (Figura 1)9,10.

Los mamíferos no pueden sintetizar vitamina A de novo, pero las plantas sí; Por lo tanto, todos los retinoides dentro de los sistemas de mamíferos deben originarse en la dieta de los productores de origen vegetal y llegar a los consumidores en la cadena alimentaria. En el modelo canónico del metabolismo de la vitamina A, el β-caroteno, la planta arquetípica provitamina A, se absorbe en el enterocito intestinal a través del receptor eliminador de clase B, miembro 1 (SCARB1), escindido en dos moléculas de todo trans-retinal por la β-caroteno oxigenasa 1 (BCO1/BCMO1), que se une a la proteína de unión al retinaldehído 2 (RBP2) y se reduce a todo trans-retinol por retinol deshidrogenasas (RDH), convertido en ésteres de retinilo por lecitina retinol aciltransferasa (LRAT), y luego enviado al torrente sanguíneo en quilomicrones 11,12,13,14. Los ésteres de retinilo, como el palmitato de retinilo, por otro lado, sirven como la provitamina A predominante de origen animal. El palmitato de retinol de la luz intestinal se hidroliza en todo trans-retinol por la carboxilésterasa 1 (CES1) y se difunde en el enterocito intestinal15. El hígado es el principal órgano de almacenamiento y homeostático para la homeostasis de la vitamina A, que absorbe los ésteres de retinilo dentro de estos quilomicrones, que se hidrolizan en todo trans-retinol unido a la proteína celular de unión al retinol 1 (CRBP1) por hidrolasas de éster de retinilo, ingresa a las células estrelladas hepáticas y LRAT lo convierte nuevamente en ésteres de retinilo para su almacenamiento 13,16, Artículo 17. Para mantener un nivel homeostático de vitamina A en el organismo, el hígado libera vitamina A en forma de trans-retinol unido a un complejo de transporte sérico, formado por la proteína 4 de unión al retinol (RBP4) y la transtiretina (TTR)15,18,19. Este complejo se denominará holo-RBP4 en este manuscrito.

Para utilizar este suministro sistémico de vitamina A en la sangre, los tejidos sistémicos, incluido el tejido ocular donde se mantiene una fuente robusta de vitamina A, deben tener un método para absorber holo-RBP4 en el tejido. Dentro de la retina rica en fotorreceptores en el tejido ocular, el receptor de membrana estimulado por el ácido retinoico 6 (STRA6) es el transportador implicado en esta función. En estudios mecanicistas, se ha demostrado que STRA6 es capaz de facilitar la ingesta de todo-trans-retinol extracelular de holo-RBP4 en el RPE20. Este todo-trans-retinol importado entrará entonces en el ciclo visual, que es el proceso por el cual el todo-trans-retinol se convierte en 11-cis-retinal dentro del EPR y el segmento externo del fotorreceptor, facilitando así la función visual cuando se une a la rodopsina 9,21.

Una vez que el trans-retinol circulatorio del holo-RBP4 circulatorio cruza la barrera hematorretiniana hacia el EPR dentro del tejido ocular a través de STRA6, el trans-retinol completo en el EPR se esterifica primero en ésteres de retinilo por LRAT, luego se hidroliza en 11-cis-retinol por la proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina (RPE65). A continuación, el 11-cis-retinol se convierte en 11-cis-retinal por la retinol deshidrogenasa 5. Este 11-cis-retinal es transportado al segmento externo del fotorreceptor (OS) por la proteína de unión al retinoide interfotorreceptor (IRBP)9,21. Dentro del retículo endoplásmico que rodea el núcleo fotorreceptor dentro de la capa nuclear externa (ONL), los GPCR opsina se sintetizan y transportan a través del cilio de conexión (CC). Las proteínas motoras que están involucradas en este transporte a través del CC son polémicas, pero las hipótesis actuales implican el transporte intraflagelar (IFT) basado en kinesina y dineína o el transporte basado en miosina como probables facilitadores de este proceso 14,22,23,24,25,26. Una vez que estos dos componentes se encuentran dentro de los discos membranosos dentro del sistema operativo, el 11-cis-retinal y la opsina forman 11-cis-retinilideno a través de un enlace covalente de base Schiff en lisina 196 en rodopsina, listo para la fototransducción8.

Si bien la expresión de STRA6 dentro del EPR de la retina ayuda a facilitar la ingesta de todo el trans-retinol del holo-RBP4, no se encontró que STRA6 se expresara en el hígado, a pesar de su papel como el principal órgano homeostático de la vitamina A y de exhibir capacidades para la ingesta de todo el trans-retinol del holo-RBP4 15,19,27,28, 29,30,31. Eventualmente, se descubrió un receptor análogo llamado receptor 2 de la proteína 4 de unión al retinol (RBPR2), que exhibe la capacidad de ingerir todo el trans-retinol del holo-RBP4, al igual que el STRA6, pero se expresa en el tejido hepático32.

Por lo tanto, una comprensión completa del papel de la rodopsina en la función visual requiere una comprensión de los procesos biológicos que culminan en la regeneración del pigmento visual. Esto, a su vez, está íntimamente relacionado con los procesos descritos anteriormente, incluido el metabolismo de los precursores de la provitamina A, el almacenamiento dentro del hígado, la liberación de holo-RBP4 por el hígado y la eventual absorción de holo-RBP4 a través de los receptores de membrana STRA6 y RBPR2. Como se mencionó anteriormente, los modelos animales como los ratones siguen siendo uno de los principales modelos en el estudio de tales procesos. Por lo tanto, nos gustaría presentar un método de extracción de retinoides en tejido murino, así como un método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase normal que puede detectar y cuantificar estos retinoides. Con estos métodos, los retinoides importantes descritos anteriormente, como el ligando de rodopsina 11-cis-retinal o el retinoide de transporte principal, el todo-trans-retinol, pueden analizarse en órganos oculares, hepáticos y sistémicos. Al evaluar el suministro de retinoides en el tejido murino, se puede avanzar aún más en nuestra comprensión de los estados de enfermedad y las patologías relacionadas con el suministro logístico de retinoides.

Además de funcionar como un cromóforo en la función visual a través de la asociación con OPSINA GPCRs, los retinoides también juegan un papel importante en la señalización de las células de mamíferos a través de la señalización del ácido retinoico, facilitada por dos familias de receptores nucleares, los receptores de ácido retinoico (RARA) y los receptores X de retinoides (RXR), que se unen directamente al ADN y regulan la transcripción génica33. Estas dos familias o receptores utilizan retinoides en forma de ácidos retinoicos como ligando. Se ha demostrado que los RAR tienen afinidad tanto por el ácido trans-retinoico como por el ácido 9-cis-retinoico, mientras que los RXRs expresan afinidad solo por el ácido 9-cis-retinoico 34,35. Los ácidos retinoicos en cantidades no controladas son teratogénicos, y la señalización del ácido retinoico debe ser extremadamente controlada36. La producción de ácidos retinoicos para la señalización debe ocurrir localmente y en puntos de tiempo muy específicos para el desarrollo adecuado de los tejidos, como en el desarrollo del cerebro posterior y las extremidades, pero muchos otros ejemplos utilizan la señalización del ácido retinoico37,38. Dentro de las células que participan en la señalización del ácido retinoico, los ácidos retinoicos son sintetizados por dos grupos de enzimas, las alcohol/retinol deshidrogenasas (ADHs/RDHs) que facilitan la oxidación de los retinoles ingeridos por STRA6 o RBPR2 a los retinaldehídos, y las retinaldehído deshidrogenasas (RALDHs) que facilitan la oxidación de los retinaldehídos a ácidos retinoicos39. Si bien no participan en la señalización de GPCR per se, los ácidos retinoicos se presentan como un retinoide crucial que también funciona como ligando para los receptores de señalización.

Aunque no se describen en detalle aquí, nos gustaría reconocer los métodos previamente establecidos para la detección de retinoides mediante HPLC en diversos contextos, como en la investigación alimentaria y el estudio de la rodopsina microbiana. Estos métodos emplean diferentes objetivos y enfoques para la detección de retinoides, incluido el uso de técnicas de fase inversa que requieren fases móviles menos volátiles y peligrosas 40,41,42, la detección de ácidos retinoicos y sus isómeros asociados 40,41, y la purificación y extracción de diferentes fuentes biológicas43. Nuestro método se centra específicamente en la detección de palmitato de retinilo, isómeros de retinaldehído e isómeros de retinol en tejidos de mamíferos. Se deben considerar diferentes protocolos si el caso de uso previsto difiere de esta aplicación específica.

Protocolo

NOTA: Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Minnesota (protocolo # 2312-41637A) y se realizaron de acuerdo con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. Realice todas las extracciones en la oscuridad, bajo una luz roja tenue para iluminar. Tenga en cuenta la luz residual emitida por las pantallas de los instrumentos y los LED de los accesorios.

1. Generación de patrones de retinoides espectrofotométricos y generación de curvas estándar externas

NOTA: Prepare un recipiente de hielo seco para el almacenamiento temporal de retinoides antes del análisis con la HPLC.

  1. Pesar una cantidad arbitraria pero apropiada de retinoides y disolverlos en un disolvente apropiado para su cuantificación mediante espectrofotometría.
    NOTA: El solvente de elección utilizado en este estudio es el etanol, y los valores de absorción molar de los retinoides disueltos en etanol se detallan en la Tabla 1. Se debe utilizar etanol anhidro de grado HPLC para disolver patrones y muestras. El etanol purificado únicamente a través de la destilación forma una mezcla azeotrópica con agua, que contiene aproximadamente un 4% de agua por volumen. El agua es inmiscible con la fase móvil hexanoica y dará lugar a la hidratación de la fase estacionaria de sílice, lo que conducirá a la eventual degradación de la columna.
  2. Utilizando la Ley de Beer-Lambert y la absortividad molar del retinoide pertinente, cuantificar la concentración del patrón generado (Tabla 1).
    Absorbancia = absorbencia molar (ε) × concentración molar × longitud del trayecto
  3. Realice diluciones en serie para crear concentraciones que puedan generar una curva estándar dentro del rango de cuantificación para el tejido deseado.
    NOTA: Tenga en cuenta las limitaciones fundamentales de la Ley de Beer-Lambert, como su falta de validez con altas concentraciones de analito. Para evitar este problema, los patrones de retinoides diluidos deben evitar generar valores de absorbancia superiores a 1. Para nuestras aplicaciones en la cuantificación de retinol y retinaldehído en órganos murinos, encontramos que una curva de calibración con un rango de 1-10 ng era capaz de cubrir las cantidades típicas encontradas. Para la cuantificación del palmitato de retinilo en hígado murino, encontramos que una curva de calibración con un rango de 20-80 μg fue capaz de cubrir las cantidades típicas encontradas.
  4. Al alterar gradualmente el volumen de inyección de la solución madre previamente creada, alterando así gradualmente la cantidad inyectada de retinoide, integre los picos para generar una curva estándar externa adecuada para la cuantificación de retinoides donde la integración de picos es directamente proporcional a la cantidad de retinoide inyectado.

2. Recolección de tejidos y recolección de muestras

NOTA: Prepare un recipiente de hielo seco para el almacenamiento temporal de tejido antes de la homogeneización del tejido y la extracción de retinoides. Las cantidades recomendadas de recolección de tejidos se detallan en la Tabla 2. Para tener en cuenta las variaciones de los retinoides debidas a las variaciones en el contenido sanguíneo de cada tejido, la extracción de tejido debe realizarse en ratones completamente perfundidos, y la extracción de sangre debe completarse en ratones separados.

  1. Sacrificar a los ratones siguiendo las pautas establecidas por el protocolo dictado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (asfixia por CO2 aquí).
  2. Sangre: Inmediatamente después de la eutanasia, decapitar a los ratones con unas tijeras y drenar la sangre del tronco principal de los ratones en un tubo de 1,5 ml.
  3. Ojo: Con un par de fórceps, retire los ojos de la cabeza decapitada.
  4. Cerebro: Con unas tijeras pequeñas, corte la cabeza decapitada y extraiga el cerebro con un par de pinzas.
  5. Riñón, hígado, bazo, corazón y pulmón: Con unas tijeras pequeñas, haga una incisión en el abdomen, corte en la dirección superior a lo largo de la línea media y corte a través del esternón y la caja torácica. Retire el tejido expuesto con un par de pinzas.

3. Homogeneización de tejidos

NOTA: Si se desea el análisis de particiones más pequeñas de órganos, como en órganos más grandes (por ejemplo, tejido hepático o pulmonar), se debe homogeneizar todo el órgano para evitar diferencias en el contenido de retinoides en diferentes partes del tejido. En su lugar, divida el homogeneizado si se desean cantidades más pequeñas de tejido. En la Figura 2 se detalla un esquema del protocolo. Este protocolo modificado fue adaptado de Kane y Napoli44.

  1. Coloque el pañuelo en el tubo triturador de pañuelos, junto con un 50% de solución salina helada (0,9%) y un 50% de metanol. Consulte la Tabla 2 para conocer el volumen utilizado para cada tipo de tejido.
  2. Coloque el mortero en el tubo del molinillo, realice lenta y suavemente cinco rotaciones completas con el mortero para obtener un homogeneizado.
  3. Transfiera las muestras a tubos de 15 ml inmediatamente después de la homogeneización.
  4. Añadir 2 mL de metanol y dejar reposar durante 15 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Si se desea el análisis de derivados de óxido de retinaldehído, agregue 1 mL de clorhidrato de hidroxilamina 0.1 M en HEPES 0.1 M (pH 6.5) (Figura 1).

4. Extracción de retinoides

PRECAUCIÓN: El hexano es altamente inflamable, altamente volátil y altamente tóxico. Se deben usar respiradores, protección para los ojos, guantes de butilo y una campana extractora aprobados por el Instituto Nacional de Seguridad y Salud Ocupacional (NIOSH) cuando se manipula hexano. Al evaporar el hexano de las muestras, se recomienda algún tipo de aparato de circulación de aire mejorado para evitar la acumulación de humo de solvente, por ejemplo, un aparato de succión de snorkel.

  1. Agregue 10 mL de hexano al homogeneizado y mezcle el tubo horizontalmente durante al menos 10 s.
    NOTA: Es fundamental que las fases se mezclen completamente.
  2. Centrifugar la mezcla de homogeneado/hexano durante 3 min a 1.000 × g para facilitar la separación de fases.
  3. Realice la extracción 2 veces para asegurar la extracción total de los retinoides del homogeneizado. Repita los pasos 4.1 y 4.2.
  4. Extraiga la capa de hexano con una pipeta y coloque la capa de hexano en un juego separado de tubos de vidrio de 15 ml para la evaporación al vacío.
    NOTA: Para la evaporación, utilice tubos GLASS de 15 mL para evitar la adhesión de retinoides a las paredes del tubo.
  5. Usando una centrífuga de vacío, evapore completamente el hexano.

5. Análisis de resuspensión y HPLC

NOTA: Dado que el sistema de HPLC utilizado en este manuscrito era un sistema de bomba binaria, la fase móvil de cuatro componentes se premezcló en una botella singular antes de su funcionamiento.

PRECAUCIÓN: Los cuatro solventes orgánicos utilizados en este método son altamente inflamables, altamente volátiles y altamente tóxicos. El 1,4-dioxano es susceptible a la formación explosiva de peróxido tras la exposición al oxígeno. Mantenga cerrados todos los recipientes que contengan 1,4-dioxano cuando no estén en uso. Se deben usar respiradores, protección para los ojos, guantes de butilo y una campana extractora aprobados por el Instituto Nacional de Seguridad y Salud Ocupacional (NIOSH) cuando se manipulan estos solventes. Mientras se ejecutan estos solventes en una HPLC, se recomienda algún tipo de aparato de circulación de aire mejorado para evitar la acumulación de humo de solvente, por ejemplo, un aparato de succión de snorkel.

  1. Vuelva a suspender el tubo seco de 15 ml con 100 μl de hexano; pozo de vórtice para asegurarse de que todos los retinoides se disuelvan.
  2. Pipetee los 100 μL de hexano en un solo inserto de vidrio para el análisis por HPLC.
  3. Configurar la ejecución de HPLC (adaptado de Landers y Olson45): fase móvil: 85,4% de hexano (v/v), 11,2% de acetato de etilo (v/v), 2% de dioxano (v/v), 1,4% de 1-octanol (v/v); columna: dos columnas de 4,6 mm de diámetro interno x 250 nm, 5 μm, conectadas en serie; un termostato multicolumna Temperatura: 25 °C; volumen de inyección: 100 μL; caudal: 1 mL/min; Duración: 40 min. Utilice la detección de absorbancia del espectro UV; mantenga la opción marcada para adquirir el espectro UV de 200 nm a 400 nm.

6. Identificación e integración de picos

  1. Identifique los picos utilizando el tiempo de retención y los espectros UV de cada retinoide de interés, según se observe a partir del análisis de los estándares de retinoides (Figura 3, Tabla 3 y Tabla 4).
  2. Utilizando el sistema de datos cromatográficos del sistema de HPLC elegido, integre los picos identificados. La integración, o área bajo la curva, es directamente proporcional a la cantidad de analito. Consulte la curva estándar externa generada en el paso 1 para cuantificar el analito.
    1. Para el análisis de cromatogramas generados a partir de tejido biológico, utilice la integración manual en lugar de la integración automática que ofrecen los sistemas de datos cromatográficos típicos, ya que a menudo se observan variabilidades en parámetros como el tiempo de retención en dichas muestras.
    2. Asegúrese de que los cromatogramas no presenten irregularidades que puedan indicar problemas durante la ejecución, como líneas de base ruidosas o picos no gaussianos. Estos problemas indican contaminantes en la HPLC o desgaste en las columnas y deben rectificarse para que el análisis sea válido.

Resultados

Aquí, utilizamos el método descrito anteriormente para detectar y cuantificar retinoides en tejido ocular y sistémico murino y generamos cromatogramas representativos. Además, daremos un resumen de los retinoides típicos que se pueden detectar en estos tejidos.

A los 6 meses de edad, los ratones fueron sacrificados mediante asfixia por CO2 . Para mantener el contenido de retinoides oculares, los ratones se adaptaron a la oscuridad durante 2 dí...

Discusión

En este método, la HPLC de fase normal se utiliza para detectar y cuantificar los retinoides relevantes, incluidos los ésteres de retinilo, los retinaldehídos y los retinoles. Dada la importancia del 11-cis-retinal como cromóforo crítico en la activación de la rodopsina GPCR, un método que pueda detectar los metabolitos que están relacionados con la producción de 11-cis-retinal es fundamental para el estudio de la función visual general. La principal ventaja d...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH-NEI (EY030889 y 3R01EY030889-03S1) y en parte por los fondos iniciales de la Universidad de Minnesota para G.P.L. También nos gustaría agradecer al Instituto Nacional del Ojo por proporcionarnos el estándar de retina 11 cis utilizado en este manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma204-661-8
11-cis-retinalNational Eye InstituteN/A
11-cis-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252105
13-cis-retinalToronto Research ChemicalsTRC-R239900
13-cis-retinolToronto Research ChemicalsTRC-R252110
All-trans-RetinalToronto Research ChemicalsTRC-R240000
All-trans-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma205-500-4
Hexane, HPLC GradeFisher Scientific, Spectrum Chemical18-610-808
Methanol (HPLC)Fisher ScienctificA452SK-4
Retinyl PalmitateToronto Research ChemicalsTRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction CollectorAgilentG1364F
1260 Infinity II Binary PumpAgilentG7112B
1260 Infinity II Diode Array DetectorAgilentG7115A
1260 Infinity II Multicolumn ThermostatAgilentG7116A
1260 Infinity II VialsamplerAgilentG7129A
ST40R Refrigerated CentrifugeThermo ScientificTSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge ConcentratorEppendorf22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top VialsAgilent5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mmAgilent5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge TubesMillipore SigmaCLS9950215
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feetAgilent5183-2088

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