Análisis cuantitativo de los metabolitos dietéticos de la vitamina A en tejidos oculares y no oculares murinos mediante cromatografía líquida de alta resolución

Resumen

Aquí, se describe un método de cromatografía líquida de alta resolución en fase normal para detectar y cuantificar los retinoides críticos involucrados en la facilitación de la función visual tanto en el tejido ocular como en el sistémico, en el contexto del suministro sistémico de vitamina A para generar el cromóforo de rodopsina 11-cis-retinal fotosensible esencial.

Resumen

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son una superfamilia de proteínas transmembrana que inician cascadas de señalización a través de la activación de su proteína G al asociarse con su ligando. En toda la visión de los mamíferos, la rodopsina es el GPCR responsable del inicio de la cascada de fototransducción. Dentro de los fotorreceptores, la rodopsina se une a su cromóforo 11-cis-retinal y se activa a través de la isomerización sensible a la luz de 11-cis-retinal a todo trans-retinal, que activa la proteína G de la transducina, lo que da lugar a la cascada de fototransducción.

Si bien la fototransducción se conoce bien, los procesos que están involucrados en el suministro de precursores de vitamina A en la dieta para la generación de 11-cis-retinal en el ojo, así como las enfermedades que resultan en la interrupción de este suministro, aún no se comprenden completamente. Una vez que los precursores de la vitamina A se absorben en el intestino, se almacenan en el hígado como ésteres de retinilo y se liberan en el torrente sanguíneo como todo trans-retinol unido a la proteína de unión al retinol 4 (RBP4). Este RBP4-retinol circulatorio será absorbido por los órganos sistémicos, como el hígado, los pulmones, el riñón y los ojos. Por lo tanto, un método para la cuantificación de los diversos metabolitos de la vitamina A dietética en los ojos y los órganos sistémicos es fundamental para el estudio de la función adecuada de la rodopsina GPCR.

En este método, presentamos un método analítico y de extracción integral para el análisis de vitamina A en tejido murino. A través del análisis de cromatografía líquida de alta resolución en fase normal, todos los isómeros relevantes de retinaldehídos, retinoles y ésteres de retinilo se pueden detectar simultáneamente a través de una sola ejecución, lo que permite el uso eficiente de muestras experimentales y aumenta la confiabilidad interna entre diferentes metabolitos de vitamina A dentro de la misma muestra. Con este método integral, los investigadores podrán evaluar mejor el suministro sistémico de vitamina A en la función de GPCR de rodopsina.

Introducción

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) son una de las superfamilias de proteínas más estudiadas y caracterizadas que se conocen. En su función más conocida, los GPCR sirven como un receptor de superficie celular en la transducción de señales, inicializando respuestas intracelulares al unirse con un ligando específico. Los GPCR se caracterizan por siete dominios helicoidales transmembrana (TM) y seis dominios de bucle total. De los seis bucles, tres están orientados extracelularmente para facilitar la unión del ligando, mientras que los otros tres bucles intracelulares están acoplados a una proteína G heterotrimérica que consta....

Protocolo

NOTA: Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Minnesota (protocolo # 2312-41637A) y se realizaron de acuerdo con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. Realice todas las extracciones en la oscuridad, bajo una luz roja tenue para iluminar. Tenga en cuenta la luz residual emitida por las pantallas de los instrumentos y los LED de los accesorios.

1. Generación de patrones de retinoides espectrofotométricos y generación de curvas estándar externas

Resultados

Aquí, utilizamos el método descrito anteriormente para detectar y cuantificar retinoides en tejido ocular y sistémico murino y generamos cromatogramas representativos. Además, daremos un resumen de los retinoides típicos que se pueden detectar en estos tejidos.

A los 6 meses de edad, los ratones fueron sacrificados mediante asfixia por CO₂ . Para mantener el contenido de retinoides oculares, los ratones se adaptaron a la oscuridad durante 2 dí.......

Discusión

En este método, la HPLC de fase normal se utiliza para detectar y cuantificar los retinoides relevantes, incluidos los ésteres de retinilo, los retinaldehídos y los retinoles. Dada la importancia del 11-cis-retinal como cromóforo crítico en la activación de la rodopsina GPCR, un método que pueda detectar los metabolitos que están relacionados con la producción de 11-cis-retinal es fundamental para el estudio de la función visual general. La principal ventaja d.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	204-661-8
11-cis-retinal	National Eye Institute	N/A
11-cis-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252105
13-cis-retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R239900
13-cis-retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252110
All-trans-Retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R240000
All-trans-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	205-500-4
Hexane, HPLC Grade	Fisher Scientific, Spectrum Chemical	18-610-808
Methanol (HPLC)	Fisher Scienctific	A452SK-4
Retinyl Palmitate	Toronto Research Chemicals	TRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction Collector	Agilent	G1364F
1260 Infinity II Binary Pump	Agilent	G7112B
1260 Infinity II Diode Array Detector	Agilent	G7115A
1260 Infinity II Multicolumn Thermostat	Agilent	G7116A
1260 Infinity II Vialsampler	Agilent	G7129A
ST40R Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top Vials	Agilent	5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mm	Agilent	5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge Tubes	Millipore Sigma	CLS9950215
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feet	Agilent	5183-2088