Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В данной работе описан метод нормальной фазы высокоэффективной жидкостной хроматографии для обнаружения и количественного определения критических ретиноидов, участвующих в облегчении зрительной функции как в глазной, так и в системной ткани, в контексте системного поступления витамина А для получения эссенциального светочувствительного родопсинового хромофора 11-цис-ретиналь.
Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCRs) — это суперсемейство трансмембранных белков, которые инициируют сигнальные каскады путем активации своего G-белка при ассоциации с его лигандом. В зрении всех млекопитающих родопсин является GPCR, ответственным за инициацию каскада фототрансдукции. В фоторецепторах родопсин связывается с его хромофором 11-цис-ретиналь и активируется посредством светочувствительной изомеризации 11-цис-ретиналь в полностью транс-ретиналь, который активирует белок трансдуцина G, что приводит к каскаду фототрансдукции.
В то время как фототрансдукция хорошо изучена, процессы, которые участвуют в поступлении в глаз пищевых предшественников витамина А для 11-цис-ретинального поколения, а также заболевания, приводящие к нарушению этого снабжения, еще не до конца изучены. Как только предшественники витамина А всасываются в кишечнике, они хранятся в печени в виде ретиниловых эфиров и высвобождаются в кровоток в виде транс-ретинола, связанного с ретинол-связывающим белком 4 (RBP4). Этот циркуляторный RBP4-ретинол будет абсорбироваться системными органами, такими как печень, легкие, почки и глаза. Следовательно, метод количественной оценки различных метаболитов витамина А в глазах и системных органах имеет решающее значение для изучения правильной функции родопсина GPCR.
В этом методе мы представляем комплексный метод экстракции и анализа для анализа витамина А в мышиной ткани. С помощью высокопроизводительного жидкостного хроматографического анализа в нормальной фазе все соответствующие изомеры ретинальдегидов, ретинолов и ретиниловых эфиров могут быть обнаружены одновременно в течение одного прогона, что позволяет эффективно использовать экспериментальные образцы и повышает внутреннюю надежность различных метаболитов витамина А в одном образце. С помощью этого комплексного метода исследователи смогут лучше оценить системное снабжение витамином А в функции родопсина GPCR.
Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), являются одним из наиболее изученных и охарактеризованных суперсемейств известных белков. Выполняя свою наиболее известную функцию, GPCR служат рецептором клеточной поверхности при передаче сигнала, инициализируя внутриклеточные реакции при связывании с определенным лигандом. GPCR характеризуются семью трансмембранными (TM) спиральными доменами и шестью полными петлевыми доменами. Из шести петель три петли ориентированы внеклеточно, чтобы облегчить связывание лиганда, в то время как остальные три внутриклеточные петли связаны с гетеротримерным G-белком, состоящим из Gα, Gβ и Gγ субъединиц
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Миннесоты (протокол # 2312-41637A) и проводились в соответствии с Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Выполняйте все вытяжки в темное время суток, под тусклым красным светом для освещения. Помните об остаточном свете, излучаемом дисплеями приборов и светодиодами аксессуаров.
1. Генерация спектрофотометрических стандартных ретиноидов и генерация внешних стандартных кривых
Здесь мы использовали описанный выше метод для обнаружения и количественного определения ретиноидов в глазной и системной ткани мышей и создали репрезентативные хроматограммы. Мы дополнительно дадим краткое описание типичных ретиноидов, которые могут быть обнаруж.......
В этом методе ВЭЖХ нормальной фазы используется для обнаружения и количественного определения соответствующих ретиноидов, включая ретиниловые эфиры, ретинальдегиды и ретинолы. Учитывая важность 11-цис-ретинала как важнейшего хромофора в активации родопсина GPCR,.......
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта работа была поддержана грантами NIH-NEI (EY030889 и 3R01EY030889-03S1) и частично стартовыми фондами Университета Миннесоты для G.P.L. Мы также хотели бы поблагодарить Национальный институт глаза за предоставление нам стандарта 11-цис-сетчатки, используемого в этой рукописи.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent | |||
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5% | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma | 203-917-6 | |
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5% | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma | 204-661-8 | |
11-cis-retinal | National Eye Institute | N/A | |
11-cis-Retinol | Toronto Research Chemicals | TRC-R252105 | |
13-cis-retinal | Toronto Research Chemicals | TRC-R239900 | |
13-cis-retinol | Toronto Research Chemicals | TRC-R252110 | |
All-trans-Retinal | Toronto Research Chemicals | TRC-R240000 | |
All-trans-Retinol | Toronto Research Chemicals | TRC-R252002 | |
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma | 205-500-4 | |
Hexane, HPLC Grade | Fisher Scientific, Spectrum Chemical | 18-610-808 | |
Methanol (HPLC) | Fisher Scienctific | A452SK-4 | |
Retinyl Palmitate | Toronto Research Chemicals | TRC-R275450 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
Instruments | |||
1260 Infinity II Analytical Fraction Collector | Agilent | G1364F | |
1260 Infinity II Binary Pump | Agilent | G7112B | |
1260 Infinity II Diode Array Detector | Agilent | G7115A | |
1260 Infinity II Multicolumn Thermostat | Agilent | G7116A | |
1260 Infinity II Vialsampler | Agilent | G7129A | |
ST40R Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TSST40R | |
Vacufuge Plus Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820168 | |
Consumables | |||
2 mL Amber Screw Top Vials | Agilent | 5188-6535 | |
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mm | Agilent | 5183-4498 | |
Disposable Glass Conical Centrifuge Tubes | Millipore Sigma | CLS9950215 | |
Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feet | Agilent | 5183-2088 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены