Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе описан метод нормальной фазы высокоэффективной жидкостной хроматографии для обнаружения и количественного определения критических ретиноидов, участвующих в облегчении зрительной функции как в глазной, так и в системной ткани, в контексте системного поступления витамина А для получения эссенциального светочувствительного родопсинового хромофора 11-цис-ретиналь.

Аннотация

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCRs) — это суперсемейство трансмембранных белков, которые инициируют сигнальные каскады путем активации своего G-белка при ассоциации с его лигандом. В зрении всех млекопитающих родопсин является GPCR, ответственным за инициацию каскада фототрансдукции. В фоторецепторах родопсин связывается с его хромофором 11-цис-ретиналь и активируется посредством светочувствительной изомеризации 11-цис-ретиналь в полностью транс-ретиналь, который активирует белок трансдуцина G, что приводит к каскаду фототрансдукции.

В то время как фототрансдукция хорошо изучена, процессы, которые участвуют в поступлении в глаз пищевых предшественников витамина А для 11-цис-ретинального поколения, а также заболевания, приводящие к нарушению этого снабжения, еще не до конца изучены. Как только предшественники витамина А всасываются в кишечнике, они хранятся в печени в виде ретиниловых эфиров и высвобождаются в кровоток в виде транс-ретинола, связанного с ретинол-связывающим белком 4 (RBP4). Этот циркуляторный RBP4-ретинол будет абсорбироваться системными органами, такими как печень, легкие, почки и глаза. Следовательно, метод количественной оценки различных метаболитов витамина А в глазах и системных органах имеет решающее значение для изучения правильной функции родопсина GPCR.

В этом методе мы представляем комплексный метод экстракции и анализа для анализа витамина А в мышиной ткани. С помощью высокопроизводительного жидкостного хроматографического анализа в нормальной фазе все соответствующие изомеры ретинальдегидов, ретинолов и ретиниловых эфиров могут быть обнаружены одновременно в течение одного прогона, что позволяет эффективно использовать экспериментальные образцы и повышает внутреннюю надежность различных метаболитов витамина А в одном образце. С помощью этого комплексного метода исследователи смогут лучше оценить системное снабжение витамином А в функции родопсина GPCR.

Введение

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), являются одним из наиболее изученных и охарактеризованных суперсемейств известных белков. Выполняя свою наиболее известную функцию, GPCR служат рецептором клеточной поверхности при передаче сигнала, инициализируя внутриклеточные реакции при связывании с определенным лигандом. GPCR характеризуются семью трансмембранными (TM) спиральными доменами и шестью полными петлевыми доменами. Из шести петель три петли ориентированы внеклеточно, чтобы облегчить связывание лиганда, в то время как остальные три внутриклеточные петли связаны с гетеротримерным G-белком, состоящим из Gα, Gβ и Gγ субъединиц

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Миннесоты (протокол # 2312-41637A) и проводились в соответствии с Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Выполняйте все вытяжки в темное время суток, под тусклым красным светом для освещения. Помните об остаточном свете, излучаемом дисплеями приборов и светодиодами аксессуаров.

1. Генерация спектрофотометрических стандартных ретиноидов и генерация внешних стандартных кривых

Результаты

Здесь мы использовали описанный выше метод для обнаружения и количественного определения ретиноидов в глазной и системной ткани мышей и создали репрезентативные хроматограммы. Мы дополнительно дадим краткое описание типичных ретиноидов, которые могут быть обнаруж.......

Обсуждение

В этом методе ВЭЖХ нормальной фазы используется для обнаружения и количественного определения соответствующих ретиноидов, включая ретиниловые эфиры, ретинальдегиды и ретинолы. Учитывая важность 11-цис-ретинала как важнейшего хромофора в активации родопсина GPCR,.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH-NEI (EY030889 и 3R01EY030889-03S1) и частично стартовыми фондами Университета Миннесоты для G.P.L. Мы также хотели бы поблагодарить Национальный институт глаза за предоставление нам стандарта 11-цис-сетчатки, используемого в этой рукописи.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma204-661-8
11-cis-retinalNational Eye InstituteN/A
11-cis-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252105
13-cis-retinalToronto Research ChemicalsTRC-R239900
13-cis-retinolToronto Research ChemicalsTRC-R252110
All-trans-RetinalToronto Research ChemicalsTRC-R240000
All-trans-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma205-500-4
Hexane, HPLC GradeFisher Scientific, Spectrum Chemical18-610-808
Methanol (HPLC)Fisher ScienctificA452SK-4
Retinyl PalmitateToronto Research ChemicalsTRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction CollectorAgilentG1364F
1260 Infinity II Binary PumpAgilentG7112B
1260 Infinity II Diode Array DetectorAgilentG7115A
1260 Infinity II Multicolumn ThermostatAgilentG7116A
1260 Infinity II VialsamplerAgilentG7129A
ST40R Refrigerated CentrifugeThermo ScientificTSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge ConcentratorEppendorf22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top VialsAgilent5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mmAgilent5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge TubesMillipore SigmaCLS9950215
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feetAgilent5183-2088

Ссылки

  1. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
  2. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G. F., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors.....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

GPCR4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены