Количественный анализ пищевых метаболитов витамина А в глазных и неглазных тканях мышей с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии

Резюме

В данной работе описан метод нормальной фазы высокоэффективной жидкостной хроматографии для обнаружения и количественного определения критических ретиноидов, участвующих в облегчении зрительной функции как в глазной, так и в системной ткани, в контексте системного поступления витамина А для получения эссенциального светочувствительного родопсинового хромофора 11-цис-ретиналь.

Аннотация

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCRs) — это суперсемейство трансмембранных белков, которые инициируют сигнальные каскады путем активации своего G-белка при ассоциации с его лигандом. В зрении всех млекопитающих родопсин является GPCR, ответственным за инициацию каскада фототрансдукции. В фоторецепторах родопсин связывается с его хромофором 11-цис-ретиналь и активируется посредством светочувствительной изомеризации 11-цис-ретиналь в полностью транс-ретиналь, который активирует белок трансдуцина G, что приводит к каскаду фототрансдукции.

В то время как фототрансдукция хорошо изучена, процессы, которые участвуют в поступлении в глаз пищевых предшественников витамина А для 11-цис-ретинального поколения, а также заболевания, приводящие к нарушению этого снабжения, еще не до конца изучены. Как только предшественники витамина А всасываются в кишечнике, они хранятся в печени в виде ретиниловых эфиров и высвобождаются в кровоток в виде транс-ретинола, связанного с ретинол-связывающим белком 4 (RBP4). Этот циркуляторный RBP4-ретинол будет абсорбироваться системными органами, такими как печень, легкие, почки и глаза. Следовательно, метод количественной оценки различных метаболитов витамина А в глазах и системных органах имеет решающее значение для изучения правильной функции родопсина GPCR.

В этом методе мы представляем комплексный метод экстракции и анализа для анализа витамина А в мышиной ткани. С помощью высокопроизводительного жидкостного хроматографического анализа в нормальной фазе все соответствующие изомеры ретинальдегидов, ретинолов и ретиниловых эфиров могут быть обнаружены одновременно в течение одного прогона, что позволяет эффективно использовать экспериментальные образцы и повышает внутреннюю надежность различных метаболитов витамина А в одном образце. С помощью этого комплексного метода исследователи смогут лучше оценить системное снабжение витамином А в функции родопсина GPCR.

Введение

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), являются одним из наиболее изученных и охарактеризованных суперсемейств известных белков. Выполняя свою наиболее известную функцию, GPCR служат рецептором клеточной поверхности при передаче сигнала, инициализируя внутриклеточные реакции при связывании с определенным лигандом. GPCR характеризуются семью трансмембранными (TM) спиральными доменами и шестью полными петлевыми доменами. Из шести петель три петли ориентированы внеклеточно, чтобы облегчить связывание лиганда, в то время как остальные три внутриклеточные петли связаны с гетеротримерным G-белком, состоящим из Gα, Gβ и Gγ субъединиц

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Миннесоты (протокол # 2312-41637A) и проводились в соответствии с Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Выполняйте все вытяжки в темное время суток, под тусклым красным светом для освещения. Помните об остаточном свете, излучаемом дисплеями приборов и светодиодами аксессуаров.

1. Генерация спектрофотометрических стандартных ретиноидов и генерация внешних стандартных кривых

Результаты

Здесь мы использовали описанный выше метод для обнаружения и количественного определения ретиноидов в глазной и системной ткани мышей и создали репрезентативные хроматограммы. Мы дополнительно дадим краткое описание типичных ретиноидов, которые могут быть обнаруж.......

Обсуждение

В этом методе ВЭЖХ нормальной фазы используется для обнаружения и количественного определения соответствующих ретиноидов, включая ретиниловые эфиры, ретинальдегиды и ретинолы. Учитывая важность 11-цис-ретинала как важнейшего хромофора в активации родопсина GPCR,.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	204-661-8
11-cis-retinal	National Eye Institute	N/A
11-cis-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252105
13-cis-retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R239900
13-cis-retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252110
All-trans-Retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R240000
All-trans-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	205-500-4
Hexane, HPLC Grade	Fisher Scientific, Spectrum Chemical	18-610-808
Methanol (HPLC)	Fisher Scienctific	A452SK-4
Retinyl Palmitate	Toronto Research Chemicals	TRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction Collector	Agilent	G1364F
1260 Infinity II Binary Pump	Agilent	G7112B
1260 Infinity II Diode Array Detector	Agilent	G7115A
1260 Infinity II Multicolumn Thermostat	Agilent	G7116A
1260 Infinity II Vialsampler	Agilent	G7129A
ST40R Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top Vials	Agilent	5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mm	Agilent	5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge Tubes	Millipore Sigma	CLS9950215
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feet	Agilent	5183-2088