Analyse quantitative des métabolites alimentaires de la vitamine A dans les tissus oculaires et non oculaires murins à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance

Résumé

Ici, une méthode de chromatographie liquide à haute performance en phase normale est décrite pour détecter et quantifier les rétinoïdes critiques impliqués dans la facilitation de la fonction visuelle dans les tissus oculaires et systémiques, dans le contexte de l’apport systémique en vitamine A pour générer le chromophore 11-cis-rétinal photosensible essentiel de la rhodopsine.

Résumé

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont une superfamille de protéines transmembranaires qui initient des cascades de signalisation par l’activation de sa protéine G lors de l’association avec son ligand. Dans toutes les visions de mammifères, la rhodopsine est le RCPG responsable de l’initiation de la cascade de phototransduction. Dans les photorécepteurs, la rhodopsine est liée à son chromophore 11-cis-rétinal et est activée par l’isomérisation sensible à la lumière du 11-cis-rétinal en tout-trans-rétinien, ce qui active la protéine transducine G, entraînant la cascade de phototransduction.

Bien que la phototransduction soit bien comprise, les processus impliqués dans l’approvisionnement en précurseurs alimentaires de la vitamine A pour la génération de 11-cis-rétinienne dans l’œil, ainsi que les maladies entraînant une perturbation de cet approvisionnement, ne sont pas encore entièrement compris. Une fois que les précurseurs de la vitamine A sont absorbés dans l’intestin, ils sont stockés dans le foie sous forme d’esters de rétinyle et libérés dans la circulation sanguine sous forme de rétinol tout trans lié à la protéine de liaison au rétinol 4 (RBP4). Ce RBP4-rétinol circulatoire sera absorbé par les organes systémiques, tels que le foie, les poumons, les reins et les yeux. Par conséquent, une méthode de quantification des différents métabolites de la vitamine A alimentaire dans l’œil et les organes systémiques est essentielle à l’étude de la fonction correcte de la rhodopsine GPCR.

Dans cette méthode, nous présentons une méthode complète d’extraction et d’analyse pour l’analyse de la vitamine A dans le tissu murin. Grâce à l’analyse par chromatographie liquide haute performance en phase normale, tous les isomères pertinents des rétinaldéhydes, des rétinols et des esters de rétinyle peuvent être détectés simultanément en une seule analyse, ce qui permet une utilisation efficace des échantillons expérimentaux et augmente la fiabilité interne des différents métabolites de la vitamine A au sein d’un même échantillon. Grâce à cette méthode complète, les chercheurs seront en mesure de mieux évaluer l’apport systémique en vitamine A dans la fonction des RCPG de la rhodopsine.

Introduction

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont l’une des superfamilles de protéines les plus étudiées et les plus caractérisées connues. Dans sa fonction la plus connue, les RCPG servent de récepteur de surface cellulaire dans la transduction du signal, initialisant les réponses intracellulaires lors de la liaison avec un ligand spécifique. Les RCPG sont caractérisés par sept domaines hélicoïdaux transmembranaires (TM) et six domaines de boucle totale. Sur les six boucles, trois boucles sont orientées extracellulairement pour faciliter la liaison des ligands, tandis que les trois autres boucles intracellulaires sont couplées à une....

Protocole

REMARQUE : Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Minnesota (protocole # 2312-41637A) et réalisées conformément à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Effectuez toutes les extractions dans l’obscurité, sous une faible lumière rouge pour l’éclairage. Soyez conscient de la lumière résiduelle émise par les écrans d’instruments et les LED accessoires.

1. Génération d’étalons de rétinoïdes spectrophotométriques et génération de courbes d’étalons externe....

Discussion

Dans cette méthode, la HPLC en phase normale est utilisée pour détecter et quantifier les rétinoïdes pertinents, y compris les esters de rétinyle, les rétinaldéhydes et les rétinols. Étant donné l’importance du 11-cis-rétinal en tant que chromophore critique dans l’activation du RCPG de la rhodopsine, une méthode capable de détecter les métabolites liés à la production de 11-cis-rétinal est essentielle à l’étude de la fonction visuelle globale........

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	204-661-8
11-cis-retinal	National Eye Institute	N/A
11-cis-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252105
13-cis-retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R239900
13-cis-retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252110
All-trans-Retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R240000
All-trans-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	205-500-4
Hexane, HPLC Grade	Fisher Scientific, Spectrum Chemical	18-610-808
Methanol (HPLC)	Fisher Scienctific	A452SK-4
Retinyl Palmitate	Toronto Research Chemicals	TRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction Collector	Agilent	G1364F
1260 Infinity II Binary Pump	Agilent	G7112B
1260 Infinity II Diode Array Detector	Agilent	G7115A
1260 Infinity II Multicolumn Thermostat	Agilent	G7116A
1260 Infinity II Vialsampler	Agilent	G7129A
ST40R Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top Vials	Agilent	5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mm	Agilent	5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge Tubes	Millipore Sigma	CLS9950215
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feet	Agilent	5183-2088