使用高效液相色谱定量分析小鼠眼部和非眼部组织中的膳食维生素 A 代谢物

Summary

在这里，描述了一种正相、高效液相色谱方法，用于检测和量化参与促进眼部和全身组织中视觉功能的关键类视黄醇，在全身维生素 A 供应的背景下产生必需的光敏视紫红质发色团 11-顺式-视黄醛。

Abstract

G 蛋白偶联受体 （GPCR） 是跨膜蛋白的一个超家族，在与其配体结合时通过激活其 G 蛋白来启动信号级联反应。在所有哺乳动物的视觉中，视紫红质是负责启动光转导级联反应的 GPCR。在光感受器中，视紫红质与其发色团 11-顺式-视黄醛结合，并通过 11-顺式-视黄醛的光敏异构化为全反式视黄醛而被激活，从而激活转导素 G 蛋白，导致光转导级联反应。

虽然光转导已广为人知，但为眼睛中 11-顺式-视黄醛的生成提供膳食维生素 A 前体所涉及的过程，以及导致这种供应中断的疾病，尚不完全清楚。一旦维生素 A 前体被肠道吸收，它们就会以视黄酯的形式储存在肝脏中，并以与视黄醇结合蛋白 4 （RBP4） 结合的全反式视黄醇的形式释放到血液中。这种循环 RBP4-视黄醇将被全身器官吸收，例如肝脏、肺、肾脏和眼睛。因此，定量眼睛和全身器官中膳食维生素 A 的各种代谢物的方法对于研究正确的视紫红质 GPCR 功能至关重要。

在该方法中，我们提出了一种用于小鼠组织中维生素 A 分析的综合提取和分析方法。通过正相高效液相色谱分析，可以通过单次运行同时检测视黄醛、视黄醇和视黄酯的所有相关异构体，从而可以高效利用实验样品并提高同一样品中不同维生素 A 代谢物的内部可靠性。通过这种全面的方法，研究人员将能够更好地评估视紫红质 GPCR 功能中的全身维生素 A 供应。

Introduction

G 蛋白偶联受体 （GPCR） 是已知研究和特征最多的蛋白质超家族之一。在其最著名的功能中，GPCR 在信号转导中充当细胞表面受体，在与特定配体结合时初始化细胞内反应。GPCR 的特征是 7 个跨膜 （TM） 螺旋结构域和 6 个总环结构域。在这 6 个环中，3 个环向细胞外方向以促进配体结合，而其他 3 个细胞内环与由 Gα、Gβ 和 Gγ 亚基组成的异源三聚体 G 蛋白偶联 ^1,2。

GPCR 分为几类，包括 A 类视紫红质样、B 类促胰液素受体家族、C 类谷氨酸、D 类真菌交配信息素受体、E 类环状 AMP 受体和 F 类卷曲/平滑 ^3,4。顾名思义，GPCR 视紫红质样 A 类亚类包括视紫红质，这是负责光转导和视觉功能的关键 GPCR。视紫红质包含在 GPCR 经典模型中发现的所有相关关键特征和结构元件，包括前面提到的七个 TM 螺旋结构域、六个细胞外和细胞内环，以及与异源三聚体 G 蛋白的关联，在光感受器中也称为转导蛋白 （G_t） 1,5,6,7。

Protocol

注意：所有动物实验均已获得明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准（协议 # 2312-41637A），并按照 ARVO 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行。在黑暗中，在昏暗的红光下进行所有提取。注意仪器显示器和附件 LED 发出的残余光。

1. 分光光度法类视黄醇标准生成和外部标准曲线生成

注：在使用 HPLC 分析之前，准备一个干冰容器用于临时储存类维生素 A。

1. 称取任意但适量的类视黄醇，并将其溶解在适当的溶剂中，以便通过分光光度法进行定量。
   注：本研究中使用的溶剂是乙醇，溶于乙醇的类维生素 A 的摩尔吸收值详见 表 1。必须使用无水 HPLC 级乙醇来溶解标准品和样品。仅通过蒸馏纯化的乙醇与水形成共沸混合物，体积含水量约为 4%。水与己酸流动相不混溶，会导致硅胶固定相水合，最终导致色谱柱降解。
2. 利用比尔-朗伯定律和相关类视黄醇的摩尔吸收率，定量生成的标准品的浓度（表 1）。
   吸光度 = 摩尔吸收率 （ε） × 摩尔浓度 × 光程长度
3. 进行连续稀释，以产生可在所需组织定量范围内生成标准曲线的浓度。
   注意：请注意比尔-朗伯定律的基本....

Discussion

在该方法中，正相 HPLC 用于检测和定量相关的类视黄醇，包括视黄酯、视黄醛和视黄醇。鉴于 11-顺式-视黄醛作为视紫红质 GPCR 激活的关键发色团的重要性，一种可以检测与 11-顺式-视黄醛产生相关的代谢物的方法对于整体视觉功能的研究至关重要。该方法的主要优点是，可以通过一次运行同时检测和定量视黄醛和视黄醇的所有相关异构体。鉴于活的实验组?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	204-661-8
11-cis-retinal	National Eye Institute	N/A
11-cis-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252105
13-cis-retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R239900
13-cis-retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252110
All-trans-Retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R240000
All-trans-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	205-500-4
Hexane, HPLC Grade	Fisher Scientific, Spectrum Chemical	18-610-808
Methanol (HPLC)	Fisher Scienctific	A452SK-4
Retinyl Palmitate	Toronto Research Chemicals	TRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction Collector	Agilent	G1364F
1260 Infinity II Binary Pump	Agilent	G7112B
1260 Infinity II Diode Array Detector	Agilent	G7115A
1260 Infinity II Multicolumn Thermostat	Agilent	G7116A
1260 Infinity II Vialsampler	Agilent	G7129A
ST40R Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top Vials	Agilent	5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mm	Agilent	5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge Tubes	Millipore Sigma	CLS9950215
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feet	Agilent	5183-2088