JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم ربط تكوين الصفائح الدموية المخثرة بزيادة خطر تجلط الدم. يتم تقديم بروتوكول دقيق لعزل الصفائح الدموية المغسولة عن دم الإنسان ، يهدف إلى تحديد التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة ، وهي سمات مميزة للصفائح الدموية المخثرة.

Abstract

تعمل الصفائح الدموية المنشطة على تعزيز التخثر بشكل أساسي عن طريق تعريض فوسفوليبيد فوسفاتيديل سيرين (PS) على أسطح الغشاء الخارجي وإطلاق الحويصلات الدقيقة التي تعبر عن PS والتي تحتفظ ببنية الغشاء الأصلية والمكونات السيتوبلازمية لخلاياها الأصلية. يسهل الوصول إلى الفوسفاتيديل سيرين ربط عوامل التخثر الرئيسية ، مما يؤدي إلى تضخيم الكفاءة التحفيزية لإنزيمات التخثر بشكل كبير ، بينما يعمل إطلاق الحويصلات الدقيقة كوسيط محوري للإشارات بين الخلايا. تلعب الصفائح الدموية المخثرة دورا مهما في تثبيت الجلطة أثناء الإرقاء ، وترتبط نسبتها المتزايدة في مجرى الدم بزيادة خطر تجلط الدم. لقد ثبت أيضا أن الحويصلات الدقيقة للصفائح الدموية غنية بعوامل النمو التي تعزز التئام الجروح والتعديل الالتهابي. يشكل تحليل التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة باستخدام قياس التدفق الخلوي تحديات كبيرة بسبب صغر حجمها والعدد المحدود من الأحداث الإيجابية لعلامات الاهتمام. على الرغم من التقدم الكبير في العقد الماضي ، لا تزال طرق تقييم التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة قيد التقدم. لسوء الحظ ، لا يوجد بروتوكول واحد قابل للتطبيق عالميا ، ويجب تقييم عدة عوامل لتحديد المنهجية الأنسب لكل تطبيق محدد. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لعزل الصفائح الدموية المغسولة عن دم الإنسان ، متبوعا بتنشيط الكولاجين و / أو الثرومبين ، لقياس التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة التي تميز الصفائح الدموية المخثرة. تم تصميم هذا البروتوكول لتسهيل التحضير الأولي للبلازما الغنية بالصفائح الدموية وعزل الصفائح الدموية المغسولة. أخيرا ، يتم تحديد التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، مما يتيح تحديد الصفائح الدموية المخثرة.

Introduction

يعد تكوين مادة تخثر الصفائح الدموية أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على الإرقاء1،2،3. تتضمن هذه العملية التعبير عن الدهون الفوسفورية الناجمة عن ناهض على غشاء الصفائح الدموية ، وهو أمر ضروري لتجميع مجمعات التيناز والبروثرومبيناز1،3،4. بعد تنشيط الصفائح الدموية ، يتم أيضا إطلاق الحويصلات الدقيقة للصفائح الدموية بشكل مستمر 5,6. الحويصلات الدقيقة (قطرها من 50 نانومتر إلى أكثر من 1 ميكرومتر) تغلف كل من بنية الغشاء والمكونات السيتوبلازمية للخلايا الأصلية7،8. تعتبر الحويصلات الدقيقة وسطاء مهمين للإشارات بين الخلايا9،10 وكذلك مستودعات لعوامل النمو التي تعزز التئام الجروح والتعديل الالتهابي11،12. كما تم اقتراح أن تكون الحويصلات الدقيقة أكثر تخثر من 50 إلى 100 مرة من الصفائح الدموية المنشطة13. والجدير بالذكر أن الأدلة الحديثة تشير إلى أن الصفائح الدموية المخزنة يتم تنشيطها ، مما يؤدي إلى إنتاج الحويصلات الدقيقة - وهذا له تداعيات محتملة على ممارسة العلاج بنقل الصفائح الدموية. مدة التخزين الممتدة للحويصلات الدقيقة ونشاط التخثر المتزايد يجعلها بديلا واعدا للصفائح الدموية في تطبيقات نقلالدم 14.

تم إجراء ابتكارات منهجية لتقييم تكوين مواد تخثر الصفائح الدموية بشكل مباشر وغير مباشر في كل من الظروف الصحية والمرضية4،14،15. قدمت تقييمات التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة باستخدام الصفائح الدموية المنقاة بيانات جديدة حول كيفية اضطراب استجابات تكثر الصفائح الدموية في الأمراض البشرية المتنوعة1،4. يفتح هذا المجال البحثي المتنامي أيضا آفاقا للتدخلات العلاجية1،4. ومع ذلك ، فإن عزل وتحليل الصفائح الدموية المنقاة من الدم يستغرق وقتا طويلا ، ويتطلب معدات مختبرية متخصصة ، وبالتالي ، فهي غير قابلة للتكيف حاليا مع التشخيص السريري الروتيني16 ، 17. يعد تحليل التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة أمرا صعبا أيضا نظرا لصغر حجمها وعدد الأحداث الإيجابية لعلامات الاهتمام18،19.

كان قياس التدفق الخلوي ، الذي يستفيد من ربط الفلورسنت Annexin-V ، حجر الزاوية في تقييم تعبير PS على الصفائح الدموية والحويصلات الدقيقة منذ إنشائها قبل عقدينمن الزمن 20. لقد اكتسب قبولا واسع النطاق في فحص الصفائح الدموية والحويصلات الدقيقة المخثرة21،22. لذلك ، يتم تقديم بروتوكول محسن هنا يمكن استخدامه لعزل الصفائح الدموية المنقاة من عينات الدم باستخدام التقنية التي طورتها مجموعة Cazenave23 ، والتوصيف اللاحق للتعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد تنشيط الصفائحالدموية 24. سيسهل هذا البروتوكول مزيدا من الدراسة والتوصيف المتعمق للصفائح الدموية المخثرة في المجموعات السريرية ذات الأهمية.

Protocol

يتبع البروتوكول الإرشادات وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في مستشفى جامعة بوردو. تم الحصول على عينات الدم من متطوعين أصحاء قدموا موافقة مستنيرة ، وتمت معالجة هذه العينات وفقا للبروتوكولات المؤسسية. تم استبعاد المتبرعين الذين تناولوا أي مواد يمكن أن تؤثر على وظيفة الصفائح الدموية إذا تم تناول هذه المواد في غضون 10 أيام قبل التجارب. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المتطوعين الأصحاء لجمع دمائهم ونشر بياناتهم. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. جمع الدم وإعداد الصفائح الدموية المغسولة

  1. جمع الدم الوريدي المحيطي في أنابيب تجميع تحتوي على مضاد التخثر النشط ثلاثي سترات الصوديوم مع حامض الستريك وسكر العنب (ACD) بعد التخلص من أول 3 مل.
  2. بعد التجميع ، اقلب الأنبوب برفق لخلط الدم مع ACD واترك الخليط يرتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل الطرد المركزي.
  3. عد الصفائح الدموية باستخدام عداد خلوي آلي قبل الطرد المركزي لتحديد السرعة الصحيحة للطرد المركزي (الجدول 1). قم بإعداد البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) دون استخدام الفرامل لتحسين استعادة الصفائح الدموية.
    ملاحظة: ستنتج هذه الخطوة ثلاث طبقات في العينة: الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما والصفائح الدموية وجزء صغير من خلايا الدم البيضاء. طبقة وسطى غنية بخلايا الدم البيضاء ؛ وطبقة سفلية تتكون من خلايا الدم الحمراء. انقل البلازما الغنية بالصفائح الدموية بعناية من الطبقة العليا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل لتجنب التلوث بخلايا الدم الحمراء والبيضاء.
  4. أضف إلى PRP 1 مل من ACD-A (انظر الجدول 2) و 6.25 ميكرولتر من الأبيراز لكل 9 مل.
    ملاحظة: يعمل الأبيراز ، بتركيز 0.02 وحدة / مل ، على تحلل آثار ATP أو ADP التي تفرزها الصفائح الدموية ، وبالتالي منع إزالة حساسية مستقبلات الصفائح الدموية ADP والحفاظ على شكل الصفائحالدموية 25. يمكن أيضا تضمين مثبط البروستاسيكلين PGI2 (0.5 ميكرومتر) مع الأبيراز لمنع تنشيط الصفائح الدموية.
  5. تحضير حبيبات الصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي عند RT عند 1100 × جم لمدة 10 دقائق. استنشاق المادة الطافية التي تحتوي على البلازما الفقيرة للصفائح الدموية (PPP) باستخدام طريقة لطيفة ، مثل ماصة باستور ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول الغسيل (انظر الجدول 3 والجدول 4). قم بتجانس برفق باستخدام ماصة ، ثم أضف 3-4 مل إضافية من محلول الغسيل.
    ملاحظة: يتم تقليل مستوى الكالسيوم لمنع التخثر بعوامل الجلطة الموجودة في البلازما. في هذه المرحلة ، تمت إزالة البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية تماما ، مما يمنع تكوين الجلطة وتنشيط الصفائح الدموية عن طريق إنتاج الثرومبين.
  6. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند RT عند 1100 × جم لمدة 10 دقائق. شفط المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول الغسيل. انقل 150 ميكرولتر من تعليق الصفائح الدموية إلى أنبوب سعة 1.5 مل لعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي. ثم أعد تعليق الحبيبات ب 3-4 مل من محلول الغسيل.
  7. قم بإجراء الطرد المركزي النهائي عند 1100 × جم لمدة 10 دقائق (عند RT). استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الصفائح الدموية في حجم المخزن المؤقت للتفاعل (انظر الجدول 5 والجدول 6) لتحقيق تركيز نهائي قدره 5 × 1011 صفيحة / لتر.
  8. اترك الصفائح الدموية المغسولة ترتاح لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التجارب للسماح للمثبطات المتبقية بالتآكل ولكي تتأقلم الصفائح الدموية مع المخزن المؤقت.

2. إعداد الفحص

  1. تحضير جميع ناهضات وفلوروكرومات في المخزن المؤقت للتفاعل. أضف 5 ميكرولتر من الثرومبين إلى 45 ميكرولتر من المخزن المؤقت (التخفيف 1:10) و 5 ميكرولتر من الأيونوفور إلى 495 ميكرولتر من المخزن المؤقت (التخفيف 1: 500).
    1. بالنسبة للمقايسات الداخلية ، قم بقياس الصفائح الدموية غير المنشطة مقابل تلك المعالجة بناهضات مفردة ومزدوجة. أضف ، في كميات مختلفة ، 100 ميكرولتر من الصفائح الدموية المغسولة عند 50 × 109 الصفائح الدموية / لتر إلى: (1) 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل ، (2) 3 ميكرولتر من الكولاجين غير المخفف (التركيز النهائي 30 ميكروغرام / مل) ، (3) 10 ميكرولتر من الثرومبين المخفف مسبقا (0.5 وحدة دولية / مل) ، (4) 3 ميكرولتر من الكولاجين غير المخفف + 10 ميكرولتر من الثرومبين المخفف مسبقا ، و (v) 10 ميكرولتر من الأيونوفور المخفف مسبقا (التركيز النهائي 2 ميكرومتر) ، وهو معروف بزيادة مستويات الكالسيوم داخل الخلايا بشكل مباشر كما لوحظسابقا 26.
      ملاحظة: العلاج بأيونوفور الكالسيوم ، مثل A23187 أو الأيونوميسين ، أمر بالغ الأهمية لأنه يحفز تدافع غشاء الفوسفوليبيد على نطاق واسع وتحسين إخراج PS.
    2. رج كل قطعة يدوية برفق واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: قد تسمح الحضانة الناهضة الأطول (30 دقيقة) بتمييز أفضل بين مجموعات الصفائح الدموية أثناء عملية تحليل قياس التدفق الخلوي.
  2. أضف 5 ميكرولتر من Annexin-V FITC غير المخفف إلى كل أنبوب دقيق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام.
    ملاحظة: يمكن أيضا تضمين جسم مضاد أحادي النسيلة ضد أحد المستقبلات الخاصة بالصفائح الدموية ، GPIX (CD42b) أو αIIb integrin (CD41 ، GPIIb) ، لتحديد خلايا الصفائح الدموية بشكل أفضل.
  3. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل لإيقاف العملية والمضي قدما في تحليل العينة باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

3. توصيف الصفائح الدموية والحجريصلات الدقيقة المخثرة عن طريق قياس التدفق الخلوي (FC)

ملاحظة: لتحليل وظيفة الصفائح الدموية الموثوق به ، استخدم أداة قياس التدفق الخلوي (FC) التي تم تكوينها وفقا للمعاييرالمعمول بها 27. يجب أن يكون الجهاز قادرا على اكتشاف التشتت الأمامي (FSC) وإشارة مضان واحدة على الأقل. اضبط كاشفات التشتت الضوئي والمضان على الكسب اللوغاريتمي. قم بتخفيف العينات بشكل مناسب ل FC لضمان حساب الصفائح الدموية الفردية فقط بسرعة الحصول على البيانات المنخفضة.

  1. اضبط مقياس التدفق الخلوي على معدل تدفق "بطيء" مع عتبة لا تقل عن 10,000 حدث من الصفائح الدموية. مراقبة انبعاث التألق باستخدام مرشح تمرير ل FITC.
  2. قم ببوابة مجموعة الصفائح الدموية باستخدام التشتت الأمامي (FSC). افحص الصفائح الدموية والحويصلات الدقيقة التي تم إطلاقها وفقا لأحجامها. استخدام مخططات الكثافة لتحديد الصفائح الدموية والحويصلات الدقيقة التي تم إطلاقها لكل من الصفائح الدموية المريحة والمحفزة. تحليل كل مجموعة سكانية مسورة بشكل مستقل.
  3. يميز الصفائح الدموية المخثرة وفقا لمحور FL1. ضع القطع السالب في أقصى يمين مجموعة الصفائح الدموية في حالة الراحة (أي في وجود المخزن المؤقت للتفاعل). بعد تنشيط الصفائح الدموية ، صنف جميع الأحداث المترجمة على يمين هذا القطع على أنها صفائح ضفائح تعرض الفوسفاتيديل سيرين.
  4. يميز الحويصلات الدقيقة ، كونها أصغر من الصفائح الدموية ، من خلال خصائص تشتت الضوء الفريدة. اضبط القطع عند أدنى قيمة FSC لوحظت في مجموعة الصفائح الدموية المريحة. بعد التنشيط ، صنف أي أحداث إيجابية للفوسفاتيديل سيرين تقع تحت هذه العتبة على أنها حويصلات دقيقة.
    ملاحظة: ضع في اعتبارك الاختلاف الفردي في حجم الصفائح الدموية عن طريق ضبط القطع إذا لزم الأمر. تأكد من وجود أقل من 1٪ من الحويصلات الدقيقة في حالة الراحة.

النتائج

يتم القياس الكمي للصفائح الدموية والحويصلات الدقيقة المسببة للتخثر باستخدام تلطيخ الملحق الخامس ، مع تسجيل ما لا يقل عن 50,000 حدث لكل عينة. كما هو مذكور في الخطوة 2.2 ، تم أخذ قياسات الصفائح الدموية الأساسية من عينات محتضنة بمخزن مؤقت للتفاعل ، كما هو موضح في الش?...

Discussion

سلطت الدراسات الحديثة على الصفائح الدموية المخثرة الضوء على تغيراتها خلال العديد من الأمراض1،28،29 ، مما يؤكد أهمية تحليلها التفصيلي وتوصيفها30،31،32. في حين أن الاختبارا...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

اي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A blood collection tubesBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Bovine Serum Albumin 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Citric acid monohydrateMerck5949-29-1
Collagen Stago86924
Glucose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionophore Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Sodium hydrogen carbonateMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
Trisodium citrate dihydrate Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
αIIb integrin (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

References

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750 (2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536 (2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190 (2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386 (2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977 (2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104 (2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837 (2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403 (2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708 (2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022 (2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639 (2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484 (2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541 (2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005 (2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15 (2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49 (2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370 (2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221 (2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved