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要約

凝固促進剤の血小板形成は、血栓症のリスク増加と相関しています。.ここに提示されるのは、ヒトの血液から洗浄された血小板を単離するための正確なプロトコルであり、凝固促進剤の血小板の特徴であるホスファチジルセリンおよび微小胞放出の曝露を定量化することを目的としています。

要約

活性化された血小板は、主に凝固促進剤であるリン脂質ホスファチジルセリン(PS)を外膜表面に露出させ、元の細胞の元の膜構造と細胞質成分を保持するPS発現微小胞を放出することによって凝固を促進します。ホスファチジルセリンのアクセシビリティは、主要な凝固因子の結合を促進し、凝固酵素の触媒効率を大幅に増幅すると同時に、微小胞放出は細胞間シグナル伝達の重要なメディエーターとして機能します。凝固促進剤の血小板は、止血中の血栓の安定化に重要な役割を果たし、血流中の血小板の割合の増加は血栓症のリスクの増加と相関しています。また、血小板微小胞には、創傷治癒と炎症調節を促進する成長因子が豊富に含まれていることも示されています。フローサイトメトリーを用いたホスファチジルセリン曝露と微小小胞放出の解析は、そのサイズが小さく、関心のあるマーカーの陽性イベントの数が限られているため、大きな課題を提起します。過去10年間で大幅な進歩が見られたにもかかわらず、ホスファチジルセリン曝露と微小胞放出を評価する方法は、まだ進行中の作業です。残念ながら、普遍的に適用可能な単一のプロトコルは存在せず、特定のアプリケーションごとに最も適切な方法論を決定するために、いくつかの要素を評価する必要があります。ここでは、洗浄した血小板をヒトの血液から分離し、続いてコラーゲンおよび/またはトロンビンの活性化を行い、凝固促進剤の血小板を特徴付けるホスファチジルセリンと微小胞放出の曝露を測定するための詳細なプロトコルについて説明します。このプロトコールは、多血小板血漿の初期調製と洗浄された血小板の単離を容易にするように設計されています。最後に、ホスファチジルセリンへの曝露と微小胞の放出をフローサイトメトリーによって定量化し、凝固促進剤の血小板の同定を可能にします。

概要

血小板凝固剤の形成は、止血を維持するために重要です1,2,3。このプロセスには、テナーゼおよびプロトロンビナーゼ複合体の集合に必須の血小板膜上でのリン脂質のアゴニスト誘導性発現が含まれます1,3,4。血小板活性化後、血小板微小胞も連続的に放出されます5,6。微小胞(直径50nm〜1μm以上)は、元の細胞の膜構造と細胞質成分の両方をカプセル化しています7,8。微小胞は、細胞間シグナル伝達の重要なメディエーターであり、9,10、創傷治癒と炎症調節を促進する成長因子の貯蔵庫でもあります11,12。微小胞は、活性化血小板よりも50〜100倍凝固促進剤であることも示唆されています13。特に、最近の証拠は、貯蔵された血小板が活性化され、微小胞の産生につながることを示唆しています-これは血小板輸血療法の実践に影響を与える可能性があります。微小胞の長期保存期間と凝固促進活性の高まるため、輸血用途における血小板の有望な代替品となっています14。

方法論の革新は、直接的および間接的に、健康状態と疾患状態の両方で血小板凝固剤の形成を評価するために行われてきました4,14,15。精製血小板を用いたホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の評価は、多様なヒト疾患において血小板凝固反応がどのように摂動されるかについての新しいデータを提供してきた1,4。この成長する研究分野は、治療的介入の道も開きます1,4。しかし、血液から精製された血小板の単離と分析には時間がかかり、専用の実験装置が必要であり、したがって、現在のところ、日常的な臨床診断には適応できません16,17。ホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の分析も、そのサイズが小さく、関心のあるマーカーの陽性イベントの数が多いため、困難です18,19。

蛍光アネキシン-V結合を利用したフローサイトメトリーは、20年前の開始以来、血小板および微小胞でのPS発現の評価の基礎となってきました20。これは、凝固促進剤の血小板および微小胞21,22の検査において広く受け入れられています。したがって、Cazenaveのグループ23によって開発された技術を使用して血液サンプルから精製された血小板を単離し、血小板活性化24後のフローサイトメトリーによるホスファチジルセリン曝露および微小胞放出のその後の特性評価に使用できる最適化されたプロトコルがここに提示されます。このプロトコルは、関心のある臨床集団における凝固促進血小板のさらなる研究と詳細な特性評価を促進します。

プロトコル

このプロトコルはガイドラインに準拠しており、ボルドー大学病院の人間研究倫理委員会によって承認されました。血液サンプルは、インフォームドコンセントを提供した健康なボランティアから採取され、これらのサンプルは施設のプロトコルに従って処理されました。血小板機能に影響を与える可能性のある物質を摂取したドナーは、実験前10日以内にそのような物質を摂取した場合、除外されました。健康なボランティアからインフォームドコンセントが得られ、血液を採取してデータを公開しました。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.血液の採取と洗浄した血小板の調製

  1. 最初の3 mLを廃棄した後、活性抗凝固剤とクエン酸三ナトリウムとクエン酸およびデキストロース(ACD)を含む収集チューブに末 ?? 静脈血を採取します。.
  2. 採取後、チューブを静かに反転させて血液をACDと混合し、混合物を室温で15分間休ませてから遠心分離します。
  3. 遠心分離前に自動セルカウンターを使用して血小板をカウントし、遠心分離の正しい速度を決定します(表1)。ブレーキをかけずに、250 x g で室温 (RT) で 10 分間遠心分離することにより、多血小板血漿 (PRP) を調製し、血小板の回復を最適化します。
    注:このステップでは、サンプルに3つの層が生成されます:血漿、血小板、および白血球のごく一部を含む上層。白血球が豊富な中間層。そして赤血球からなる最下層。PRPを上層から新しい50 mLコニカルチューブに慎重に移し、赤血球と白血球による汚染を防ぎます。
  4. PRPに、1 mLのACD-A( 表2を参照)と9 mLあたり6.25 μLのアピラーゼを追加します。.
    注:アピラーゼは、0.02 U / mLの濃度で、血小板によって分泌される微量のATPまたはADPを分解し、それにより血小板ADP受容体の脱感作を防ぎ、血小板形状25を維持します。.プロスタサイクリンPGI2阻害剤(0.5μM)もアピラーゼに含めて、血小板の活性化を防ぐことができます。
  5. 血小板ペレットを室温で1100 x g で10分間遠心分離することにより、血小板ペレットを調製します。パスツールピペットなどの穏やかな方法を使用して、血小板不良血漿(PPP)を含む上清を吸引し、ペレットを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁します( 表3 および 表4を参照)。.ピペットで穏やかに均質化し、さらに3〜4mLの洗浄バッファーを加えます。
    注:カルシウムレベルは、血漿中に存在する血栓因子による凝固を防ぐために減少します。.この段階では、血小板の少ない血漿が完全に除去され、トロンビン産生による血栓形成と血小板の活性化が防止されます。
  6. 再びRTで1100 x g で10分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁します。150 μLの血小板懸濁液を1.5 mLチューブに移し、自動セルカウンターを使用して細胞計数を行います。次に、ペレットを3〜4mLの洗浄バッファーで再懸濁します。
  7. 1100 x g で10分間(室温で)最終遠心分離を行います。上清を吸引し、血小板ペレットを反応緩衝液( 表5 および 表6を参照)に再懸濁して、最終濃度5 x 1011 血小板/ Lを達成します。.
  8. 洗浄した血小板を実験前に少なくとも30分間休ませて、残留阻害剤が摩耗し、血小板が緩衝液に順応するのを待ちます。

2. アッセイ調製

  1. 反応バッファー中のすべてのアゴニストと蛍光色素を調製します。5 μLのトロンビンを45 μLのバッファー(希釈1:10)に加え、5 μLのイオノフォアを495 μLのバッファー(希釈1:500)に加えます。
    1. 内部アッセイでは、非活性化血小板をシングルアゴニストおよびデュアルアゴニストで治療した血小板に対してベンチマークします。50 x10 9 血小板/Lで洗浄した血小板100 μLを、(i)反応緩衝液10 μL、(ii)非希釈コラーゲン3 μL(最終濃度30 μg/mL)、(iii)10 μLの希釈済みトロンビン(0.5 IU/mL)、(iv)3 μLの非希釈コラーゲン+10 μLの希釈済みトロンビン、(v)10 μLの希釈済みイオノフォア(最終濃度2 μM)に、さまざまなアリコートで添加します。 これは、以前に述べたように、細胞内カルシウムレベルを直接増加させることが知られています26。
      注:A23187やイオノマイシンなどのカルシウムイオノフォアによる治療は、広範なリン脂質膜のスクランブルとPSの外部化の促進を誘発するため、非常に重要です。
    2. 各アリコートを手で静かに振って、37°Cで5分間インキュベートします。
      注:アゴニストのインキュベーションを長くする(30分)と、フローサイトメトリー解析プロセス中の血小板集団間の分化が改善する可能性があります。
  2. 各マイクロチューブに5 μLの非希釈Annexin-V FITCを加え、暗所で室温で10分間インキュベートします。
    注:血小板特異的受容体の1つであるGPIX(CD42b)またはαIIbインテグリン(CD41、GPIIb)に対するモノクローナル抗体も、血小板細胞をよりよく同定するために含めることができます。
  3. 500 μLの反応バッファーを添加してプロセスを停止し、フローサイトメーターを使用してサンプルの分析を進めます。

3. フローサイトメトリー(FC)による凝固促進剤の血小板および微小胞のキャラクタリゼーション

注:信頼性の高い血小板機能解析のためには、確立された標準27に従って構成されたフローサイトメトリー(FC)装置を使用してください。装置は、前方散乱光(FSC)と少なくとも1つの蛍光シグナルを検出できる必要があります。光散乱検出器と蛍光検出器を対数ゲインに設定します。サンプルをFC用に適切に希釈して、個々の血小板のみがデータ取得速度を下げてカウントされるようにします。

  1. フローサイトメーターを「低速」の流速に設定し、閾値は10,000血小板イベント以上とします。FITCのパスフィルターを使用して蛍光発光をモニターします。
  2. 前方散乱法(FSC)を使用して血小板集団をゲートします。血小板と放出された微小胞をそのサイズに応じて調べます。密度プロットを使用して、休止血小板と刺激血小板の両方について、血小板と放出された微小胞を特定します。各ゲート母集団を個別に分析します。
  3. FL1軸に従って凝固促進血小板を区別します。ネガティブカットオフを、休止状態(すなわち、反応緩衝液の存在下)の血小板集団の右端に配置します。血小板活性化後、このカットオフの右側に局在するすべてのイベントを、ホスファチジルセリンを曝露する血小板として分類します。
  4. 微小胞は血小板よりも小さいため、その特異な光散乱特性によって区別されます。カットオフを、休止血小板集団で観察される最小のFSC値に設定します。活性化後、この閾値を下回るホスファチジルセリン陽性事象を微小胞として分類します。
    注:必要に応じてカットオフを調整することにより、血小板サイズの個々の変動を考慮に入れます。.静止状態にある微小胞が1%未満であることを確認してください。

結果

凝固促進剤の血小板および微小胞の定量は、Annexin-V染色を使用して行われ、サンプルあたり少なくとも50,000のイベントが記録されています。ステップ 2.2 で述べたように、ベースラインの血小板測定値は、 図 1A に示すように、反応バッファーでインキュベートしたサンプルから行いました。血小板サイズは、前方散乱(FSC)の中央値を使用して測...

ディスカッション

凝固促進剤血小板に関する最近の研究では、いくつかの疾患における血小板の変化が強調されており1,28,29、詳細な分析と特性評価の重要性が強調されている30,31,32。血小板凝固剤の形成を評価するための現在の臨床検査は限ら?...

開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

何一つ。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A blood collection tubesBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Bovine Serum Albumin 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Citric acid monohydrateMerck5949-29-1
Collagen Stago86924
Glucose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionophore Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Sodium hydrogen carbonateMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
Trisodium citrate dihydrate Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
αIIb integrin (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

参考文献

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750 (2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536 (2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190 (2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386 (2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977 (2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104 (2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837 (2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403 (2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708 (2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022 (2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639 (2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484 (2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541 (2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005 (2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15 (2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49 (2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370 (2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221 (2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

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