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요약

프로응고제 혈소판 형성은 혈전증 위험 증가와 상관관계가 있습니다. 여기에는 인간 혈액에서 세척된 혈소판을 분리하기 위한 정확한 프로토콜이 제시되어 있으며, 이는 프로코아응고제 혈소판의 특징인 포스파티딜세린 및 미세소포 방출의 노출을 정량화하기 위한 것입니다.

초록

활성 혈소판은 주로 외막 표면에 전응고제인 인지질 포스파티딜세린(PS)을 노출시키고 원래 세포의 원래 막 구조와 세포질 구성 요소를 유지하는 PS 발현 미세소포를 방출하여 응고를 촉진합니다. 포스파티딜세린의 접근성은 주요 응고 인자의 결합을 촉진하여 응고 효소의 촉매 효율을 크게 증폭시키는 반면, 미세소포 방출은 세포 간 신호전달의 중추적인 매개체 역할을 합니다. 프로응고제 혈소판은 지혈 중 혈전 안정화에 중요한 역할을 하며, 혈류에서 혈소판의 비율이 증가하면 혈전증 위험이 증가합니다. 또한 혈소판 미세소포는 상처 치유와 염증 조절을 촉진하는 성장 인자가 풍부하다는 것이 밝혀졌습니다. 유세포 분석을 사용하여 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 분석하는 것은 크기가 작고 관심 마커에 대한 양성 이벤트의 수가 제한되어 있기 때문에 상당한 어려움이 있습니다. 지난 10년 동안 상당한 발전이 이루어졌음에도 불구하고 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 평가하는 방법은 여전히 진행 중인 연구로 남아 있습니다. 불행히도 보편적으로 적용 가능한 단일 프로토콜은 존재하지 않으며 각 특정 애플리케이션에 가장 적합한 방법론을 결정하기 위해 여러 요소를 평가해야 합니다. 여기에서는 인간 혈액에서 세척된 혈소판을 분리한 후 콜라겐 및/또는 트롬빈 활성화를 통해 응고제 혈소판을 특징짓는 포스파티딜세린 및 미세소포 방출의 노출을 측정하는 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 혈소판이 풍부한 혈장의 초기 준비와 세척된 혈소판의 분리를 용이하게 하도록 설계되었습니다. 마지막으로, 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출은 유세포 분석으로 정량화되어 응고제 혈소판을 식별할 수 있습니다.

서문

혈소판 프로코응고제 형성은 지혈을 유지하는 데 매우 중요합니다 1,2,3. 이 과정은 혈소판막에서 인지질의 작용제 유도 발현을 포함하며, 이는 테나아제 및 프로트롬비나제 복합체 1,3,4의 조립에 필수적입니다. 혈소판 활성화 후, 혈소판 미세소포도 지속적으로 방출된다 5,6. 미세소포(직경이 50nm에서 1μm 이상)는 원래 세포의 막 구조와 세포질 구성 요소를 모두 캡슐화합니다 7,8. 미세소포는 세포간 신호전달의 중요한 매개체이며9,10 상처 치유와 염증 조절을 촉진하는 성장 인자의 저장소이기도 하다11,12. 또한 미세소포는 활성 혈소판보다 50-100배 더 많은 응고력을 가지고 있는 것으로 제안되었다13. 특히, 최근의 증거에 따르면 저장된 혈소판이 활성화되어 미세소포가 생성되며, 이는 혈소판 수혈 요법에 잠재적인 영향을 미칠 수 있습니다. 미세소포의 확장된 저장 기간과 증가된 응고 활성은 수혈 응용 분야에서 혈소판의 유망한 대체품으로 만듭니다14.

건강 및 질병 상태에서 혈소판 프로코아응고제 형성을 직접 및 간접적으로 평가하기 위한 방법론적 혁신이 이루어졌다 4,14,15. 정제된 혈소판을 사용한 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출 평가는 다양한 인간 질병에서 혈소판 응고 반응이 어떻게 교란되는지에 대한 새로운 데이터를 제공했습니다 1,4. 이 성장하는 연구 분야는 또한 치료적 개입을 위한 길을 열어줍니다 1,4. 그러나 혈액에서 정제된 혈소판을 분리하고 분석하는 것은 시간이 많이 걸리고 전문 실험실 장비가 필요하므로 현재로서는 일상적인 임상 진단에 적용할 수 없습니다16,17. 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 분석하는 것도 크기가 작고 관심 마커에 대한 양성 이벤트의 수로 인해 어렵습니다18,19.

형광 Annexin-V 결합을 활용하는 유세포 분석은 20년 전 시작된 이래로 혈소판 및 미세소포에서 PS 발현을 평가하는 데 있어 초석이 되어 왔습니다20. 그것은 procoagulant 혈소판 및 microvesicles21,22의 검사에서 널리 수용되었습니다. 따라서 Cazenave의 그룹23에서 개발한 기술을 사용하여 혈액 샘플에서 정제된 혈소판을 분리하고 혈소판 활성화24 후 유세포 분석에 의한 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출의 후속 특성 분석에 사용할 수 있는 최적화된 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 이 프로토콜은 관심 있는 임상 집단에서 응고제 혈소판에 대한 추가 연구와 심층적인 특성 분석을 용이하게 할 것입니다.

프로토콜

이 프로토콜은 지침을 따르며 보르도 대학병원 인간 연구 윤리 위원회(University Hospital of Bordeaux Human Research Ethics Committee)의 승인을 받았습니다. 혈액 샘플은 정보에 입각한 동의를 제공한 건강한 지원자로부터 얻었으며 이 샘플은 기관 프로토콜에 따라 처리되었습니다. 혈소판 기능에 영향을 줄 수 있는 물질을 복용한 기증자는 실험 전 10일 이내에 해당 물질을 복용한 경우 제외되었습니다. 건강한 자원 봉사자로부터 혈액을 채취하고 데이터를 게시하기 위해 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 세척된 혈소판의 채혈 및 준비

  1. 처음 3mL를 버린 후 활성 항응고제인 Tri-sodium Citrate with Citric Acid and Dextrose(ACD)가 포함된 수집 튜브에 말초 정맥혈을 수집합니다.
  2. 채취 후 튜브를 부드럽게 뒤집어 혈액을 ACD와 혼합하고 혼합물을 원심분리하기 전에 실온에서 15분 동안 그대로 둡니다.
  3. 원심분리를 위한 올바른 속도를 결정하기 위해 원심분리 전에 자동 세포 카운터를 사용하여 혈소판을 계수합니다(표 1). 혈소판 회복을 최적화하기 위해 브레이크를 걸지 않고 실온(RT)에서 10분 동안 250 x g 에서 원심분리하여 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 준비합니다.
    참고: 이 단계는 샘플에 3개의 층을 생성합니다: 혈장, 혈소판 및 백혈구의 작은 부분을 포함하는 상층; 백혈구가 풍부한 중간층; 그리고 적혈구로 구성된 바닥층. 적혈구와 백혈구로 오염되지 않도록 상층에서 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 PRP를 조심스럽게 옮깁니다.
  4. PRP에 1mL의 ACD-A( 표 2 참조)와 9mL당 6.25μL의 아피라아제를 추가합니다.
    참고: 0.02U/mL 농도의 아피라제는 혈소판에서 분비되는 미량의 ATP 또는 ADP를 저하시켜 혈소판 ADP 수용체의 탈감작을 방지하고 혈소판 모양을 유지합니다25. 프로스타사이클린 PGI2 억제제(0.5μM)도 혈소판 활성화를 방지하기 위해 아피라아제와 함께 포함될 수 있습니다.
  5. 실온에서 1100 x g 으로 10분 동안 원심분리하여 혈소판 펠릿을 준비합니다. 파스퇴르 피펫과 같은 부드러운 방법을 사용하여 PPP(Platelet Poor Plasma)를 함유하는 상층액을 흡입하고 펠릿을 1mL의 세척 완충액에 재현탁시킵니다( 표 3 및 표 4 참조). 피펫으로 부드럽게 균질화한 다음 세척 완충액 3-4mL를 추가합니다.
    참고: 칼슘 수치는 혈장에 존재하는 응고 인자와의 응고를 방지하기 위해 감소합니다. 이 단계에서 혈소판이 부족한 혈장이 완전히 제거되어 트롬빈 생성에 의한 혈전 형성 및 혈소판 활성화를 방지합니다.
  6. RT에서 1100 x g 으로 10분 동안 다시 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 펠릿을 1mL의 세척 완충액에 재현탁시킵니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 위해 혈소판 현탁액의 150μL를 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 3-4mL의 세척 완충액으로 펠릿을 재현탁시킵니다.
  7. 1100 x g 에서 10분 동안 최종 원심분리를 수행합니다(RT에서). 상층액을 흡인하고 혈소판 펠릿을 반응 완충액의 부피( 표 5 및 표 6 참조)에 재현탁시켜 5 x 1011 혈소판/L의 최종 농도를 달성합니다.
  8. 세척된 혈소판을 실험 전에 최소 30분 동안 그대로 두어 잔류 억제제가 마모되고 혈소판이 완충액에 적응할 수 있도록 합니다.

2. 분석 준비

  1. 반응 완충액에서 모든 작용제와 형광 색소를 준비합니다. 완충액 45μL에 트롬빈 5μL를 첨가하고(희석 1:10) 완충액 495μL에 이오단 5μL를 첨가합니다(희석 1:500).
    1. 내부 분석의 경우, 단일 및 이중 작용제로 치료받은 혈소판에 대해 활성화되지 않은 혈소판을 벤치마킹합니다. (i) 반응 완충액 10μL, (ii) 희석되지 않은 콜라겐 3μL(최종 농도 30μg/mL), (iii) 희석된 트롬빈 10μL(0.5IU/mL), (iv) 비희석된 콜라겐 3μL + 사전 희석된 트롬빈 10μL, (v) 사전 희석된 이오단단 10μL(최종 농도 2μM)에 50 x 10 9혈소판 /L에서 세척된 혈소판 100μL를 첨가하고, 이는 앞서 언급한 바와 같이 세포 내 칼슘 수치를 직접 증가시키는 것으로 알려져있다 26.
      참고: A23187 또는 ionomycin과 같은 칼슘 이온단을 사용한 처리는 광범위한 인지질 막 스크램블링을 유도하고 PS 외부화를 강화하기 때문에 매우 중요합니다.
    2. 각 부분 표본을 손으로 부드럽게 흔들고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
      참고: 작용제 배양이 길면(30분) 유세포분석 분석 과정에서 혈소판 집단을 더 잘 구별할 수 있습니다.
  2. 각 마이크로튜브에 5μL의 희석되지 않은 Annexin-V FITC를 첨가하고 어두운 곳에서 10분 동안 실온에서 배양합니다.
    참고: 혈소판 특이적 수용체 중 하나인 GPIX(CD42b) 또는 αIIb integrin(CD41, GPIIb)에 대한 단클론 항체도 혈소판 세포를 더 잘 식별하기 위해 포함될 수 있습니다.
  3. 500μL의 반응 완충액을 추가하여 공정을 중지하고 유세포분석기를 사용하여 시료 분석을 진행합니다.

3. 유세포분석법(FC)에 의한 응고제 혈소판 및 미세소포의 특성 분석

참고: 신뢰할 수 있는 혈소판 기능 분석을 위해 확립된 표준27에 따라 구성된 유세포 분석(FC) 기기를 사용하십시오. 기기는 전방 산란(FSC) 및 하나 이상의 형광 신호를 감지할 수 있어야 합니다. light scatter and fluorescence detectors를 logarithmic gain으로 설정합니다. FC에 적합하게 샘플을 희석하여 느린 데이터 수집 속도로 개별 혈소판만 계수되도록 합니다.

  1. 유세포 분석기를 최소 10,000 혈소판 이벤트의 임계값을 가진 '느린' 유속으로 설정합니다. FITC용 패스 필터를 사용하여 형광 방출을 모니터링합니다.
  2. 전방 산란(FSC)을 사용하여 혈소판 집단을 게이트합니다. 혈소판과 방출된 미세소포를 크기에 따라 검사합니다. 밀도 플롯을 사용하여 휴지 및 자극 혈소판 모두에 대한 혈소판과 방출된 미세소포를 식별합니다. 각 게이트 모집단을 독립적으로 분석합니다.
  3. FL1 축에 따라 응고제 혈소판을 구별합니다. 휴지 상태(즉, 반응 완충액이 있는 경우)에 있는 혈소판 집단의 맨 오른쪽에 음수 컷오프를 배치합니다. 혈소판 활성화 후, 이 컷오프의 오른쪽에 국한된 모든 이벤트를 포스파티딜세린을 노출시키는 혈소판으로 분류합니다.
  4. 혈소판보다 작은 미세소포를 고유한 광 산란 특성으로 구별합니다. 휴지 혈소판 집단에서 관찰된 가장 낮은 FSC 값으로 컷오프를 설정합니다. 활성화 후 이 임계값 아래로 떨어지는 포스파티딜세린 양성 이벤트를 미세소포로 분류합니다.
    참고: 필요한 경우 컷오프를 조정하여 혈소판 크기의 개인차를 고려하십시오. 미세소포의 1% 미만이 휴지 상태에 있는지 확인합니다.

결과

프로응고제 혈소판 및 미세소포의 정량화는 Annexin-V 염색을 사용하여 이루어지며, 시료당 최소 50,000개의 이벤트가 기록됩니다. 단계 2.2에서 설명한 바와 같이, 기준선 혈소판 측정은 그림 1A에 나타난 바와 같이 반응 완충액으로 배양된 샘플에서 수행되었습니다. 혈소판 크기는 중앙값 순방향 산란(FSC) 값을 사용하여 측정하였다. FSC는 다양한 요인에...

토론

프로응고제 혈소판에 대한 최근 연구는 여러 질병 1,28,29에서 혈소판의 변화를 강조하고 있으며, 이에 대한 상세한 분석 및 특성화의 중요성을 강조하고있다 30,31,32. 혈소판 프로코아응고제 형성을 평가하기 위한 현재 임상 시험은 ...

공개

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

없음.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A blood collection tubesBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Bovine Serum Albumin 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Citric acid monohydrateMerck5949-29-1
Collagen Stago86924
Glucose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionophore Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Sodium hydrogen carbonateMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
Trisodium citrate dihydrate Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
αIIb integrin (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

참고문헌

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750 (2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536 (2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190 (2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386 (2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977 (2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104 (2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837 (2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403 (2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708 (2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022 (2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639 (2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484 (2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541 (2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005 (2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15 (2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49 (2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370 (2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221 (2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

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