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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La formazione di piastrine procoagulanti è stata correlata con un aumentato rischio di trombosi. Di seguito viene presentato un preciso protocollo per l'isolamento delle piastrine lavate dal sangue umano, volto a quantificare l'esposizione alla fosfatidilserina e al rilascio di microvescicole, caratteristiche distintive delle piastrine procoagulanti.

Abstract

Le piastrine attivate promuovono la coagulazione principalmente esponendo il fosfolipide fosfatidilserina (PS) procoagulante sulla loro superficie esterna della membrana e rilasciando microvescicole che esprimono PS che mantengono l'architettura di membrana originale e i componenti citoplasmatici delle loro cellule originarie. L'accessibilità della fosfatidilserina facilita il legame dei principali fattori della coagulazione, amplificando significativamente l'efficienza catalitica degli enzimi della coagulazione, mentre il rilascio di microvescicole agisce come mediatore fondamentale della segnalazione intercellulare. Le piastrine procoagulanti svolgono un ruolo cruciale nella stabilizzazione del coagulo durante l'emostasi e la loro maggiore proporzione nel flusso sanguigno è correlata a un aumento del rischio di trombosi. È stato anche dimostrato che le microvescicole piastriniche sono ricche di fattori di crescita che favoriscono la guarigione delle ferite e la modulazione infiammatoria. L'analisi dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole mediante citometria a flusso pone sfide significative a causa delle loro dimensioni ridotte e del numero limitato di eventi positivi per i marcatori di interesse. Nonostante i notevoli progressi compiuti nell'ultimo decennio, i metodi per valutare l'esposizione alla fosfatidilserina e il rilascio di microvescicole rimangono in fase di sviluppo. Purtroppo, non esiste un unico protocollo universalmente applicabile e diversi fattori devono essere valutati per determinare la metodologia più appropriata per ogni specifica applicazione. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare le piastrine lavate dal sangue umano, seguito dall'attivazione del collagene e/o della trombina, per misurare l'esposizione alla fosfatidilserina e al rilascio di microvescicole che caratterizzano le piastrine procoagulanti. Questo protocollo è progettato per facilitare la preparazione iniziale del plasma ricco di piastrine e l'isolamento delle piastrine lavate. Infine, l'esposizione alla fosfatidilserina e il rilascio di microvescicole sono quantificati mediante citometria a flusso, consentendo l'identificazione delle piastrine procoagulanti.

Introduzione

La formazione di procoagulanti piastrinici è fondamentale per mantenere l'emostasi 1,2,3. Questo processo coinvolge l'espressione indotta dall'agonista dei fosfolipidi sulla membrana piastrinica, che è essenziale per l'assemblaggio dei complessi tenasi e protrombinasi 1,3,4. Dopo l'attivazione piastrinica, anche le microvescicole piastriniche vengono rilasciate continuamente 5,6. Le microvescicole (da 50 nm a oltre 1 μm di diametro) incapsulano sia la struttura della membrana che i costituenti citoplasmatici delle cellule originarie 7,8. Le microvescicole sono importanti mediatori della segnalazione intercellulare 9,10 e anche depositari di fattori di crescita che promuovono la guarigione delle ferite e la modulazione infiammatoria11,12. È stato anche suggerito che le microvescicole siano da 50 a 100 volte più procoagulanti delle piastrine attivate13. In particolare, prove recenti suggeriscono che le piastrine immagazzinate si attivano, portando alla produzione di microvescicole: questo ha potenziali ramificazioni per la pratica della terapia trasfusionale piastrinica. La maggiore durata di conservazione delle microvescicole e l'elevata attività procoagulante le rendono un promettente sostituto delle piastrine nelle applicazioni trasfusionali14.

Sono state apportate innovazioni metodologiche per valutare, direttamente e indirettamente, la formazione di procoagulanti piastrinici sia in condizioni di salute che di malattia 4,14,15. Le valutazioni dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole utilizzando piastrine purificate hanno fornito nuovi dati su come le risposte procoagulanti piastriniche sono perturbate in diverse malattie umane 1,4. Questo campo di ricerca in crescita apre anche strade per interventi terapeutici 1,4. Tuttavia, l'isolamento e l'analisi delle piastrine purificate dal sangue richiedono molto tempo, richiedono attrezzature di laboratorio specializzate e, quindi, non sono attualmente adattabili per la diagnostica clinica di routine16,17. Anche l'analisi dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole è impegnativa a causa delle loro piccole dimensioni e del numero di eventi positivi per i marcatori di interesse18,19.

La citometria a flusso, che sfrutta il legame fluorescente dell'annessina-V, è stata una pietra miliare nella valutazione dell'espressione di PS su piastrine e microvescicole sin dal suo inizio due decenni fa20. Ha ottenuto un'ampia accettazione nell'esame delle piastrine e delle microvescicole procoagulanti21,22. Pertanto, viene presentato qui un protocollo ottimizzato che può essere utilizzato per l'isolamento di piastrine purificate da campioni di sangue utilizzando la tecnica sviluppata dal gruppo23 di Cazenave, e la successiva caratterizzazione dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole mediante citometria a flusso dopo l'attivazione piastrinica24. Questo protocollo faciliterà ulteriori studi e una caratterizzazione approfondita delle piastrine procoagulanti nelle popolazioni cliniche di interesse.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida ed è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca Umana dell'Ospedale Universitario di Bordeaux. I campioni di sangue sono stati ottenuti da volontari sani che hanno fornito il consenso informato e questi campioni sono stati elaborati secondo i protocolli istituzionali. I donatori che avevano assunto sostanze che potevano influire sulla funzione piastrinica erano esclusi se tali sostanze erano state assunte nei 10 giorni precedenti gli esperimenti. Il consenso informato è stato ottenuto da volontari sani per raccogliere il loro sangue e pubblicare i loro dati. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Raccolta del sangue e preparazione delle piastrine lavate

  1. Raccogliere il sangue venoso periferico in provette di raccolta contenenti l'anticoagulante attivo citrato trisodico con acido citrico e destrosio (ACD) dopo aver eliminato i primi 3 ml.
  2. Dopo la raccolta, capovolgere delicatamente la provetta per mescolare il sangue con l'ACD e lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti prima della centrifugazione.
  3. Contare le piastrine utilizzando un contatore di cellule automatizzato prima della centrifugazione per determinare la velocità corretta per la centrifugazione (Tabella 1). Preparare il plasma ricco di piastrine (PRP) mediante centrifugazione a 250 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) senza applicare il freno per ottimizzare il recupero piastrinico.
    NOTA: Questa fase produrrà tre strati nel campione: lo strato superiore contenente plasma, piastrine e una piccola frazione di globuli bianchi; uno strato intermedio arricchito con globuli bianchi; e uno strato inferiore costituito da globuli rossi. Trasferire con cura il PRP dallo strato superiore in una nuova provetta conica da 50 mL per evitare la contaminazione con globuli rossi e bianchi.
  4. Al PRP, aggiungere 1 mL di ACD-A (vedere Tabella 2) e 6,25 μL di apirasi per 9 mL.
    NOTA: L'apirasi, ad una concentrazione di 0,02 U/mL, degrada le tracce di ATP o ADP secrete dalle piastrine, prevenendo così la desensibilizzazione dei recettori ADP piastrinici e mantenendo la forma piastrinica25. Un inibitore della prostaciclina PGI2 (0,5 μM) può anche essere incluso con l'apirasi per prevenire l'attivazione piastrinica.
  5. Preparare il pellet piastrinico mediante centrifugazione a RT a 1100 x g per 10 min. Aspirare il surnatante contenente plasma povero di piastrine (PPP) utilizzando un metodo delicato, come una pipetta Pasteur, e risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lavaggio (vedere Tabella 3 e Tabella 4). Omogeneizzare delicatamente con una pipetta, quindi aggiungere altri 3-4 ml di tampone di lavaggio.
    NOTA: Il livello di calcio viene ridotto per prevenire la coagulazione con i fattori della coagulazione presenti nel plasma. In questa fase, il plasma povero di piastrine è stato completamente rimosso, impedendo la formazione di coaguli e l'attivazione piastrinica da parte della produzione di trombina.
  6. Centrifugare nuovamente a RT a 1100 x g per 10 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lavaggio. Trasferire 150 μl della sospensione piastrinica in una provetta da 1,5 mL per il conteggio delle cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Quindi, risospendere il pellet con 3-4 mL di tampone di lavaggio.
  7. Eseguire una centrifugazione finale a 1100 x g per 10 minuti (a RT). Aspirare il surnatante e risospendere il pellet piastrinico in un volume di tampone di reazione (vedere Tabella 5 e Tabella 6) per ottenere una concentrazione finale di 5 x 1011 piastrine/L.
  8. Lasciare riposare le piastrine lavate per almeno 30 minuti prima degli esperimenti per consentire agli inibitori residui di svanire e alle piastrine di acclimatarsi al tampone.

2. Preparazione del saggio

  1. Preparare tutti gli agonisti e i fluorocromi nel tampone di reazione. Aggiungere 5 μL di trombina a 45 μL di tampone (diluizione 1:10) e 5 μL di ionoforo a 495 μL di tampone (diluizione 1:500).
    1. Per i test interni, confrontare le piastrine non attivate con quelle trattate con agonisti singoli e doppi. Aggiungere, in aliquote diverse, 100 μl di piastrine lavate a 50 x 109 piastrine/L a: (i) 10 μl di tampone di reazione, (ii) 3 μl di collagene non diluito (concentrazione finale di 30 μg/mL), (iii) 10 μl di trombina prediluita (0,5 UI/mL), (iv) 3 μl di collagene non diluito + 10 μl di trombina prediluita e (v) 10 μl di ionoforo prediluito (concentrazione finale di 2 μM), che è noto per aumentare direttamente i livelli intracellulari di calcio come notato in precedenza26.
      NOTA: Il trattamento con uno ionoforo di calcio, come A23187 o ionomicina, è fondamentale in quanto induce un esteso scrambling della membrana fosfolipidica e una maggiore esternalizzazione del PS.
    2. Agitare delicatamente ogni aliquota a mano e incubare a 37 °C per 5 minuti.
      NOTA: Un'incubazione più lunga dell'agonista (30 minuti) può consentire una migliore differenziazione tra le popolazioni piastriniche durante il processo di analisi della citometria a flusso.
  2. Aggiungere 5 μl di Annexin-V FITC non diluita a ciascuna microprovetta e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al buio.
    NOTA: Un anticorpo monoclonale contro uno dei recettori piastrinici specifici, GPIX (CD42b) o integrina αIIb (CD41, GPIIb), potrebbe anche essere incluso per identificare meglio le cellule piastriniche.
  3. Aggiungere 500 μL di tampone di reazione per arrestare il processo e procedere con l'analisi del campione utilizzando un citometro a flusso.

3. Caratterizzazione di piastrine e microvescicole procoagulanti mediante Citometria a Flusso (FC)

NOTA: Per un'analisi affidabile della funzione piastrinica, utilizzare uno strumento di citometria a flusso (FC) configurato secondo gli standard stabiliti27. Lo strumento deve essere in grado di rilevare la diffusione diretta (FSC) e almeno un segnale di fluorescenza. Impostare i rilevatori di dispersione della luce e di fluorescenza su guadagno logaritmico. Diluire i campioni in modo adeguato per FC per garantire che vengano contate solo le singole piastrine a una velocità di acquisizione dati ridotta.

  1. Impostare il citometro a flusso su una velocità di flusso "lenta" con una soglia di almeno 10.000 eventi piastrinici. Monitorare l'emissione di fluorescenza utilizzando un filtro passante per FITC.
  2. Gate della popolazione piastrinica utilizzando la diffusione diretta (FSC). Esaminare le piastrine e le microvescicole rilasciate in base alle loro dimensioni. Utilizzare i grafici di densità per identificare le piastrine e le microvescicole rilasciate sia per le piastrine a riposo che per quelle stimolate; Analizza ogni popolazione recintata in modo indipendente.
  3. Distinguere le piastrine procoagulanti in base all'asse FL1. Posizionare il cut-off negativo all'estrema destra della popolazione piastrinica nello stato di riposo (cioè in presenza di tampone di reazione). Dopo l'attivazione piastrinica, classificare tutti gli eventi localizzati a destra di questo cut-off come piastrine che espongono fosfatidilserina.
  4. Differenzia le microvescicole, essendo più piccole delle piastrine, in base alle loro caratteristiche uniche di diffusione della luce. Impostare il cut-off al valore FSC più basso osservato nella popolazione piastrinica a riposo. Dopo l'attivazione, classificare come microvescicole tutti gli eventi positivi alla fosfatidilserina che scendono al di sotto di questa soglia.
    NOTA: Tenere conto della variazione individuale delle dimensioni delle piastrine regolando il cut-off se necessario. Assicurarsi che meno dell'1% delle microvescicole sia presente nello stato di riposo.

Risultati

La quantificazione delle piastrine e delle microvescicole procoagulanti si ottiene utilizzando la colorazione con annessina-V, con almeno 50.000 eventi registrati per campione. Come indicato nella fase 2.2, le misurazioni piastriniche al basale sono state effettuate da campioni incubati con tampone di reazione, come illustrato nella Figura 1A. Le dimensioni delle piastrine sono state misurate utilizzando il valore mediano di diffusione diretta (FSC). Sebbene...

Discussione

Recenti studi sulle piastrine procoagulanti hanno evidenziato i loro cambiamenti durante diverse malattie 1,28,29, sottolineando l'importanza della loro analisi e caratterizzazione dettagliata 30,31,32. Sebbene gli attuali test clinici per valutare la formazione di procoagulanti piastrinici siano limita...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Nessuno.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A blood collection tubesBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Bovine Serum Albumin 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Citric acid monohydrateMerck5949-29-1
Collagen Stago86924
Glucose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionophore Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Sodium hydrogen carbonateMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
Trisodium citrate dihydrate Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
αIIb integrin (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

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