אפיון טסיות מעודדות קרישה על ידי מדידת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מטסיות אדם מטוהרות

Summary

היווצרות טסיות דם מעודדות נקשרה עם סיכון מוגבר לפקקת. מוצג כאן פרוטוקול מדויק לבידוד טסיות דם שטופות מדם אדם, שנועד לכמת את החשיפה של פוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית, שהם מאפיינים ייחודיים של טסיות מעודדות.

Abstract

טסיות דם פעילות מעודדות קרישה בעיקר על-ידי חשיפת פוספטידיל-סרין מעודד קרישה (PS) על פני השטח החיצוניים של הממברנה שלהן ושחרור מיקרו-שלפוחיות מבטאות PS השומרות על ארכיטקטורת הממברנה המקורית ועל המרכיבים הציטופלזמיים של התאים המקוריים שלהן. הנגישות של פוספטידיל-סרין מאפשרת קשירה של גורמי קרישה עיקריים, ומגבירה באופן משמעותי את היעילות הקטליטית של אנזימי קרישה, בעוד שחרור שלפוחית מיקרו פועל כמתווך מרכזי של איתות בין-תאי. טסיות הדם מעודדות קרישה ממלאות תפקיד מכריע בייצוב קריש הדם במהלך המוסטאזיס, ושיעורן המוגבר בזרם הדם נמצא בקורלציה עם סיכון מוגבר לפקקת. כמו כן הוכח כי מיקרובועיות טסיות עשירות בגורמי גדילה המקדמים ריפוי פצעים ומודולציה דלקתית. ניתוח החשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות באמצעות ציטומטריית זרימה מציב אתגרים משמעותיים בשל גודלם הקטן והמספר המוגבל של אירועים חיוביים לסמנים מעניינים. למרות התקדמות ניכרת בעשור האחרון, שיטות להערכת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות עדיין נמצאות בתהליך. למרבה הצער, לא קיים פרוטוקול אוניברסלי יחיד, ויש להעריך מספר גורמים כדי לקבוע את המתודולוגיה המתאימה ביותר עבור כל יישום ספציפי. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד טסיות דם שטופות מדם אנושי, ולאחר מכן הפעלת קולגן ו/או תרומבין, כדי למדוד את החשיפה של פוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית המאפיינים טסיות מעודדות. פרוטוקול זה נועד להקל על ההכנה הראשונית של פלזמה עשירה בטסיות ובידוד של טסיות שטופות. לבסוף, חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מכומתים על-ידי ציטומטריית זרימה, מה שמאפשר זיהוי של טסיות דם מעודדות-קרישה.

Introduction

היווצרות מעודדי קרישה של טסיות הדם חיונית לשמירה על המוסטזיס ^1,2,3. תהליך זה כרוך ביטוי אגוניסטי המושרה של פוספוליפידים על קרום טסיות הדם, אשר חיוני להרכבה של מתחמי טנאז ו prothrombinase ^1,3,4. לאחר הפעלת טסיות, microvesicles טסיות משוחררים ברציפות ^5,6. מיקרו-שלפוחיות (בקוטר 50 ננומטר עד יותר מ-1 מיקרומטר) עוטפות הן את מבנה הממברנה והן את המרכיבים הציטופלזמיים של התאים המקוריים ^7,8. מיקרובסיקלים הם מתווכים חשובים של איתות בין-תאי ^9,10 וגם מאגרים של גורמי גדילה המקדמים ריפוי פצעים ומודולציה דלקתית^11,12. כמו כן, הוצע כי מיקרו-שלפוחיות הן פי 50 עד פי 100 יותר פרוקו-קרישה מאשר טסיות דם פעילות¹³. יש לציין כי עדויות עדכניות מצביעות על כך שטסיות הדם המאוחסנות מופעלות, מה שמוביל לייצור מיקרובועיות - יש לכך השלכות פוטנציאליות על הפרקטיקה של טיפול בעירוי טסיות. משך האחסון הממושך של המיקרו-שלפוחיות והפעילות המוגברת של גורמי הקרישה הופכים אותן לתחליף מבטיח לטסיות הדם ביישומי עירוי¹⁴.

חידושים מתודולוגיים נעשו כדי, במישרין ובעקיפין, להעריך היווצרות מעודדי קרישה של טסיות דם הן במצבי בריאות והן במצבי מחלה ^4,14,15. הערכות של חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות באמצעות טסיות מטוהרות סיפקו נתונים חדשים על האופן שבו תגובות מעודדות קרישה של טסיות הדם מוטרדות במחלות אנושיות מגוונות ^1,4. תחום מחקר הולך וגדל זה פותח גם אפיקים להתערבויות טיפוליות ^1,4. עם זאת, בידוד וניתוח של טסיות מטוהרות מדם גוזלים זמן, דורשים ציוד מעבדה מיוחד, ולכן אינם ניתנים כיום להתאמה לאבחון קליני שגרתי^16,17. ניתוח החשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מאתגר גם בשל גודלם הקטן ומספר האירועים החיוביים לסמנים מעניינים^18,19.

ציטומטריית זרימה, הממנפת קשירת Annexin-V פלואורסצנטית, הייתה אבן פינה בהערכת ביטוי PS על טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות מאז הקמתה לפני שני עשורים²⁰. זה זכה להסכמה נרחבת בבדיקה של טסיות דם מעודדות ו microvesicles^21,22. לכן, מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי שניתן להשתמש בו לבידוד טסיות מטוהרות מדגימות דם בטכניקה שפותחה על ידי קבוצת^{Cazenave 23}, ואפיון עוקב של חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית על ידי ציטומטריית זרימה לאחר הפעלת טסיות²⁴. פרוטוקול זה יאפשר מחקר נוסף ואפיון מעמיק של טסיות דם מעודדות קרישה באוכלוסיות קליניות מעניינות.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי של בורדו למחקר אנושי. דגימות דם נלקחו ממתנדבים בריאים שנתנו הסכמה מדעת, ודגימות אלה עובדו על פי פרוטוקולים מוסדיים. תורמים שנטלו חומרים שעלולים להשפיע על תפקוד טסיות הדם לא נכללו אם חומרים כאלה נלקחו בתוך 10 ימים שקדמו לניסויים. הסכמה מדעת התקבלה ממתנדבים בריאים לאסוף את דמם ולפרסם את נתונם. פרטי הריאגנטים והציוד בו נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. איסוף דם והכנת טסיות שטף

1. יש לאסוף דם ורידי היקפי בצינורות איסוף המכילים את נוגד הקרישה הפעיל Tri-sodium Citrate עם חומצת לימון ודקסטרוז (ACD) לאחר השלכת 3 מ"ל הראשונים.
2. לאחר האיסוף, הפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב את הדם עם ACD ולאפשר לתערובת לנוח בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לפני הצנטריפוגה.
3. ספירת טסיות באמצעות מונה תאים אוטומטי לפני הצנטריפוגה כדי לקבוע את המהירות הנכונה לצנטריפוגה (טבלה 1). הכן פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) על ידי צנטריפוגה במהירות של 250 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) מבלי להפעיל את הבלם כדי לייעל את התאוששות טסיות הדם.
   הערה: שלב זה ייצור שלוש שכבות בדגימה: השכבה העליונה המכילה פלזמה, טסיות דם וחלק קטן של תאי דם לבנים; שכבה אמצעית מועשרת בתאי דם לבנים; ושכבה תחתונה המורכבת מתאי דם אדומים. בזהירות להעביר את PRP מן השכבה העליונה לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל כדי למנוע זיהום עם תאי דם אדומים ולבנים.
4. ל- PRP, הוסף 1 מ"ל של ACD-A (ראה טבלה 2) ו- 6.25 מיקרוליטר של אפיראז לכל 9 מ"ל.
   הערה: אפיראז, בריכוז של 0.02 U/mL, מפרק עקבות של ATP או ADP המופרשים על ידי טסיות הדם, ובכך מונע דה-סנסיטיזציה של קולטני ADP טסיות ושומר על צורת טסיות²⁵. מעכב prostacyclin PGI2 (0.5 μM) יכול גם להיכלל עם apyrase כדי למנוע הפעלת טסיות.
5. מכינים את גלולת הטסיות על ידי צנטריפוגה ב RT ב 1100 x גרם במשך 10 דקות. יש לשאוף את הסופרנאטנט המכיל Platelet Poor Plasma (PPP) בשיטה עדינה, כגון פיפטת פסטר, ולהשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של חיץ כביסה (ראו טבלה 3 וטבלה 4). הומוגניזציה עדינה עם פיפטה, ולאחר מכן להוסיף 3-4 מ"ל נוספים של חיץ כביסה.
   הערה: רמת הסידן מופחתת כדי למנוע קרישה עם גורמי קריש הנמצאים בפלזמה. בשלב זה, הפלזמה הענייה בטסיות הוסרה לחלוטין, מה שמונע היווצרות קריש דם והפעלת טסיות על ידי ייצור טרומבין.
6. צנטריפוגה שוב ב RT ב 1100 x גרם במשך 10 דקות. שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של חיץ כביסה. העבר 150 μL של מתלה טסיות הדם לצינור 1.5 מ"ל לספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן, להשעות מחדש את הגלולה עם 3-4 מ"ל של חיץ כביסה.
7. בצע צנטריפוגה סופית ב 1100 x גרם במשך 10 דקות (ב RT). יש לשאוף את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את גלולת הטסיות בנפח של חיץ תגובה (ראה טבלה 5 וטבלה 6) כדי להגיע לריכוז סופי של 5 x 10¹¹ טסיות/L.
8. הניחו לטסיות השטופות לנוח לפחות 30 דקות לפני הניסויים כדי לאפשר לשאריות המעכבים להתפוגג ולטסיות להתאקלם לחיץ.

2. הכנת הבדיקה

1. הכינו את כל האגוניסטים והפלואורוכרומים במאגר התגובה. הוסף 5 μL של טרומבין ל 45 μL של חיץ (דילול 1: 10) ו 5 μL של יונופור ל 495 μL של חיץ (דילול 1:500).
   1. עבור בדיקות פנימיות, יש להשוות טסיות לא פעילות לעומת אלו שטופלו באגוניסטים בודדים וכפולים. הוסיפו, באליציטוטים שונים, 100 μL של טסיות שטופות ב 50 x 10⁹ טסיות / L אל: (i) 10 μL של חיץ תגובה, (ii) 3 μL של קולגן לא מדולל (ריכוז סופי של 30 מיקרוגרם / מ"ל), (iii) 10 μL של תרומבין מדולל מראש (0.5 IU / mL), (iv) 3 μL של קולגן לא מדולל + 10 μL של טרומבין מדולל מראש, ו (v) 10 μL של יונופור מדולל מראש (ריכוז סופי של 2 μM), אשר ידוע כמעלה באופן ישיר את רמות הסידן התוך-תאי כפי שצוין קודם לכן²⁶.
      הערה: טיפול ביונופור סידן, כגון A23187 או יונומיצין, הוא קריטי מכיוון שהוא גורם לערבול נרחב של קרום פוספוליפידים ולהחצנת PS משופרת.
   2. יש לנער בעדינות כל aliquot ביד ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות.
      הערה: דגירה אגוניסטית ארוכה יותר (30 דקות) עשויה לאפשר הבחנה טובה יותר בין אוכלוסיות טסיות במהלך תהליך ניתוח ציטומטריית הזרימה.
2. הוסף 5 μL של Annexin-V FITC לא מדולל לכל מיקרו-צינור ודגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך.
   הערה: נוגדן חד שבטי נגד אחד הקולטנים הספציפיים לטסיות, GPIX (CD42b) או אינטגרין αIIb (CD41, GPIIb), יכול להיכלל גם כדי לזהות טוב יותר תאי טסיות.
3. הוסף 500 μL של מאגר תגובה כדי לעצור את התהליך ולהמשיך בניתוח הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה.

3. אפיון טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות מעודדות על ידי ציטומטריית זרימה (FC)

הערה: לניתוח אמין של תפקוד טסיות הדם, השתמש במכשיר ציטומטריית זרימה (FC) המוגדר בהתאם לתקנים^{שנקבעו 27}. המכשיר חייב להיות מסוגל לזהות פיזור קדמי (FSC) ולפחות אות פלואורסצנטי אחד. הגדר את גלאי פיזור האור והפלואורסצנטיות לרווח לוגריתמי. דלל את הדגימות בהתאם ל- FC כדי להבטיח שרק טסיות בודדות נספרות במהירות איסוף נתונים מופחתת.

1. הגדר את ציטומטר הזרימה לקצב זרימה 'איטי' עם סף של לפחות 10,000 אירועי טסיות. נטר פליטת פלואורסצנטיות באמצעות מסנן מעבר עבור FITC.
2. שער אוכלוסיית הטסיות באמצעות פיזור קדמי (FSC). לבחון טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות משוחררות בהתאם לגודלן. השתמש בחלקות צפיפות כדי לזהות טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות משוחררות הן לטסיות מנוחה והן לטסיות מגורות; לנתח כל אוכלוסייה מגודרת באופן עצמאי.
3. להבחין טסיות מעודדות קרישה על פי ציר FL1. מקם את החתך השלילי בקצה הימני של אוכלוסיית הטסיות במצב מנוחה (כלומר, בנוכחות חיץ תגובה). לאחר הפעלת טסיות, יש לסווג את כל האירועים הממוקמים מימין לחתך זה כטסיות החושפות פוספטידיל-סרין.
4. להבדיל microvesicles, להיות קטן יותר טסיות, על ידי תכונות פיזור האור הייחודי שלהם. הגדר את החתך בערך FSC הנמוך ביותר שנצפה באוכלוסיית טסיות המנוחה. לאחר ההפעלה, יש לסווג אירועים חיוביים לפוספטידיל-סרין הנמצאים מתחת לסף זה כמיקרו-שלפוחיות.
   הערה: קח בחשבון את השונות האינדיבידואלית בגודל טסיות הדם על-ידי התאמת החיתוך במידת הצורך. ודא כי פחות מ 1% של microvesicles נמצאים במצב מנוחה.

תוצאות

כימות של טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות מעודדות מושג באמצעות צביעת Annexin-V, עם לפחות 50,000 אירועים שתועדו בכל דגימה. כפי שצוין בשלב 2.2, מדידות טסיות בסיסיות נלקחו מדגימות מודגרות עם חיץ תגובה, כפי שמתואר באיור 1A. גודל טסיות הדם נמדד באמצעות ערך הפיזור הקדמי החציוני (...

Discussion

מחקרים אחרונים על טסיות דם מעודדות קרישה הדגישו את השינויים שלהם במהלך מספר מחלות ^1,28,29, והדגישו את חשיבות הניתוח והאפיון המפורט שלהם 30,31,32. בעוד שהבדיקות הקליניות הנוכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(CD42b, GPIX) APC	Beckman Coulter	B13980
ACD-A blood collection tubes	BD Vacutainer	366645
Annexin-V FITC	BD Pharmingen	560931
Apyrase Grade VII	Sigma-Aldrich	A6410
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma-Aldrich	A9576
CaCl2, 0.25M	Sigma-Aldrich	C3881
Citric acid monohydrate	Merck	5949-29-1
Collagen	Stago	86924
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
Ionophore	Calbiochem/VWR	100105
KCl	Merck	7447-40-7
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
NaCl	VWR	27810.295
NaOH	Merck	1.06498
Sodium hydrogen carbonate	Merck	6329	NaHCO3
Thrombin	Hyphen Biomed	EZ 006 A
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	G8270	Na3C6H5O7*2H2O
αIIb integrin (CD41, GPIIb) PC7	Beckman Coulter	6607115