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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La formation de plaquettes procoagulantes a été corrélée à un risque accru de thrombose. Voici un protocole précis d’isolement des plaquettes lavées du sang humain, destiné à quantifier l’exposition à la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules, qui sont des caractéristiques distinctives des plaquettes procoagulantes.

Résumé

Les plaquettes activées favorisent la coagulation principalement en exposant le procoagulant phospholipide phosphatidylsérine (PS) sur les surfaces externes de leur membrane et en libérant des microvésicules exprimant le PS qui conservent l’architecture membranaire d’origine et les composants cytoplasmiques de leurs cellules d’origine. L’accessibilité de la phosphatidylsérine facilite la liaison des principaux facteurs de coagulation, amplifiant considérablement l’efficacité catalytique des enzymes de coagulation, tandis que la libération de microvésicules agit comme un médiateur essentiel de la signalisation intercellulaire. Les plaquettes procoagulantes jouent un rôle crucial dans la stabilisation des caillots pendant l’hémostase, et leur proportion accrue dans la circulation sanguine est corrélée à un risque accru de thrombose. Il a également été démontré que les microvésicules plaquettaires sont riches en facteurs de croissance qui favorisent la cicatrisation des plaies et la modulation inflammatoire. L’analyse de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules à l’aide de la cytométrie en flux pose des défis importants en raison de leur petite taille et du nombre limité d’événements positifs pour les marqueurs d’intérêt. Malgré des progrès considérables au cours de la dernière décennie, les méthodes d’évaluation de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules restent en cours de développement. Malheureusement, il n’existe pas de protocole unique universellement applicable, et plusieurs facteurs doivent être évalués pour déterminer la méthodologie la plus appropriée pour chaque application spécifique. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour isoler les plaquettes lavées du sang humain, suivi de l’activation du collagène et/ou de la thrombine, afin de mesurer l’exposition à la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules qui caractérisent les plaquettes procoagulantes. Ce protocole est conçu pour faciliter la préparation initiale du plasma riche en plaquettes et l’isolement des plaquettes lavées. Enfin, l’exposition à la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules sont quantifiées par cytométrie en flux, permettant l’identification des plaquettes procoagulantes.

Introduction

La formation de procoagulant plaquettaire est cruciale pour maintenir l’hémostase 1,2,3. Ce processus implique l’expression induite par agoniste des phospholipides sur la membrane plaquettaire, ce qui est essentiel pour l’assemblage des complexes ténase et prothrombinase 1,3,4. Après l’activation plaquettaire, les microvésicules plaquettaires sont également libérées en continu 5,6. Les microvésicules (de 50 nm à plus de 1 μm de diamètre) encapsulent à la fois la structure membranaire et les constituants cytoplasmiques des cellules d’origine 7,8. Les microvésicules sont des médiateurs importants de la signalisation intercellulaire 9,10 et sont également dépositaires de facteurs de croissance qui favorisent la cicatrisation des plaies et la modulation inflammatoire11,12. Il a également été suggéré que les microvésicules étaient 50 à 100 fois plus procoagulantes que les plaquettes activées13. Notamment, des preuves récentes suggèrent que les plaquettes stockées s’activent, ce qui entraîne la production de microvésicules, ce qui a des ramifications potentielles pour la pratique de la thérapie par transfusion de plaquettes. La durée de conservation prolongée des microvésicules et l’activité procoagulante accrue en font un substitut prometteur aux plaquettes dans les applications de transfusion14.

Des innovations méthodologiques ont été apportées pour, directement et indirectement, évaluer la formation de procoagulants plaquettaires dans des conditions de santé et de maladie 4,14,15. L’évaluation de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules à l’aide de plaquettes purifiées a fourni de nouvelles données sur la façon dont les réponses procoagulantes plaquettaires sont perturbées dans diverses maladies humaines 1,4. Ce domaine de recherche en pleine croissance ouvre également des avenues pour des interventions thérapeutiques 1,4. Cependant, l’isolement et l’analyse des plaquettes purifiées du sang prennent du temps, nécessitent de l’équipement de laboratoire spécialisé et ne sont donc pas adaptables actuellement aux diagnostics cliniques de routine16,17. L’analyse de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules est également difficile en raison de leur petite taille et du nombre d’événements positifs pour les marqueurs d’intérêt18,19.

La cytométrie en flux, qui s’appuie sur la liaison fluorescente de l’annexine-V, a été la pierre angulaire de l’évaluation de l’expression de la PS sur les plaquettes et les microvésicules depuis sacréation il y a deux décennies. Il a été largement accepté dans l’examen des plaquettes et des microvésicules procoagulantes21,22. Par conséquent, un protocole optimisé est présenté ici qui peut être utilisé pour l’isolement des plaquettes purifiées à partir d’échantillons de sang à l’aide de la technique développée par le groupe23 de Cazenave, et la caractérisation ultérieure de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules par cytométrie en flux après activation plaquettaire24. Ce protocole facilitera l’étude plus poussée et la caractérisation approfondie des plaquettes procoagulantes dans les populations cliniques d’intérêt.

Protocole

Le protocole suit les lignes directrices et a été approuvé par la Commission d’éthique de la recherche humaine du CHU de Bordeaux. Des échantillons de sang ont été prélevés sur des volontaires en bonne santé qui ont donné leur consentement éclairé, et ces échantillons ont été traités conformément aux protocoles de l’établissement. Les donneurs qui avaient pris des substances susceptibles d’affecter la fonction plaquettaire ont été exclus si ces substances avaient été prises dans les 10 jours précédant les expériences. Le consentement éclairé a été obtenu auprès de volontaires en bonne santé pour prélever leur sang et publier leurs données. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Prélèvement sanguin et préparation des plaquettes lavées

  1. Prélever le sang veineux périphérique dans des tubes de prélèvement contenant l’anticoagulant actif citrate trisodique avec acide citrique et dextrose (ACD) après avoir jeté les 3 premiers mL.
  2. Après le prélèvement, retournez doucement le tube pour mélanger le sang avec l’ACD et laissez reposer le mélange à température ambiante pendant 15 min avant la centrifugation.
  3. Compter les plaquettes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé avant la centrifugation afin de déterminer la vitesse correcte de centrifugation (tableau 1). Préparez du plasma riche en plaquettes (PRP) par centrifugation à 250 x g pendant 10 min à température ambiante (RT) sans appliquer le frein pour optimiser la récupération plaquettaire.
    REMARQUE : Cette étape produira trois couches dans l’échantillon : la couche supérieure contenant du plasma, des plaquettes et une petite fraction de globules blancs ; une couche intermédiaire enrichie en globules blancs ; et une couche inférieure composée de globules rouges. Transférez soigneusement le PRP de la couche supérieure dans un nouveau tube conique de 50 ml pour éviter la contamination par des globules rouges et blancs.
  4. Au PRP, ajouter 1 mL d’ACD-A (voir le tableau 2) et 6,25 μL d’apyrase par 9 mL.
    REMARQUE : L’apyrase, à une concentration de 0,02 U/mL, dégrade les traces d’ATP ou d’ADP sécrétées par les plaquettes, empêchant ainsi la désensibilisation des récepteurs plaquettaires de l’ADP et maintenant la forme des plaquettes25. Un inhibiteur de la prostacycline PGI2 (0,5 μM) peut également être inclus avec l’apyrase pour prévenir l’activation plaquettaire.
  5. Préparez la pastille de plaquettes par centrifugation à RT à 1100 x g pendant 10 min. Aspirer le surnageant contenant du plasma pauvre en plaquettes (PPP) à l’aide d’une méthode douce, telle qu’une pipette Pasteur, et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de lavage (voir tableau 3 et tableau 4). Homogénéiser doucement à l’aide d’une pipette, puis ajouter 3 à 4 ml supplémentaires de tampon de lavage.
    REMARQUE : Le taux de calcium est réduit pour empêcher la coagulation avec des facteurs de caillot présents dans le plasma. À ce stade, le plasma pauvre en plaquettes a été complètement éliminé, empêchant la formation de caillots et l’activation plaquettaire par la production de thrombine.
  6. Centrifuger à nouveau à RT à 1100 x g pendant 10 min. Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de lavage. Transférez 150 μL de la suspension plaquettaire dans un tube de 1,5 mL pour le comptage des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Ensuite, remettez le granulé en suspension avec 3-4 mL de tampon de lavage.
  7. Effectuer une centrifugation finale à 1100 x g pendant 10 min (à RT). Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille plaquettaire dans un volume de tampon réactionnel (voir tableau 5 et tableau 6) pour obtenir une concentration finale de 5 x 1011 plaquettes/L.
  8. Laissez les plaquettes lavées reposer pendant au moins 30 minutes avant les expériences pour permettre aux inhibiteurs résiduels de s’estomper et aux plaquettes de s’acclimater au tampon.

2. Préparation du dosage

  1. Préparez tous les agonistes et fluorochromes dans le tampon de réaction. Ajouter 5 μL de thrombine à 45 μL de tampon (dilution 1:10) et 5 μL d’ionophore à 495 μL de tampon (dilution 1:500).
    1. Pour les tests internes, comparez les plaquettes non activées à celles traitées avec des agonistes simples et doubles. Ajouter, dans différentes aliquotes, 100 μL de plaquettes lavées à 50 x 109 plaquettes/L à : (i) 10 μL de tampon de réaction, (ii) 3 μL de collagène non dilué (concentration finale de 30 μg/mL), (iii) 10 μL de thrombine pré-diluée (0,5 UI/mL), (iv) 3 μL de collagène non dilué + 10 μL de thrombine pré-diluée, et (v) 10 μL d’ionophore pré-dilué (concentration finale de 2 μM), qui est connu pour augmenter directement les niveaux de calcium intracellulaire, comme indiqué précédemment26.
      REMARQUE : Le traitement avec un ionophore de calcium, tel que A23187 ou ionomycine, est essentiel car il induit un brouillage important de la membrane phospholipidique et une externalisation accrue de la PS.
    2. Agitez doucement chaque aliquote à la main et incubez à 37 °C pendant 5 min.
      REMARQUE : Une incubation plus longue des agonistes (30 min) peut permettre une meilleure différenciation entre les populations de plaquettes pendant le processus d’analyse par cytométrie en flux.
  2. Ajouter 5 μL d’Annexin-V FITC non dilué dans chaque microtube et incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.
    REMARQUE : Un anticorps monoclonal dirigé contre l’un des récepteurs plaquettaires spécifiques, GPIX (CD42b) ou l’intégrine αIIb (CD41, GPIIb), pourrait également être inclus pour mieux identifier les cellules plaquettaires.
  3. Ajouter 500 μL de tampon de réaction pour arrêter le processus et procéder à l’analyse de l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux.

3. Caractérisation des plaquettes et microvésicules procoagulantes par cytométrie en flux (FC)

REMARQUE : Pour une analyse fiable de la fonction plaquettaire, utilisez un instrument de cytométrie en flux (FC) configuré conformément aux normes établies27. L’instrument doit être capable de détecter la diffusion directe (FSC) et au moins un signal de fluorescence. Réglez les détecteurs de diffusion de la lumière et de fluorescence sur le gain logarithmique. Diluez les échantillons de manière appropriée pour la FC afin de vous assurer que seules les plaquettes individuelles sont comptées à une vitesse d’acquisition de données réduite.

  1. Réglez le cytomètre en flux sur un débit « lent » avec un seuil d’au moins 10 000 événements plaquettaires. Surveillez l’émission de fluorescence à l’aide d’un filtre passe-passe pour FITC.
  2. Gate la population plaquettaire à l’aide de la diffusion vers l’avant (FSC). Examinez les plaquettes et les microvésicules libérées en fonction de leur taille. Utilisez des diagrammes de densité pour identifier les plaquettes et les microvésicules libérées pour les plaquettes au repos et stimulées ; Analysez chaque population fermée indépendamment.
  3. Distinguer les plaquettes procoagulantes selon l’axe FL1. Placez le seuil négatif à l’extrême droite de la population plaquettaire à l’état de repos (c’est-à-dire en présence d’un tampon de réaction). Après l’activation plaquettaire, classez tous les événements localisés à droite de cette coupure comme des plaquettes exposant la phosphatidylsérine.
  4. Différencier les microvésicules, plus petites que les plaquettes, par leurs caractéristiques uniques de diffusion de la lumière. Fixer le seuil à la valeur FSC la plus basse observée dans la population de plaquettes au repos. Après activation, classez tous les événements positifs à la phosphatidylsérine tombant en dessous de ce seuil comme des microvésicules.
    REMARQUE : Tenez compte des variations individuelles de la taille des plaquettes en ajustant la coupure si nécessaire. Assurez-vous que moins de 1 % des microvésicules sont présentes à l’état de repos.

Résultats

La quantification des plaquettes et des microvésicules procoagulantes est réalisée à l’aide de la coloration à l’Annexine-V, avec au moins 50 000 événements enregistrés par échantillon. Comme indiqué à l’étape 2.2, les mesures plaquettaires de base ont été prises à partir d’échantillons incubés avec un tampon de réaction, comme illustré à la figure 1A. La taille des plaquettes a été mesurée à l’aide de la valeur médiane de ...

Discussion

Des études récentes sur les plaquettes procoagulantes ont mis en évidence leurs modifications au cours de plusieurs maladies 1,28,29, soulignant l’importance de leur analyse détaillée et de leur caractérisation 30,31,32. Bien que les essais cliniques actuels pour évaluer la formation de procoag...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Aucun.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A blood collection tubesBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Bovine Serum Albumin 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Citric acid monohydrateMerck5949-29-1
Collagen Stago86924
Glucose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionophore Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Sodium hydrogen carbonateMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
Trisodium citrate dihydrate Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
αIIb integrin (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

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