Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

Resumo

A formação de plaquetas pró-coagulantes tem sido correlacionada com um risco aumentado de trombose. Apresenta-se aqui um protocolo preciso para isolar plaquetas lavadas do sangue humano, destinado a quantificar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas, que são características distintivas das plaquetas pró-coagulantes.

Resumo

As plaquetas ativadas promovem a coagulação principalmente expondo o fosfolipídio pró-coagulante fosfatidilserina (PS) em suas superfícies externas de membrana e liberando microvesículas que expressam PS que retêm a arquitetura original da membrana e os componentes citoplasmáticos de suas células de origem. A acessibilidade da fosfatidilserina facilita a ligação dos principais fatores de coagulação, amplificando significativamente a eficiência catalítica das enzimas de coagulação, enquanto a liberação de microvesículas atua como um mediador fundamental da sinalização intercelular. As plaquetas pró-coagulantes desempenham um papel crucial na estabilização do coágulo durante a hemostasia, e sua proporção aumentada na corrente sanguínea se correlaciona com um risco aumentado de trombose. Também foi demonstrado que as microvesículas plaquetárias são ricas em fatores de crescimento que promovem a cicatrização de feridas e a modulação inflamatória. A análise da exposição à fosfatidilserina e da liberação de microvesículas por citometria de fluxo apresenta desafios significativos devido ao seu pequeno tamanho e ao número limitado de eventos positivos para marcadores de interesse. Apesar dos avanços consideráveis na última década, os métodos para avaliar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas continuam sendo um trabalho em andamento. Infelizmente, não existe um protocolo único universalmente aplicável, e vários fatores devem ser avaliados para determinar a metodologia mais apropriada para cada aplicação específica. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolamento de plaquetas lavadas do sangue humano, seguido de ativação de colágeno e/ou trombina, para medir a exposição da liberação de fosfatidilserina e microvesículas que caracterizam as plaquetas pró-coagulantes. Este protocolo foi desenvolvido para facilitar a preparação inicial do plasma rico em plaquetas e o isolamento das plaquetas lavadas. Finalmente, a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas são quantificadas por citometria de fluxo, permitindo a identificação de plaquetas pró-coagulantes.

Introdução

A formação de pró-coagulante plaquetário é crucial para manter a hemostasia ^1,2,3. Esse processo envolve a expressão de fosfolipídios induzida por agonistas na membrana plaquetária, o que é essencial para a montagem de complexos de tenase e protrombinase ^1,3,4. Após a ativação plaquetária, as microvesículas plaquetárias também são liberadas continuamente ^5,6. Microvesículas (50 nm a mais de 1 μm de diâmetro) encapsulam tanto a estrutura da membrana quanto os constituintes citoplasmáticos das células originárias ^7,8. As microvesículas são importantes mediadores da sinalização intercelular ^9,10 e também repositórios de fatores de crescimento que promovem a cicatrização de feridas e a modulação inflamatória^11,12. As microvesículas também foram sugeridas como sendo 50 a 100 vezes mais pró-coagulantes do que as plaquetas ativadas¹³. Notavelmente, evidências recentes sugerem que as plaquetas armazenadas são ativadas, levando à produção de microvesículas - isso tem ramificações potenciais para a prática da terapia transfusional de plaquetas. A duração prolongada do armazenamento das microvesículas e a atividade pró-coagulante aumentada as tornam um substituto promissor para as plaquetas em aplicações^{transfusionais 14}.

Inovações metodológicas têm sido feitas para, direta e indiretamente, avaliar a formação de pró-coagulantes plaquetários em condições de saúde e doença ^4,14,15. Avaliações da exposição à fosfatidilserina e liberação de microvesículas usando plaquetas purificadas forneceram novos dados sobre como as respostas pró-coagulantes plaquetárias são perturbadas em diversas doenças humanas ^1,4. Esse crescente campo de pesquisa também abre caminhos para intervenções terapêuticas ^1,4. No entanto, o isolamento e a análise de plaquetas purificadas do sangue são demorados, requerem equipamentos laboratoriais especializados e, portanto, não são atualmente adaptáveis para diagnósticos clínicos de rotina^16,17. A análise da exposição à fosfatidilserina e da liberação de microvesículas também é desafiadora devido ao seu pequeno tamanho e ao número de eventos positivos para marcadores de interesse^18,19.

A citometria de fluxo, aproveitando a ligação fluorescente da Anexina-V, tem sido uma pedra angular na avaliação da expressão de PS em plaquetas e microvesículas desde sua criação, há duas décadas²⁰. Ganhou ampla aceitação no exame de plaquetas e microvesículas pró-coagulantes^21,22. Portanto, é apresentado aqui um protocolo otimizado que pode ser utilizado para o isolamento de plaquetas purificadas de amostras de sangue utilizando a técnica desenvolvida pelo grupo de Cazenave23, e a posterior caracterização da exposição à fosfatidilserina e liberação de microvesículas por citometria de fluxo após ativação plaquetária24. Este protocolo facilitará um estudo mais aprofundado e a caracterização aprofundada de plaquetas pró-coagulantes em populações clínicas de interesse.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do Hospital Universitário de Bordeaux. Amostras de sangue foram obtidas de voluntários saudáveis que forneceram consentimento informado, e essas amostras foram processadas de acordo com protocolos institucionais. Os doadores que haviam tomado quaisquer substâncias que pudessem afetar a função plaquetária foram excluídos se tais substâncias fossem tomadas nos 10 dias anteriores aos experimentos. O consentimento informado foi obtido de voluntários saudáveis para coletar seu sangue e publicar seus dados. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coleta de sangue e preparação de plaquetas lavadas

1. Colete sangue venoso periférico em tubos de coleta contendo o anticoagulante ativo Citrato Trissódico com Ácido Cítrico e Dextrose (ACD) após descartar os primeiros 3 mL.
2. Após a coleta, inverta suavemente o tubo para misturar o sangue com a DAC e deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 15 minutos antes da centrifugação.
3. Conte as plaquetas usando um contador de células automatizado antes da centrifugação para determinar a velocidade correta de centrifugação (Tabela 1). Prepare o plasma rico em plaquetas (PRP) por centrifugação a 250 x g por 10 min em temperatura ambiente (RT) sem aplicar o freio para otimizar a recuperação de plaquetas.
   NOTA: Esta etapa produzirá três camadas na amostra: a camada superior contendo plasma, plaquetas e uma pequena fração de glóbulos brancos; uma camada intermediária enriquecida com glóbulos brancos; e uma camada inferior composta por glóbulos vermelhos. Transfira cuidadosamente o PRP da camada superior para um novo tubo cônico de 50 mL para evitar a contaminação com glóbulos vermelhos e brancos.
4. Ao PRP, adicione 1 mL de ACD-A (ver Tabela 2) e 6,25 μL de apirase por 9 mL.
   NOTA: A apirase, na concentração de 0,02 U/mL, degrada traços de ATP ou ADP secretados pelas plaquetas, impedindo a dessensibilização dos receptores de ADP plaquetários e mantendo a forma plaquetária²⁵. Um inibidor da prostaciclina PGI2 (0.5 μM) também pode ser incluído com a apirase para prevenir a ativação plaquetária.
5. Preparar o sedimento de plaquetas por centrifugação a RT a 1100 x g durante 10 min. Aspire o sobrenadante contendo Plasma Pobre em Plaquetas (PPP) usando um método suave, como uma pipeta de Pasteur, e ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão de lavagem (ver Tabela 3 e Tabela 4). Homogeneizar suavemente com uma pipeta e, em seguida, adicionar mais 3-4 mL de tampão de lavagem.
   NOTA: O nível de cálcio é reduzido para evitar a coagulação com os fatores de coágulo presentes no plasma. Nesse estágio, o plasma pobre em plaquetas foi completamente removido, impedindo a formação de coágulos e a ativação plaquetária pela produção de trombina.
6. Centrifugue novamente em RT a 1100 x g por 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de lavagem. Transfira 150 μL da suspensão plaquetária para um tubo de 1,5 mL para contagem de células usando um contador de células automatizado. Em seguida, ressuspenda o pellet com 3-4 mL de tampão de lavagem.
7. Efectuar uma centrifugação final a 1100 x g durante 10 min (a RT). Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de plaquetas num volume de tampão de reacção (ver quadro 5 e quadro 6) para atingir uma concentração final de 5 x 10¹¹ plaquetas/l.
8. Deixe as plaquetas lavadas descansarem por pelo menos 30 minutos antes dos experimentos para permitir que os inibidores residuais se desgastem e para que as plaquetas se aclimatem ao tampão.

2. Preparação do ensaio

1. Prepare todos os agonistas e fluorocromos no tampão de reação. Adicione 5 μL de trombina a 45 μL de tampão (diluição 1:10) e 5 μL de ionóforo a 495 μL de tampão (diluição 1:500).
   1. Para ensaios internos, compare as plaquetas não ativadas com aquelas tratadas com agonistas únicos e duplos. Adicionar, em diferentes alíquotas, 100 μL de plaquetas lavadas a 50 x 10⁹ plaquetas/L a: i) 10 μL de tampão de reação, ii) 3 μL de colagénio não diluído (concentração final de 30 μg/ml), iii) 10 μL de trombina pré-diluída (0,5 UI/ml), iv) 3 μL de colagénio não diluído + 10 μL de trombina pré-diluída e v) 10 μL de ionóforo pré-diluído (concentração final de 2 μM), que é conhecido por aumentar diretamente os níveis de cálcio intracelular, como observado anteriormente²⁶.
      NOTA: O tratamento com um ionóforo de cálcio, como A23187 ou ionomicina, é crítico, pois induz uma extensa embaralhamento da membrana fosfolipídica e maior externalização do PS.
   2. Agitar suavemente cada alíquota com a mão e incubar a 37 °C durante 5 min.
      NOTA: Uma incubação de agonistas mais longa (30 min) pode permitir uma melhor diferenciação entre as populações de plaquetas durante o processo de análise por citometria de fluxo.
2. Adicione 5 μL de Annexin-V FITC não diluído a cada microtubo e incube em temperatura ambiente por 10 min no escuro.
   NOTA: Um anticorpo monoclonal contra um dos receptores específicos de plaquetas, GPIX (CD42b) ou integrina αIIb (CD41, GPIIb), também pode ser incluído para identificar melhor as células plaquetárias.
3. Adicionar 500 μL de tampão de reacção para interromper o processo e proceder à análise da amostra utilizando um citómetro de fluxo.

3. Caracterização de plaquetas e microvesículas pró-coagulantes por citometria de fluxo (FC)

NOTA: Para uma análise confiável da função plaquetária, utilize um instrumento de citometria de fluxo (FC) configurado de acordo com os padrões estabelecidos²⁷. O instrumento deve ser capaz de detectar dispersão direta (FSC) e pelo menos um sinal de fluorescência. Defina os detectores de dispersão de luz e fluorescência para ganho logarítmico. Dilua as amostras adequadamente para FC para garantir que apenas plaquetas individuais sejam contadas em uma velocidade reduzida de aquisição de dados.

1. Defina o citômetro de fluxo para uma taxa de fluxo 'lenta' com um limite de pelo menos 10.000 eventos plaquetários. Monitore a emissão de fluorescência usando um filtro de passagem para FITC.
2. Bloqueie a população de plaquetas usando dispersão direta (FSC). Examine as plaquetas e microvesículas liberadas de acordo com seus tamanhos. Use gráficos de densidade para identificar plaquetas e microvesículas liberadas para plaquetas em repouso e estimuladas; analise cada população fechada de forma independente.
3. Distinguir as plaquetas pró-coagulantes de acordo com o eixo FL1. Coloque o ponto de corte negativo na extremidade direita da população de plaquetas no estado de repouso (ou seja, na presença de tampão de reação). Após a ativação plaquetária, classifique todos os eventos localizados à direita desse ponto de corte como plaquetas expondo fosfatidilserina.
4. Diferenciar as microvesículas, sendo menores que as plaquetas, por suas características únicas de dispersão de luz. Defina o ponto de corte no valor mais baixo do FSC observado na população de plaquetas em repouso. Após a ativação, classifique quaisquer eventos positivos para fosfatidilserina abaixo desse limite como microvesículas.
   NOTA: Considere a variação individual no tamanho das plaquetas ajustando o ponto de corte, se necessário. Certifique-se de que menos de 1% das microvesículas estejam presentes no estado de repouso.

Resultados

A quantificação de plaquetas e microvesículas pró-coagulantes é obtida usando a coloração com Anexina-V, com pelo menos 50.000 eventos registrados por amostra. Conforme declarado na etapa 2.2, as medições plaquetárias basais foram obtidas de amostras incubadas com tampão de reação, conforme ilustrado na Figura 1A. Os tamanhos das plaquetas foram medidos usando o valor mediano de dispersão direta (FSC). Embora o FSC seja influenciado por vários...

Discussão

Estudos recentes sobre plaquetas pró-coagulantes têm destacado suas alterações durante várias doenças ^1,28,29, ressaltando a importância de sua análise e caracterização detalhadas 30,31,32. Embora os testes clínicos atuais para avaliar a formação de pró-coagulantes plaquetários sejam limi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(CD42b, GPIX) APC	Beckman Coulter	B13980
ACD-A blood collection tubes	BD Vacutainer	366645
Annexin-V FITC	BD Pharmingen	560931
Apyrase Grade VII	Sigma-Aldrich	A6410
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma-Aldrich	A9576
CaCl2, 0.25M	Sigma-Aldrich	C3881
Citric acid monohydrate	Merck	5949-29-1
Collagen	Stago	86924
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
Ionophore	Calbiochem/VWR	100105
KCl	Merck	7447-40-7
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
NaCl	VWR	27810.295
NaOH	Merck	1.06498
Sodium hydrogen carbonate	Merck	6329	NaHCO3
Thrombin	Hyphen Biomed	EZ 006 A
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	G8270	Na3C6H5O7*2H2O
αIIb integrin (CD41, GPIIb) PC7	Beckman Coulter	6607115